馬 寧，董曉燕，姜艷芳，劉蒙蒙，劉子玲

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院血液腫瘤科，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，吉林 長春 130021；3.河南省人民醫(yī)院血液病研究所，河南 鄭州 450000；4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部中心研究室，吉林 長春 130031）

白血病干細(xì)胞（leukemia stem cells，LSC）是最原始的白血病細(xì)胞群，與造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSC）一樣具有自我更新和增殖分化的能力，故此LSC是造成白血病發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和耐藥的根本原因［1］。Piwi基因是低等生物干細(xì)胞分裂的重要調(diào)控因子，參與核內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄后的修飾過程與干細(xì)胞自我更新的調(diào)控［2］。人的Hiwi基因是Piwi基因的同源物，其氨基酸序列與Piwi有52%的同源性［3］。Hiwi基因僅在骨髓CD34＋細(xì)胞中表達(dá)，而在間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞中則無表達(dá)。在對人造血系統(tǒng)的研究［4］中發(fā)現(xiàn)：Hiwi基因?qū)υ煅到y(tǒng)起著負(fù)向調(diào)節(jié)作用，在維持干細(xì)胞的靜止期或下調(diào)干／祖細(xì)胞的細(xì)胞周期中發(fā)揮作用，其表達(dá)與永生化的白血病細(xì)胞喪失增殖能力有關(guān)，過表達(dá)則導(dǎo)致白血病細(xì)胞的凋亡。本研究采用重疊延伸PCR方法擴(kuò)增Hiwi編碼區(qū)基因全長，并利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建

Hiwi重組腺病毒載體，以期為研究Hiwi誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞分化和凋亡的作用和機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 293細(xì)胞、pDonr221、TE buffer、HDMEM＋10%FBS、1×PBS及0.25%trypin－0.04%EDTA均為廣州賽業(yè)公司產(chǎn)品。Gateway○RBP ClonaseTMⅡEnzyme Mix和Gateway○RLR ClonaseTMⅡPlus Enzyme Mix購自美國Invitrogen公司，QIAquick Gel Extraction Kit購自德國QIAGen公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，dNTP Mix和GeneRulerTM1000bp DNA Ladder購自Fermentas公司，PrimeSTARTMHS DNA Polymerase購自日本Takara公司，PacⅠ酶為NEB公司產(chǎn)品，綠色熒光蛋白（GFP）單邊載體購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司。

1.2 重疊延伸PCR擴(kuò)增attB1－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP－attB2 以GenBank中Piwi－like1基因（BC028581.2）為模板，設(shè)計并合成以下引物。P1：5′－GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGACTGGGAGAGCCCGA－3′，P1r：5′－CATCCACTCTGTATGTCTTAATGTTATACTTGGTAAGAACAACTAAA－3′；P2：5′－AACATTAAGACATACAGAGTGGAT－3′，P2r：5′－GTATTGCTTCCTGTAGTATTCTAAGAAGCTGACCCCAGAGCCGTCGGCTTTCT－3′；P3：5′－CTGGGGTCAGCTTCTTAGAA－3′，P3r：5′－CAGCCAGTTATCTAGTGGCTTAACACTAATTAATGGTGCACC－3′；P4：5′－AGCCACTAGATAACTGGCTG－3′，P4r：5′－CTTCAATCATTATTGCTTTTCTCATTTGCATGCCCATGGCT－3′；P5：5′－ATGAGAAAAGCAATAATGATTGAAG－3′，P5r：5′－GGGCAATCTGTACACAGGTATTTTTTAATAGCATCGTATTTG－3′；P6：5′－TACCTGTGTACAGATTGCCC－3′，P6r：5′－GAGGTAGTAAAGGCGGTTTG－3′；P6r＋3×flag：5′－CAAACCGCCTTTACTACCTCGACTACAAGGATGACGATGAC－3′，attB2hrGFP：5′－GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACACCCACTCGTGCAGG－3′。

分別擴(kuò)增如下片段，并引入相應(yīng)的點突變：以P1＋P1r、P2＋P2r、P3＋P3r、P4＋P4r、P5＋P5r和P6＋P6r擴(kuò)增片段1～6；以含有IRES－h(huán)rGFP序列的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增如下片段：P6r－3×Flag＋attB2－h(huán)rGFP，F(xiàn)lag－IRES－h(huán)rGFP。然后將片段1～6和Flag－IRES－h(huán)rGFP進(jìn)行分段融合。PCR擴(kuò)增體系50μL，其中含5×Primer STARTM Buffer（Mg2＋Plus）10μL、dNTP Mixture（10μmol·L－1）4μL、引物（10μmol·L－1）2μL、模板DNA（10μg·L－1）1μL、Primer STARTMHS DNA Polymerase 0.5μL和ddH2O 33.5μL。擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s、60℃退火10s、72℃延伸5min，共30個循環(huán)。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

1.3 利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建pDown－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP 根據(jù)純化目的基因的濃度進(jìn)行5μL的反應(yīng)體系：PCR純化產(chǎn)物100ng、pDonr221100ng、BP clonase 1μL，加TE buffer至5μL，輕輕混勻，室溫（25℃）BP反應(yīng)3h。加入蛋白酶K終止反應(yīng)10min，然后轉(zhuǎn)化BP反應(yīng)產(chǎn)物到Stb13，菌落PCR篩選陽性克?。ㄒ飌Up／Do－flank－f：CGGCCAGTCTTAAGCTCGGG；pUp／Do－flank－r：AATACGACTCACTATAGGGGA），提取陽性克隆質(zhì)粒送廣州賽業(yè)生物有限公司進(jìn)行測序。

1.4 利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建pAV.Ex1d－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP 小量提取質(zhì)粒pDown－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP，與pAV.Des1d室溫（25℃）LR反應(yīng)3h，反應(yīng)體系：pDown－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP 5fmol、pAV.Des1d5fmol、LR clonase 1μL，加TE buffer至5μL。加入蛋白酶K終止反應(yīng)10min，轉(zhuǎn)化BP反應(yīng)產(chǎn)物到Stb13，菌落PCR篩選陽性克隆（引物pAVDes1d－flank－f：GAACCCACTGCTTACTGGCTT；pAV－Des1d－flank－r：TCGAGACCGAGGAGAGGGT），提取陽性克隆質(zhì)粒送廣州賽業(yè)生物有限公司進(jìn)行測序。

1.5 腺病毒Ad－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP包裝 PacⅠ酶切線性化腺病毒質(zhì)粒pAd－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP，并進(jìn)行回收；接種HEK293A細(xì)胞到6孔板內(nèi)（2×105cells／well），含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)至80%～90%融合度。轉(zhuǎn)染前換成1mL新鮮的含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基。取一支500μL EP管，加入Opti－MEM 250μL和DNA 1μg，輕輕顛倒混勻。另取一支500μL EP管，加入Opti－MEM 250μL和Lipofectine 3μL，輕輕顛倒混勻，孵育5min。將上述2管溶液混合，輕輕顛倒混勻，孵育20min。將混合液滴加到6孔板內(nèi)，輕微晃動混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜。24h后更換成DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS），7d后開始出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。收集粗毒。當(dāng)大部分細(xì)胞病變時，收集細(xì)胞和上清。37℃、－80℃反復(fù)凍融3次以裂解細(xì)胞、釋放病毒。4℃、2000g離心10min。將含有病毒的上清小量分裝，－80℃凍存。定義該初次包裝好的病毒代數(shù)為P0。

1.6 腺病毒Ad－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP大量擴(kuò)增和濃縮 接種HEK293A細(xì)胞到6瓶T75培養(yǎng)瓶，待生長至90%融合度時，換成新鮮培養(yǎng)液，每瓶加入100μL P0代病毒液，輕微晃動混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)2～3d后大部分細(xì)胞出現(xiàn)病變。收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，2000g離心10min。棄上清，細(xì)胞沉淀用無菌PBS重懸。37℃、－80℃反復(fù)凍融3次以裂解細(xì)胞、釋放病毒。4℃、2000g離心15min，將含有病毒的上清小量分裝，－80℃凍存，定義該批病毒代數(shù)為P1。

1.7 腺病毒滴度檢測 采用組織細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）法對腺病毒滴度進(jìn)行檢測：收集處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HEK293A細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋至1×105mL－1，96孔板每孔接種100μL上述細(xì)胞懸液（1×104個／孔）。10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。有限稀釋法稀釋病毒，從1×10－1～1×10－12，從最高稀釋度開始，按每個稀釋度0.1mL的量分別加入到接種有HEK293A細(xì)胞的96孔板的1～10號孔（1×10－12～1×10－5），最后2孔作為空白對照（加入DMEM培養(yǎng)基0.1mL）。37℃、5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10d。10d后在倒置顯微鏡下觀察各孔CPE現(xiàn)象。對于100μL樣品，病毒滴度為：T＝10s＋0.8PFU·mL－1，其中S＝陽性比率之和（從第1個稀釋度算起）。

2 結(jié) 果

2.1 重疊PCR擴(kuò)增attB1－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP－attB2產(chǎn)物回收 利用設(shè)計的特異性引物擴(kuò)增點突變后的Hiwi編碼區(qū)基因全長，取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見明顯的條帶，片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。見圖1。

2.2 Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建pDown－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP BP反應(yīng)構(gòu)建pDown－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP，菌落PCR篩選陽性克隆。見圖2。clone 2、4、5、6擴(kuò)增出約4000bp的目的條帶，片段大小與理論值相符，選取clone 4做后續(xù)實驗。送檢測序，結(jié)果顯示：基因片段的編碼區(qū)序列和GenBank中報道的序列完全一致。

2.3 Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建pAV.Ex1d－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP LR反應(yīng)構(gòu)建pDown－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP，菌落PCR篩選陽性克?。▓D3）。擴(kuò)增出約4000bp的目的條帶，片段大小與理論值相符。選取clone 4、6和7作后續(xù)實驗，送檢測序，結(jié)果顯示：基因片段的編碼區(qū)序列和GenBank中報道的序列完全一致。

2.4 腺病毒質(zhì)粒pAV.Ex1d－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP酶切鑒定 對菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PacⅠ酶切鑒定：腺病毒質(zhì)粒為38471bp，PacⅠ分別酶切出約2000和36000bp的2條片段。見圖4。

2.5 重組病毒子的獲得 鑒定正確的重組pAV.Ex1d－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP質(zhì)粒，經(jīng)PacⅠ酶切后轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，2～3d后在顯微鏡下可觀察到熒光（圖5，見插頁四）。7d后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融的重組病毒子經(jīng)多輪感染，低溫離心后將含有病毒的上清小量分裝，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 腺病毒滴度檢測 采TCID50法對腺病毒滴度進(jìn)行檢測，本實驗中腺病毒滴度約為3.98×1010PFU·mL－1。

圖1 重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoregram of overlap extention PCR product

圖2 菌落PCR篩選BP反應(yīng)陽性克隆Fig.2 Positive clones of BP reaction screened with bacterial colony PCR

圖3 菌落PCR篩選LR反應(yīng)陽性克隆Fig.3 Positive clones of LR reaction screened with bacterial colony PCR

圖4 腺病毒質(zhì)粒pAV.Ex1d－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP酶切分析Fig.4 Restriction enzyme digestion of pAV.Ex1d－Hiwi－3×flag－IRES－h(huán)rGFP

3 討 論

惡性腫瘤是危害人類健康最嚴(yán)重的疾病，近年來，隨著對腫瘤研究的深入，提出了腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cell，TSC）學(xué)說［3］，目前已在血液系統(tǒng)腫瘤、胃腸道腫瘤和乳腺腫瘤等多種腫瘤中證實TSC的存在。TSC具有干細(xì)胞樣自我更新、無限增殖及分化潛能，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥的決定性因素［5－6］。

LSC即是白血病的腫瘤干細(xì)胞，其與HSC一樣具有自我更新和增殖分化的能力，盡管與HSC特異受體相互作用的許多外界信號已經(jīng)被識別，但對支配HSC及LSC自我更新的信號機制研究甚少，因此關(guān)于LSC的分子調(diào)控機制成為研究的熱點之一。

Lin等［2］于1997年首先在果蠅的胚胎種系干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Piwi基因，并且發(fā)現(xiàn)其已經(jīng)在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSC）的自我更新過程中顯示出了很重要的作用。Piwi是干細(xì)胞分裂的重要調(diào)控因子，參與核內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄后的修飾過程與干細(xì)胞自我更新的調(diào)控，在各種生物中具有廣泛的保守性［1，7］。人Hiwi基因定位在12q24.33，cDNA全長3600bp，包含1個56bp的5′非編碼區(qū)，723bp的3′非編碼區(qū)和1個3362bp的開放閱讀框架（ORF），編碼862個氨基酸［2］，均為Argonaute家族中的成員。目前研究［8］發(fā)現(xiàn)：Argonaut家族蛋白是小RNA復(fù)合體的基本組成成員之一，在生物物種中高度保守。當(dāng)小RNA與具有同源序列的靶mRNA或靶DNA結(jié)合后，Argonaut家族蛋白則誘導(dǎo)組蛋白或區(qū)域DNA甲基化，以刪除部分DNA序列、降解mRNA、抑制翻譯活動從而發(fā)揮基因沉默作用。Hiwi最先在睪丸生殖細(xì)胞中被檢測到，在睪丸細(xì)胞中的表達(dá)僅限于在精子形成前的精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞，而在喪失生殖系特征的非精母細(xì)胞中不表達(dá)。Hiwi在生殖系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)增強，提示其在生殖細(xì)胞的特性維持與增殖中發(fā)揮一定作用［9］。除了生殖細(xì)胞外，Hiwi在胚胎組織和成人胃、肝臟、腎臟等組織中均有表達(dá)。研究［10－12］發(fā)現(xiàn)：Hiwi在正常胃黏膜、萎縮性胃炎、腸化生和胃癌組織中表達(dá)率分別為10%、36%、36%和76%，與胃組織病變的發(fā)展惡化過程密切相關(guān)。體外實驗［13］證實：Hiwi在5種胃癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)，當(dāng)用RNAi抑制其表達(dá)時，胃癌細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，細(xì)胞周期阻滯在G2／M期，證實了Hiwi在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。Sharma等［3］發(fā)現(xiàn)：人Hiwi在骨髓CD34＋細(xì)胞中表達(dá)較豐富，隨著CD34＋細(xì)胞的分化，其表達(dá)逐漸較少。Hiwi的表達(dá)與永生化的白血病細(xì)胞KG1喪失增殖能力相關(guān)，過表達(dá)可導(dǎo)致KG1的凋亡。因此，Hiwi基因可能在維持干細(xì)胞的靜止期或下調(diào)干（祖）細(xì)胞的細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，即對造血系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病過程中起著負(fù)向調(diào)節(jié)作用［13］。

重疊延伸PCR是利用PCR技術(shù)在體外進(jìn)行有效的基因重組和定點突變，而且不需要內(nèi)切酶和連接酶處理，尤其是對于定點突變，其突變效率高，操作簡單，因此運用非常廣泛［14］。而腺病毒載體是目前轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炑芯恐惺褂米疃嗟牟《据d體，并且由于其優(yōu)點而備受關(guān)注：感染效率高，既可以感染分裂期，又可以感染非分裂期細(xì)胞；外源基因表達(dá)水平高；病毒滴度高，制備純化相對容易；插入外源基因容量大；病毒基因組較少發(fā)生重排［15－17］。本實驗中選用重疊延伸PCR完成6個部位的點突變，擴(kuò)增了人Hiwi編碼區(qū)基因全長，并且有效連接標(biāo)簽蛋白及GFP報告基因，然后應(yīng)用pAV.Des1d腺病毒載體系統(tǒng)，將目的基因應(yīng)用Gateway技術(shù)定向克隆至入門載體，利用入門載體與病毒骨架在體外進(jìn)行同源重組，將目的基因轉(zhuǎn)入病毒骨架，轉(zhuǎn)化篩選，整個過程只需兩步，過程操作相對簡單、快捷、準(zhǔn)確。本實驗結(jié)果表明：利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建Hiwi重組腺病毒載體，不僅大大簡化了基因克隆的步驟，而且顯著提高了克隆效率。

本研究成功構(gòu)建了重組腺病毒載體，獲得了高效價重組腺病毒子pAV.Ex1d－Hiwi，可進(jìn)一步用于基因治療靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，構(gòu)建白血病干細(xì)胞基因治療的細(xì)胞載體，為今后白血病基因治療的研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

［1］Buss EC，Ho AD.Leukemia stem cells［J］.Int J Cancer，2011，129（10）：2328－2336.

［2］Lin H，Spradling AC.A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary［J］.Development，1997，124（12）：2463－2476.

［3］Sharma AK，Nelson MC，Brandt JE，et al.Human CD34（＋）stem cells express the hiwi gene，a human homologue of the Drosophila gene Piwi［J］.Blood，2001，97（2）：426－434.

［4］Cox DN，Chao A，Baker J，et al.A novel class of evolutionarily conserved genes defined bv piwi are essential for stem cell self－renwal［J］.Genes Dev，1998，12（23）：3715－3727.

［5］Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414（6859）：105－111.

［6］Couzin J.Medicine.Tracing the steps of metastasis，cancer’s menacing ballet［J］.Science，2003，299（5609）：1002－1006.

［7］Suzuki R，Honda S，Kirino Y.PIWI expression and function in cancer［J］.Front Genet，2012，3：204.

［8］Qiao D，Zeennmn AM，Deng W，et al.Molecular characterization of Hiwi，a human member of the piwi gene family whcse overexpression is correlated to seminomas［J］.Oncogene，2002，21（25）：3988－3999.

［9］Zhao YM，Zhou JM，Wang LR，et al.HIWI is associated with prognosis in patients with hepatocellular carcinoma after curative resection［J］.Cancer，2012，118（10）：2708－2717.

［10］Zeng Y，Qu LK，Meng L，et al.HIWI expression profile in cancer cells and its prognostic value for patients with colorectal cancer［J］.Chin Med J，2011，124（14）：2144－2149.

［11］Liang D，F(xiàn)ang Z，Dong M，et al.Effect of RNA interference－related HiWi gene expression on the proliferation and apoptosis of lung cancer stem cells［J］.Oncol Lett，2012，4（1）：146－150.

［12］Jiang J，Zhang H，Tang Q，et al.Expression of HIWI in human hepatocellular carcinoma［J］.Cell Biochem Biophys，2011，61（1）：53－58.

［13］Liu X，Sun Y，Guo J，et al.Expression of hiwi gene in human gastric cancer was associated with proliferation of cancer cells［J］.Int J Cancer，2006，118（8）：1922－1929.

［14］Zhang X，Godbey WT.Viral vectors for gene delivery in tissue engineering［J］.Adv Drug Deliv Rev，2006，58（4）：515－534.

［15］Goncalves MA，de Vries AA.Adenovirus：from foe to friend［J］.Rev Med Virol，2006，16（3）：167－186.

［16］Ghosh SS，Gopinath P，Ramesh A.Adenoviral vectors：a promising tool for gene therapy［J］.Appl Biochem Biotechnol，2006，133（1）：9－29.

［17］Vorburger SA，Hunk KK.Adenoviral gene therapy［J］.Oncology，2002，7（1）：46－59.