靳文斌 張蕭蕭 李玉 路福平

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

合成唾液酸乳糖重組大腸桿菌的構(gòu)建

靳文斌 張蕭蕭 李玉 路福平

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

唾液酸寡糖具有抗感染、提高免疫力、促進(jìn)雙歧桿菌增殖等功能，對(duì)其微生物合成方法的研究具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值?？寺『捅磉_(dá)來(lái)源于Campylobacter jejuni的N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶基因（neuC）、乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuB）、CMP-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuA）和來(lái)源于Nesseria meningitidis的唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因（nst），利用表達(dá)載體pSTV29，在大腸桿菌Escherichia coli JM109內(nèi)構(gòu)建合成唾液酸乳糖的代謝途徑。在接種量2%、裝液量50 mL/250 mL三角瓶、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度34℃的條件下發(fā)酵30 h，并以10 g/L乳糖為底物，利用HPLC檢測(cè)到唾液酸乳糖的合成量為2.45 g/L，為人乳唾液酸寡糖及其類(lèi)似物的異體合成提供了新的思路。

唾液酸乳糖 大腸桿菌 代謝工程

人乳寡糖及其類(lèi)似物由于安全、可靠，不產(chǎn)生抗藥性，并且具有部分免疫功能［1］，以人乳寡糖及其類(lèi)似物為原料開(kāi)發(fā)新型藥物成為當(dāng)前醫(yī)藥領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。目前我國(guó)對(duì)人乳寡糖的研究開(kāi)發(fā)仍處于初始階段且多采用化學(xué)合成法獲得人乳寡糖及其類(lèi)似物。由于糖苷供體價(jià)格昂貴［2］、合成路徑復(fù)雜［3］及分離純化困難，限制了人乳寡糖及其類(lèi)似物的工業(yè)應(yīng)用。伴隨著相關(guān)基因不斷解析和微生物代謝路徑不斷得到闡明［4-7］，使得利用生物技術(shù)的方法大量獲得人乳寡糖成為可能。

唾液酸寡糖是人乳寡糖的重要組成成分，具有抗感染、提高免疫力、促進(jìn)雙歧桿菌增殖等功能［8］，

在食品醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的市場(chǎng)前景，近年來(lái)受到人們的廣泛關(guān)注。由于化學(xué)合成法涉及復(fù)雜的保護(hù)和去保護(hù)步驟，人們把目光轉(zhuǎn)向了生物技術(shù)的方法。利用組合生物學(xué)技術(shù)，人們已成功合成殼聚糖［9，10］、巖藻糖基化寡糖［11］、神經(jīng)節(jié)苷脂等碳水化合物［12］，為合成唾液酸寡糖提供了新思路，解決了難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模合成的難題。

本研究主要是將來(lái)源于空腸彎曲桿菌（C. jejuni）的N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶基因（neuC）、乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuB）、CMP-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuA）和來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏菌（N. meningitidis）的唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因（nst）引入大腸桿菌JM109，在其體內(nèi)構(gòu)建合成唾液酸乳糖的合成途徑，以乳糖為底物合成唾液酸乳糖，合成途徑如圖1。

圖1 合成唾液酸乳糖工程菌代謝途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 Escherichia coli JM109和大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pSTV29均為本實(shí)驗(yàn)室保藏；重組質(zhì)粒pUC57-neuA-neuB-neuC和pUC57-nst均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行neuA、neuB、neuC、nst基因合成時(shí)提供。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶PstⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、SacⅠ和SolutionⅠ，大連寶生物工程有限公司；1 kb DNA Ladder、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京天為時(shí)代科技有限公司；氯霉素，上海生工生物工程公司；其他為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖40，酵母粉 5，硫酸銨5，磷酸氫二鈉4，磷酸二氫鉀0.5，pH6.8，115℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 工 程 菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst的構(gòu)建 將質(zhì)粒pUC57-neuA-neuB-neuC和質(zhì)粒pSTV29分別用限制性內(nèi)切酶PstⅠ、EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用SolutionⅠ于16℃連接過(guò)夜，利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli JM109中，通過(guò)氯霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，獲得工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC，用同樣的方法構(gòu)建工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC和工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst，重組質(zhì)粒用雙酶切法進(jìn)行鑒定。

1.2.2 唾液酸乳糖及其中間產(chǎn)物的發(fā)酵合成 將構(gòu)建的工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC、JM109/ pSTV29-neuA-neuB-neuC和 JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst分別接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。按2%接種量轉(zhuǎn)入50 mL新鮮的大腸桿菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，氯霉素終濃度為 40 μg/mL，34℃培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，34℃誘導(dǎo)培養(yǎng)30 h。

1.2.3 唾液酸乳糖及其中間產(chǎn)物的分析檢測(cè) HPLC和LC-MS分析條件為色譜柱：Aminex HPX-87H Column，300 mm×7.8 mm；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相：H2O+0.05 mol/L H2SO4；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.5 mL/min。

取誘導(dǎo)培養(yǎng)后的發(fā)酵液和菌體細(xì)胞，超聲破碎（功率500 W，振幅35%，每個(gè)循環(huán)超聲4 s，冷卻5 s，10 min），4℃，12 000 r/min下離心10 min，收集上清進(jìn)行HPLC分析。用配置好的1 mg/mL的N-乙酰神經(jīng)氨酸、1 mg/mL的唾液酸乳糖的標(biāo)品溶液作為對(duì)照以確定發(fā)酵液中相應(yīng)產(chǎn)物的出峰位置。并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行LC-MS分析，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步確定。根據(jù)N-乙酰神經(jīng)氨酸的分子量（311）、唾液酸乳糖的分子量（633）設(shè)定掃描質(zhì)量范圍100-700，負(fù)離

子模式，檢測(cè)N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)品，再根據(jù)標(biāo)品的信號(hào)大小設(shè)置SIM 碰撞誘導(dǎo)解離參數(shù)，進(jìn)樣量為10 μL檢測(cè)發(fā)酵樣品。

2 結(jié)果

2.1 工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒pSTV29-neuB-neuC的構(gòu)建及鑒定將PstⅠ/EcoRⅠ雙酶切處理過(guò)的質(zhì)粒pUC57-neuA-neuB-neuC和質(zhì)粒pSTV29與SolutionⅠ混合，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒采用PstⅠ/EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，在2 300 bp及3 000 bp左右出現(xiàn)兩條帶，與串聯(lián)基因neuB、neuC和質(zhì)粒pSTV29大小一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒pSTV29-neuB-neuC構(gòu)建成功。

2.1.2 重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC的構(gòu)建及鑒定 將PstⅠ/KpnⅠ雙酶切處理過(guò)的質(zhì)粒pUC57-neuA-neuB-neuC和 質(zhì) 粒pSTV29與SolutionⅠ 混合，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒采用PstⅠ/KpnⅠ雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，在2 900 bp及3 000 bp出現(xiàn)兩條帶，與串聯(lián)基因neuA、neuB、neuC和質(zhì)粒pSTV29大小一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC構(gòu)建成功。

圖3 重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC酶切電泳圖

2.1.3 重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst的構(gòu)建及鑒定 將KpnⅠ/SacⅠ雙酶切處理過(guò)的質(zhì)粒pSTV-29-neuA-neuB-neuC和質(zhì)粒pUC57-nst與SolutionⅠ混合，過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，構(gòu)建工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒采用PstⅠ/KpnⅠ雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，在3 900 bp及3 000 bp出現(xiàn)兩條帶，與串聯(lián)基因neuA、neuB、neuC、nst和質(zhì)粒pSTV29大小一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst構(gòu)建成功。

圖4 重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst酶切電泳圖

2.2 唾液酸乳糖及其中間產(chǎn)物的分析檢測(cè)

2.2.1 N-乙酰神經(jīng)氨酸和CMP-乙酰神經(jīng)氨酸的分析檢測(cè) 工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC發(fā)酵后，對(duì)發(fā)酵反應(yīng)液超聲破碎，離心收集上清，HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。由圖5-B可以看出對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行HPLC分析，在大約14 min處出現(xiàn)了預(yù)期的峰，這與圖5-A中N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)品的出峰時(shí)間相同，可以判定構(gòu)建的工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC可以合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。

采用同樣的發(fā)酵和檢測(cè)方法，對(duì)工程菌JM109/ pSTV29-neuA-neuB-neuC合成CMP-乙酰神經(jīng)氨酸的情況進(jìn)行分析，HPLC檢測(cè)工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC的發(fā)酵反應(yīng)液在CMP-乙酰神經(jīng)氨酸的出峰位置處沒(méi)有吸收峰形成。

為了進(jìn)一步確定所生成的產(chǎn)物是N-乙酰神經(jīng)氨酸，應(yīng)用LC-MS對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析。發(fā)酵樣

品檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，根據(jù)N-乙酰神經(jīng)氨酸的結(jié)構(gòu)及分子量，設(shè)置掃描質(zhì)量范圍為100-700，在負(fù)離子模式下，得到N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)品的M/Z：334（M+Na）-。

圖5 N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)品和發(fā)酵液液相色譜圖

如圖6-A，N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)品的信號(hào)大小設(shè)置SIM 碰撞誘導(dǎo)解離參數(shù)為334，進(jìn)樣量為10 μL。檢測(cè)發(fā)酵樣品，如圖6-B所示，發(fā)酵樣品出現(xiàn)的質(zhì)譜信號(hào)發(fā)現(xiàn)在M/Z：334.1（M+Na）-有離子峰，這與N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)品離子峰大小一致，進(jìn)一步證明了發(fā)酵液中的產(chǎn)物為N-乙酰神經(jīng)氨酸。

2.2.2 產(chǎn)物唾液酸乳糖的分析檢測(cè) 工程菌JM109/ pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst發(fā)酵后，超聲破碎，離心收集上清，發(fā)酵樣品檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。由圖7-B可以看出對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行HPLC分析時(shí)，在大約8 min處出現(xiàn)了預(yù)期的峰，這與圖7-A中唾液酸乳糖標(biāo)品的出峰時(shí)間相同，對(duì)照組中同樣在相同時(shí)間具有吸收峰，但是在8 min處圖7-B中峰面積與圖7-C中峰面積相比較，在8 min處圖7-B峰面積明顯偏大，因此可以判定構(gòu)建的工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst合成了唾液酸乳糖。

圖6 N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)品和發(fā)酵樣品的質(zhì)譜分析

為了進(jìn)一步確定所生成的產(chǎn)物是唾液酸乳糖，應(yīng)用LC-MS對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析。發(fā)酵樣品檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，根據(jù)唾液酸乳糖的結(jié)構(gòu)及分子量，設(shè)置掃描質(zhì)量范圍為100-700，在負(fù)離子模式下，得到唾液酸乳糖標(biāo)品的M/Z：632（M-H）-。

圖7 唾液酸乳糖標(biāo)品和發(fā)酵液液相色譜圖

根據(jù)標(biāo)品的信號(hào)大小設(shè)置SIM 碰撞誘導(dǎo)解離參數(shù)為632，進(jìn)樣量為10 μL檢測(cè)發(fā)酵樣品，如圖8-B所示，發(fā)酵樣品在出現(xiàn)的質(zhì)譜信號(hào)發(fā)現(xiàn)在M/Z：632（M-H）-有離子峰，這與唾液酸乳糖標(biāo)品離子峰大小一致，而對(duì)照菌在相應(yīng)的位置卻沒(méi)有離子峰出現(xiàn)，進(jìn)一步證明了發(fā)酵液中的產(chǎn)物為唾液酸乳糖。

3 討論

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)CMP-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成通路受到N-葡萄糖胺異構(gòu)酶的調(diào)節(jié)控制［13］，具體表現(xiàn)為CMP-乙酰神經(jīng)氨酸反饋抑制N-葡萄糖胺異構(gòu)酶的活性。在微生物體內(nèi)這種反饋抑制途徑還沒(méi)得到證實(shí)，然而細(xì)菌來(lái)源的N-葡萄糖胺異構(gòu)酶與哺乳動(dòng)物來(lái)源的N-葡萄糖胺異構(gòu)酶表現(xiàn)出較高的序列同源性，因此在微生物體內(nèi)也可能存在相似的反饋抑制途徑。這就可以解釋在串聯(lián)了neuA、neuB、neuC三個(gè)目的基因的重組菌中發(fā)酵后在在發(fā)酵液中檢測(cè)不到N-乙酰神經(jīng)氨酸且CMP-乙酰神經(jīng)氨酸的合成量較少。Fierfort［14］在同時(shí)引入neuA、neuB、neuC的工程菌中檢測(cè)不到N-乙酰神經(jīng)氨酸，本研究結(jié)果也證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。

圖8 唾液酸乳糖標(biāo)品和發(fā)酵樣品的質(zhì)譜分析

以10 g/L乳糖為底物，180 r/min 34℃持續(xù)發(fā)酵30 h，唾液酸乳糖的合成量為2.45 g/L，Drouillard等［15］利用重組大腸桿菌采用高密度持續(xù)發(fā)酵的方法，唾液酸乳糖的合成量為34 g/L，與其相

比我們構(gòu)建的重組菌由于沒(méi)有敲除乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因（nanA）、乙酰神經(jīng)氨酸激酶基因（nanK）等，導(dǎo)致合成的N-乙酰神經(jīng)氨酸通過(guò)其它途徑進(jìn)行分解代謝，從而影響終產(chǎn)物唾液酸乳糖的累積量，此外發(fā)酵控制條件和選用的表達(dá)載體也會(huì)影響唾液酸乳糖的合成量。盡管如此，本研究仍對(duì)唾液酸乳糖的異源合成做出了有益探索。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用基因工程技術(shù)成功地將來(lái)源于空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）的N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶基因（neuC）、乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuB）、CMP-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuA）和來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏菌（N. meningitidis）的唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因（nst）克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pSTV29中，在大腸桿菌JM109體內(nèi)構(gòu)建了合成唾液酸乳糖的合成途徑，從而合成唾液酸乳糖。利用工程菌，34℃持續(xù)發(fā)酵30 h，唾液酸乳糖的合成量為2.45 g/L。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Construction of E.coli Engineering Strain for Sialyllactose Production

Jin Wenbin Zhang Xiaoxiao Li Yu Lu Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，the College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

Free sialylated oligosaccharides are known to have anti-infective and immunostimulating properties and also known to promote bifidobacterium proliferation, thus investigating the microbial synthetic route of sialylated oligosaccharides is of great value. Biosynthesis of sialyllactose involves N-acetylglucosamine-6-phosphate-epimerase（neuC）, sialic acid synthase（neuB）, CMP-Neu5Ac synthetase（neuA）and α-2, 3-sialyltransferase（nst）. We engineered a biosynthetic pathway sialyllactose production in E.coli JM109, using the expression vector pSTV29, by coexpressing the α-2, 3-sialyltransferase gene from Neisseria meningitidis with the neuA, neuB and neuC Campylobacter jejuni genes encoding CMP-NeuAc synthetase, sialic acid synthase and N-acetylglucosamine-6-phosphate-epimerase, respectively. Under the optimized fermentation conditions（inoculum volume 2%, 10g/L lactose, fermentation volume 50 mL/250 mL, temperature 34℃, rotation speed 180 r/min, fermentation time 30 h）, sialyllactose of 2.45 g/L was obtained. The above results provide a platform for exploring commercial production of sialylated oligosaccharides and its functional analogues in heterogeneous microbial hosts.

Sialyllactose E.coli Metabolic engineering

2014-05-04

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”資助項(xiàng)目（2012AA021502），教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IRT1166）

靳文斌，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：jinwenbin-1988@163.com

李玉，女，教授，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程；E-mail：liyu@tust.edu.cn