陳丹丹 彭新潔 李彥紅 王召旭 中國食品藥品檢定研究院 （北京 100050）

生物人工血管是以豬的血管為原料，經(jīng)過特殊生物處理技術(shù)制成，主要用于外科上血管病變的替代和旁路搭橋手術(shù)。生物人工血管的結(jié)構(gòu)是內(nèi)部光滑，不易凝血，且容許內(nèi)皮細(xì)胞爬行覆蓋；外表面呈纖維狀，可供組織粘附爬行，植入部位不易受到感染。

理想的生物材料應(yīng)具有良好的生物相容性，應(yīng)對(duì)細(xì)胞、組織等無毒性、無刺激性、無致畸致突變性。本研究按照GB/T16886 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)的要求對(duì)生物人工血管進(jìn)行了細(xì)胞毒性試驗(yàn)，急性毒性試驗(yàn)，皮內(nèi)刺激和致敏試驗(yàn)，溶血試驗(yàn)，亞慢性毒性試驗(yàn)，植入試驗(yàn)，遺傳毒性試驗(yàn)，從體內(nèi)體外兩方面評(píng)價(jià)生物人工血管的生物相容性[1～6]。

1.材料和方法

1.1 材料

生物人工血管，生產(chǎn)單位：廣州宏暢生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

取樣品2.0g 加細(xì)胞培養(yǎng)液10mL，在37?C 浸提24 小時(shí)，取浸提液作為供試液。制備L929 細(xì)胞（小鼠成纖維細(xì)胞）懸液：消化吹打計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105·mL-1，吸100μL 細(xì)胞懸液注入培養(yǎng)板內(nèi)，放入含5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時(shí)。陽性對(duì)照：含20%DMSO的MEM 培養(yǎng)液。陰性對(duì)照：高密度聚乙烯。棄去原培養(yǎng)液，每孔分別加入100μL 的空白對(duì)照液、陰性對(duì)照液、陽性對(duì)照液、試驗(yàn)樣品浸提液，每組設(shè)6 孔。24 小時(shí)后棄去孔內(nèi)液體，每孔加入20μL MTT，在CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 小時(shí)后棄去孔內(nèi)液體，每孔分別加入150μL DMSO，10 分鐘后振蕩，用雙波長（570nm 和630nm）法測定吸光度[7]。

1.2.2 急性毒性試驗(yàn)

取樣品2.0g 加氯化鈉注射液10mL，在37?C浸提72 小時(shí)，取浸提液作為供試液。體重為18-21g 的昆明種小鼠（共10 只，雄性）隨機(jī)分為對(duì)照組（空白對(duì)照液）和實(shí)驗(yàn)組（供試液組）。將浸提液以50ml·kg-1的比例經(jīng)尾靜脈注射入實(shí)驗(yàn)組體內(nèi)，將生理鹽水以50ml·kg-1的比例經(jīng)尾靜脈注射入對(duì)照組體內(nèi)。注射后觀察小白鼠即時(shí)反應(yīng)并于4、24、48 和72 小時(shí)觀察和記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)[8]。

1.2.3 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)

取樣品2.0g 加氯化鈉注射液10ml，在37?C恒溫?fù)u床浸提72 小時(shí)，取浸提液作為供試液。將體重為2.0kg～2.2kg 的3 只家兔于試驗(yàn)前（24 小時(shí)）背部去毛備用，在脊柱右側(cè)選5 個(gè)點(diǎn)注射試驗(yàn)樣品，每點(diǎn)間隔2cm，同法在左側(cè)選5 個(gè)點(diǎn)注射氯化鈉注射液（陰性對(duì)照），各點(diǎn)注射量為0.2ml。分別在24 小時(shí)、48 小時(shí)和72 小時(shí)內(nèi)觀察接觸部位的反應(yīng)情況，按照GB/T16886.10-2005 中的方法判定其結(jié)果并記分。

1.2.4 皮膚致敏試驗(yàn)

取樣品4.0g 加氯化鈉注射液20ml，在37?C恒溫?fù)u床浸提72 小時(shí)，取浸提液作為供試液。按照GB/T16886.10-2005 中的方法進(jìn)行皮內(nèi)誘導(dǎo)、局部誘導(dǎo)及激發(fā)試驗(yàn)，判定其結(jié)果。

1.2.5 溶血試驗(yàn)

取樣品1cm×5cm 大小，加入生理鹽水8ml，制備3 份。陰性對(duì)照組：生理鹽水10ml，3 管。陽性對(duì)照組：蒸餾水10ml，3 管。將各組分別置于37?C 水浴60 分鐘。將水浴后的各樣品管分別加入0.16ml 抗凝兔血，對(duì)照管加入0.2 ml 抗凝兔血，再次在37?C 水浴60 分鐘。將水浴后的各管以800g 離心5 分鐘后，吸取上清液。在545nm波長處讀取各管上清液的吸光度值。

1.2.6 亞慢性毒性試驗(yàn)

體重為230～250 克的SD 品系雄性大鼠30只按體重隨機(jī)分為3 組，每組10 只，分別對(duì)高劑量組大鼠尾靜脈注射浸提比例為0.4g·ml-1注射劑量為10ml·kg-1的生理鹽水浸提液， 對(duì)低劑量組大鼠尾靜脈注射浸提比例為0.2g·ml-1注射劑量為10ml·kg-1的生理鹽水浸提液，對(duì)照組給予10ml·kg-1生理鹽水。

給供試品期間密切觀察各組動(dòng)物的外觀體征、糞便性狀，每日稱體重一次。

連續(xù)給藥14 天后（解剖前夜禁食），10%水合氯醛，0.3ml·100g-1對(duì)大鼠腹腔注射麻醉后，下腔靜脈取血，分別測定血液指標(biāo)：血紅蛋白濃度（HGB）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、血小板數(shù)（PLT）、白細(xì)胞數(shù)（WBC）、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)（DC）、凝血酶原時(shí)間（PT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）等血液學(xué)指標(biāo)；血液經(jīng)離心分離血清，測定天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素（UREA）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、總膽紅素（T-BIL）、肌酐（CRE）、總膽固醇（T-CHO）、鈣、氯、磷等血清生化學(xué)指標(biāo)。

并于次日處死，系統(tǒng)尸解，稱取心、肝、脾、腎、腎上腺、腦、胸腺、睪丸、附睪的重量并計(jì)算臟器系數(shù)。肉眼觀察后，將上述組織全部放入中性10%甲醛溶液中固定，石蠟切片、HE 染色、顯微鏡下觀察各臟器的病理組織學(xué)變化[9]。

1.2.7 植入試驗(yàn)

以B 型硬腦(脊)膜補(bǔ)片為對(duì)照，將樣品和對(duì)照剪成10mm×10mm，選用12 只家兔。體重 2000～2500g。腹腔注射30mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉后， 背部術(shù)野剃毛，碘酒，酒精常規(guī)消毒。左，右側(cè)脊柱兩側(cè)皮下各植入3 個(gè)植入物。左側(cè)為對(duì)照， 右側(cè)為樣品。于植入后1 周，4 周，12 周取材進(jìn)行病理制片，顯微鏡觀察。

1.2.8 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)

取樣品1.8g，加氯化鈉注射液9ml，在37?C 恒溫?fù)u床浸提72 小時(shí)，制備浸提液。試驗(yàn)采用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型突變株(TA97，TA98，TA100 和TA102)。陰性對(duì)照為同批號(hào)浸提介質(zhì)生理鹽水(NS);陽性對(duì)照為敵克松（500μg·ml-1），2-氨基芴（2mg·ml-1），1,8-二羥基蒽醌（500μg·ml-1）。代謝活化系統(tǒng)：選用健康雄性成年Wistar 大白鼠，采用合并誘導(dǎo)方法制備S9。試驗(yàn)采用平板摻入法，試驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、浸提液組、1/2 浸提液組、1/4 浸提液組。非活化試驗(yàn)：加入0.2mol·L-1磷酸緩沖液0.5mL 及受試液、新鮮菌液各0.1mL?；罨囼?yàn)：加入5%S9mix0.5mL 及受試液、新鮮菌液各0.1mL，置37?C 培養(yǎng)72h 后統(tǒng)計(jì)回變菌落數(shù)，同時(shí)做S9mix檢菌。

1.2.9 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)

取樣品4.7g 加入含血清的1640 培養(yǎng)液23.5mL，在37?C 恒溫?fù)u床浸提24 小時(shí)，制備浸提液。試驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、浸提液組、1/2 浸提液組、1/4 浸提液組。細(xì)胞株采用中華倉鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL);陰性對(duì)照為同批浸提介質(zhì)，陽性對(duì)照為0·25μg·ml-1絲裂霉素(-S9mix)和20μg/mL 環(huán)磷酰胺(+S9mix);代謝活化用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物肝微粒體酶(S9)進(jìn)行代謝活化。試驗(yàn)方法采用正常培養(yǎng)的CHL 細(xì)胞經(jīng)消化液作用后，制成5×104個(gè)·mL-1細(xì)胞懸液，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿接種3.0mL，培養(yǎng)24h 后吸去培養(yǎng)液，加入測試樣品浸提液。活化組S9mix作用6h 后換液，培養(yǎng)24h 收獲細(xì)胞，非活化組分別于作用24h 和48h 后收獲細(xì)胞，制備染色體，Giemsa 染色，顯微鏡下觀察100 個(gè)中期分裂相。

1.2.10 哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外基因突變試驗(yàn)

取樣品3.5g 加入含血清的1640 培養(yǎng)液17.5mL，在37?C 恒溫?fù)u床浸提24 小時(shí)，制備浸提液。試驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、浸提液組、1/2 浸提液組、1/4 浸提液組。陰性對(duì)照為無血清培養(yǎng)液；陽性對(duì)照非活化系統(tǒng)為1.0mg·ml-1甲基磺酸乙酯溶液（EMS）， 活化系統(tǒng)為250μg·ml-17,12-二甲基苯蒽（DMBA）。

取純化V79 細(xì)胞，每個(gè)50mL 大小的培養(yǎng)瓶接種5.0×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)20 小時(shí)后，非活化系統(tǒng)分別加入5.0mL 材料浸提液及對(duì)照液；活化系統(tǒng)分別加入4.5mL 材料浸提液及對(duì)照液后，再加入0.5mL S9 混合液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。棄去含受試物的培養(yǎng)液，D-Hank?s 洗滌后，換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)20h。上述細(xì)胞經(jīng)消化液消化、計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔接種2.0×102個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)7 天后用甲醇固定，姬姆薩染色，計(jì)數(shù)形成的集落。另外在50ml 的培養(yǎng)瓶中接種5.0×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。中間低密度傳代一次。表達(dá)結(jié)束后，消化計(jì)數(shù)，6 孔板的每孔中接種2.0×102個(gè)細(xì)胞，7 天后測定細(xì)胞克隆形成率。同時(shí)在6 孔板的孔中接種1.5×105個(gè)細(xì)胞，2 小時(shí)后加入含6-TG 選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，作HGPRT 基因突變集落選擇，選擇期為10 天，計(jì)算基因位點(diǎn)突變頻率。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：樣品試驗(yàn)液的細(xì)胞毒性分級(jí)按GB/T16886·5 中規(guī)定的分級(jí)原則為0 級(jí)，陰性對(duì)照為1 級(jí)，陽性對(duì)照為4 級(jí)。生物人工血管細(xì)胞毒性反應(yīng)為0 級(jí)，符合臨床使用要求。

2.2 急性毒性試驗(yàn)：按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886·11中規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，結(jié)果小鼠活動(dòng)正常，未見任何異物反應(yīng)。在觀察期間動(dòng)物體重增加和陰性對(duì)照相比無任何差異，說明生物人工血管無全身急性毒性反應(yīng)。

2.3 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)：家兔脊柱兩側(cè)在注射后24h、48h 和72h 觀察注射點(diǎn)，試驗(yàn)組和陰性對(duì)照均為0級(jí)，說明生物人工血管無皮內(nèi)刺激作用。

2.4 致敏試驗(yàn)：按GB/T16886·11 中規(guī)定的最大劑量法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果陰性對(duì)照組和材料試驗(yàn)組相比無明顯差異，均未觀察到致敏作用。

2.5 溶血試驗(yàn)：計(jì)算溶血率=（OD 樣品–OD 陰性對(duì)照）/（OD 陽性對(duì)照–OD 陰性對(duì)照）=（0.025–0.014）/（0.881–0.014）= 1.2%，符合溶血率不大于5%的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.6 亞慢性毒性試驗(yàn)：生物人工血管生理鹽水浸提液（0.4g·ml-1），SD 雄性大鼠尾靜脈注射（10ml·kg-1），連續(xù)給予14 天，結(jié)果樣品各劑量組體重增長正常，未發(fā)現(xiàn)臨床征象等一般毒理學(xué)指標(biāo)方面異常，大體和組織病理學(xué)檢查，未見各臟器明顯中毒性病理改變。血液學(xué)、生物化學(xué)相關(guān)指標(biāo)顯示，樣品高劑量組HCT、RBC、HGB、PLT、GLU、UREA、C1 升高，WBC、CRE 降低；低劑量組RBC、HCT、HGB、PLT、GLU、UREA、C1，升高，ALT 降低。凝血酶原時(shí)間高低劑量組均高于陰性對(duì)照組，其余未見與陰性對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.7 植入實(shí)驗(yàn)：樣品植入后肉眼觀察所見：各時(shí)間點(diǎn)皮膚切口愈合良好，未見局部紅腫及感染。顯微鏡下所見：對(duì)照1 周（圖1）：疏松結(jié)締組織中，可見一條帶，由紅染的纖維束樣材料組成，呈縱行排列，之間有縫隙，四周可見菲薄的膠原纖維，成纖維細(xì)胞，和纖維細(xì)胞包繞而成的囊壁。偶見淋巴細(xì)胞，另偶見小血管和神經(jīng)切面(炎I， 纖I-II) 。樣品1 周（圖2）：疏松的脂肪結(jié)締組織中可見一紅染束狀植入物，呈縱向排列的細(xì)胞網(wǎng)狀，部分致密，部分疏松，邊緣處和四周可見淋巴細(xì)胞，吞噬細(xì)胞和壞死的細(xì)胞碎片，外周可見由成纖維細(xì)胞，纖維細(xì)胞和膠原纖維構(gòu)成的囊壁，偶見粒細(xì)胞(炎II-III， 纖I-II)。對(duì)照4 周（圖3）：疏松的脂肪結(jié)締組織中，可見一條帶植入物，由紅染的纖維囊組成，縱行疏松排列，四周可見由成纖維細(xì)胞，纖維細(xì)胞和菲薄的膠原纖維構(gòu)成的囊壁。四周偶見淋巴細(xì)胞散在分布，囊內(nèi)材料與囊壁間偶見空隙(炎I， 纖I)。樣品4 周（圖4）：疏松脂肪結(jié)締組織中可見一紅染束狀植入物，部分致密，部分疏松，四周可見由成纖維細(xì)胞，膠原纖維構(gòu)成的囊壁，囊壁與周圍疏松結(jié)締組織中偶見少許淋巴細(xì)胞浸潤(炎I， 纖I)。對(duì)照12 周（圖5）：疏松結(jié)締組織中，可見一條帶狀植入物，呈紅染束狀，縱行疏松排列，四周可見由膠原纖維和纖維細(xì)胞構(gòu)成的菲薄的囊壁，偶見淋巴細(xì)胞在囊周分布(炎I， 纖I）。樣品12 周（圖6）：疏松脂肪結(jié)締組織中可見一紅染植入物，呈縱向束帶狀，部分致密，部分疏松，有些切片可見藍(lán)色鈣鹽在材料局部沉積，有囊壁形成，由膠原纖維和纖維細(xì)胞及脂肪結(jié)締組織形成，部分切片可見較多的淋巴細(xì)胞灶狀浸潤，四周仍可見小血管和神經(jīng)切面。（炎癥I，纖維I）。

圖2. 樣品植入后1 周

圖3. 對(duì)照植入后4 周

圖4. 樣品植入后4 周

圖5. 對(duì)照植入后12 周

圖6. 樣品植入后12 周

對(duì)照26 周（圖7）：疏松的結(jié)締組織中可見一條狀植入物，為紅染的縱行束狀，排列疏松，四周可見菲薄的纖維膠原構(gòu)成的囊壁，偶見條帶兩端處囊周有少許淋巴細(xì)胞浸潤(炎癥I，纖維I）。樣品26 周（圖8）：疏松脂肪結(jié)締組織中，可見一束狀紅染植入物，呈縱向分布，部分顏色變淺，中間未見炎細(xì)胞，部分邊緣區(qū)域變疏松，四周可見膠原纖維和纖維細(xì)胞包繞形成較厚囊壁，但較疏松，局部區(qū)域有淋巴細(xì)胞浸潤，四周結(jié)締組織中可見小血管和神經(jīng)切面（炎癥I，纖維I）。結(jié)論：樣品植入后1 周，4 周，12 周，26 周樣品的炎癥反應(yīng)和纖維囊形成與對(duì)照無明顯差別。

2.8 遺傳毒性試驗(yàn)：單純采用一種試驗(yàn)方法不能有效評(píng)價(jià)材料的基因毒性，因此本研究選擇了Ames試驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外基因突變試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在活化和非活化條件下，生物人工血管的浸提液、1/2 浸提液、1/4 浸提液對(duì)試驗(yàn)所用4 種菌株的回變菌落數(shù)與陰性對(duì)照組比較，均未增加2 倍。表明在此實(shí)驗(yàn)條件下，樣品的生理鹽水浸提液對(duì)鼠傷寒沙門氏菌無誘變性。在活化和非活化條件下，生物人工血管的浸提液、1/2 浸提液、1/4 浸提液與中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL）接觸后，三個(gè)劑量浸提液染色體畸變率為0%，與空白對(duì)照組無顯著差別，說明生物人工血管無誘導(dǎo)細(xì)胞染色體畸變作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外基因突變試驗(yàn)中，試驗(yàn)樣品突變頻率未達(dá)到或超過陰性對(duì)照突變頻率的3 倍，未見試驗(yàn)樣品突變頻率的增高與劑量相關(guān)，未見某一劑量突變頻率的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明在活化和非活化條件下，生物人工血管的各劑量組浸提液對(duì)體外培養(yǎng)的V79 細(xì)胞無誘導(dǎo)HGPRT 基因突變作用?？傊从^察到生物人工血管的遺傳毒性作用。

圖7. 對(duì)照植入后26 周

圖8. 樣品植入后26 周

3.結(jié)論

生物人工血管是一種新型的生物材料，通過按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)系列標(biāo)準(zhǔn)（等同國際標(biāo)準(zhǔn)ISO10993）進(jìn)行了全面的生物學(xué)評(píng)價(jià)，證明生物人工血管具有良好的生物相容性，是十分理想的血管替代物，在組織工程方面具有廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用前景。

[1] GB/T 16886.1 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第1 部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過程中的評(píng)價(jià)與試驗(yàn)

[2] GB/T 16886.3 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第3 部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)

[3] GB/T 16886.5 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5 部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

[4] GB/T 16886.6 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第6 部分：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)

[5] GB/T 16886.10 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第10 部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)

[6] GB/T 16886.11 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第11 部分：全身毒性試驗(yàn)

[7] 鄭琪 ,奚廷斐,陳艷梅等。細(xì)菌纖維素的生物相容性研究。藥物分析雜志， 2010, 30 (7)： 1389-1392

[8] 王春仁，姜華，曹宏英等。止血防粘連生物紙的生物相容性研究。中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué) 報(bào)，2007，26，（2）：293～295

[9] 王春仁, 王召旭, 宋誼萍等。止血纖維素材料亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)研究。中國藥事，2007 ，21 （9）：695-698