王 捷，王志強，馮 佳，謝樹蓮

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006)

近年來一些池塘、湖泊及海洋富營養(yǎng)化問題越來越嚴重，進而引起浮游藻類過量繁殖形成水華，其中以藍藻水華尤為常見［1-4］。因此，有效控制浮游藻類大量繁殖，防止水華發(fā)生極為重要。有學(xué)者報道水生植物可作為凈化污染水體，吸附重金屬和防治富營養(yǎng)化的有效手段［5-7］。水生植物分泌的化感物質(zhì)抑藻由于具有高效、快速、生態(tài)安全性好等特點，也被認為是一種頗有前景的控藻方式［8，9］。

化感作用指一種植物與其他植物或微生物之間的化學(xué)相互作用，在自然界中非常普遍。在水生生態(tài)系統(tǒng)中利用植物化感作用控制藻類繁殖的研究也易受到關(guān)注。門玉潔等［10，11］研究了蘆葦(phragmites australis)化感組分對斜生柵藻(scenedesmus obliquus)、羊角月牙藻(selenastrum capricornutum)和萊茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)生長特性的影響。還有研究表明蘆葦化感物質(zhì)對銅綠微囊藻(microcystis aeruginosa)和蛋白核小球藻chlorella pyrenoidosa)細胞膜的選擇透性有影響，而對普通小球藻(C. vulagaris)的細胞膜選擇透性則沒有顯著影響［12-14］。

水華微囊藻(microcystis flosaquae)是一種常見的水華藻類，適應(yīng)性強、爆發(fā)率高，可產(chǎn)生微囊藻毒素，威脅其他水生生物生態(tài)功能的正常發(fā)揮，甚至影響人類健康［1］。本研究以水華微囊藻為研究對象，比較了北方地區(qū)兩種常見的水生植物水浸提液對葉綠素α 和超氧化物歧化酶(SOD)的影響，以期為水華防控研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物水浸提液制備

兩種水生植物——香蒲(typha orientalis)和穗狀狐尾藻(myriophyllum spicatum)，均采自山西太原市。將采集的植物體用自來水反復(fù)清洗干凈后，再用蒸餾水沖洗;剪碎置于80 ℃烘箱中干燥48 h;粉碎研磨過200 目篩，得到粉末;向1 L 錐形瓶中加入60 g 粉末和300 mL MA 培養(yǎng)液，置于恒溫(25 ℃)震蕩器中提取48 h;減壓抽濾，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾除去顆粒性雜質(zhì)及細菌以消除其他微生物的影響，所得濾液即為植物水浸提液。

1.1.2 水華微囊藻及培養(yǎng)

水華微囊藻分離自江蘇無錫太湖，在無菌條件下轉(zhuǎn)接至MA 培養(yǎng)液中，于人工氣候箱(SPX-250BG，上海博訊)中培養(yǎng)1 周，至對數(shù)生長期時進一步擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(25 ± 0. 5)℃、光暗比為12 h∶12 h、光照度為3 000 lx，靜置培養(yǎng)，每天定時搖動2 次。

1.2 試驗方法

1.2.1 化感作用試驗

向250 mL 錐形瓶中加入150 mL MA 培養(yǎng)液，高壓蒸汽滅菌后，在無菌條件下分別接入10 mL 生長狀況一致的水華微囊藻;培養(yǎng)至對數(shù)期(15 ～20 d)后分別加入0、5、10、20、30 和40 mL 植物水浸提液;依次加入滅菌MA 營養(yǎng)液，使培養(yǎng)液總體積為200 mL。植物水浸提液試驗組濃度梯度為0(對照組)、5、10、20、30 和40 g/L，每組設(shè)3 個重復(fù)。人工氣候箱培養(yǎng)溫度為(25 ±0.5)℃、光強3 000 lx、光暗比為12 h∶12 h，靜置培養(yǎng)，每天定時搖動2 次，并隨機調(diào)換三角瓶位置，隔24 h 取樣進行指標測定［15］。

1.2.2 葉綠素α 含量測定

取一定量的藻液用真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州長城)抽濾，抽干后將藻及濾膜一起放入具塞離心管中;加入體積分數(shù)為95%的乙醇溶液至10 mL，振蕩提取葉綠素，放置于暗處過夜;在4 500 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液，用紫外分光光度計(SP-752，上海光譜)測定葉綠素α 吸光值。

1.2.3 SOD 活力測定

取一定量藻液于4 500 r/min 下離心15 min;棄上清液，加入1 mL pH 為7.2 的0.05 mmol/L 磷酸緩沖液;用吸管轉(zhuǎn)移至離心管中進行破碎，條件為工作1 s、間隙2 s，功率400 W，破碎30 次;破碎(Scientz-ⅡD，寧波新芝)后用冷凍離心機(HC-2518R，安徽中科中佳)在1 200 r/min 下離心15 min;于4 ℃下保存上清液，次日測其SOD 活力。SOD 活力的測定按照南京建成生物工程公司試劑盒說明進行，單位為U/mgprot，所用儀器為紫外分光光度計(SP-752，上海光譜)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對水華微囊藻葉綠素α 含量的影響

經(jīng)測定和計算可得，對照組和香蒲各處理組的葉綠素α 的初始值為(0. 685 ±0. 132)mg/L。由圖1a 可知對照組和不同濃度香蒲處理組的葉綠素α 含量總體呈上升趨勢，但隨著處理時間的延長，處理組葉綠素α 含量的增長率有所下降，高濃度處理組(40 g/L)下降也不明顯，說明香蒲水浸提液對水華微囊藻的葉綠素α 雖有一定的破壞但作用不強。

經(jīng)測定和計算可得，對照組和穗狀狐尾藻各處理組的葉綠素α 的初始值為(1. 328 ±0.015)mg/L。由圖1b 可知與對照組相比，穗狀狐尾藻較低濃度處理組(5、10 和20 g/L)葉綠素α含量沒有太大變化，而較高濃度處理組(30 和40 g/L)葉綠素α 含量則明顯下降，說明較高濃度的穗狀狐尾藻水浸提液對水華微囊藻的葉綠素α 產(chǎn)生了破壞作用。

葉綠素α 在光合作用中承擔著吸收和轉(zhuǎn)化光能的作用，其含量常與藻細胞的生長狀態(tài)和光合作用密切相關(guān)［16-18］。當藻體受到環(huán)境脅迫時，反映其生長狀態(tài)和光合作用的葉綠素α 含量就會發(fā)生變化。由試驗結(jié)果可知，在一定程度上兩種植物水浸提液對水華微囊藻葉綠素α 含量存在著低濃度促進和高濃度抑制的作用。研究表明大多數(shù)植物化感物質(zhì)會對光系統(tǒng)Ⅱ產(chǎn)生影響，低濃度的化感物質(zhì)可能有利于藻類葉綠素生化合成進而促進光合作用和藻類生長，而高濃度化感物質(zhì)通過破壞藻類的葉綠素，減少其同化產(chǎn)物從而抑制藻類生長［19，20］。有報道鳳眼蓮(eichhornia crassipes)根系附著的藻細胞中葉綠素α 的含量明顯下降，而其降解產(chǎn)物脫鎂葉綠素α 酸酯的含量升高［21］，這表明化感物質(zhì)可能促進了葉綠素α 的降解。從試驗結(jié)果看，兩種植物水浸提液對水華微囊藻葉綠素α 的破壞程度有差異，香蒲的作用不及穗狀狐尾藻，這也提示我們在實際應(yīng)用中可有所選擇。

2.2 對水華微囊藻SOD 活性的影響

經(jīng)測定和計算可得，對照組和香蒲各處理組的初始SOD 為(18.183 ±0.122)U/mgprot。由圖2a可知與對照組相比，香蒲各濃度處理組SOD 活性都有升高的趨勢，到第4 d 時，SOD 活性又回落。說明香蒲水浸提液對水華微囊藻起到了一定的脅迫作用，使其產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，SOD 活性隨之升高，以保護藻細胞。

圖1 不同濃度香蒲和穗狀狐尾藻水浸提液對水華微囊藻葉綠素α 含量的影響Fig.1 Effects of Different Concentrations of Typha Orientalis and Myriophyllum Spicatum Extracts on Chlorophyll α Content of Microcystis Flosaquae

經(jīng)測定和計算可得，對照組和穗狀狐尾藻各處理組的SOD 初始值為(0. 331 ±0. 020)U/mgprot。由圖2b 可知與對照組相比，穗狀狐尾藻各濃度處理組SOD 活性也都出現(xiàn)升高的趨勢，不同濃度處理組SOD 活性都有上升趨勢，且具有劑量效應(yīng)，濃度越高SOD 活性升高的趨勢越大，至第8 d 時，SOD 活性才開始下降，但均低于對照水平。說明穗狀狐尾藻水浸提液對水華微囊藻起到了脅迫作用，而且其作用強于香蒲水浸提液。

SOD 能及時清除細胞在受脅迫過程中產(chǎn)生的過量超氧陰離子(O2-)，抑制膜脂的過氧化反應(yīng)，使機體免受活性氧的損害，是機體內(nèi)重要的保護酶。藻細胞在受到環(huán)境脅迫時，其細胞活性氧的產(chǎn)量會增加，抗氧化體系不及時清除這些活性氧，就會導(dǎo)致植物細胞內(nèi)發(fā)生過氧化反應(yīng)，尤其是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細胞內(nèi)膜系統(tǒng)，導(dǎo)致細胞死亡。本試驗結(jié)果表明將植物水浸提液加入藻液時，處理組SOD 活性上升，表明細胞內(nèi)氧自由基濃度上升，為了清除這些過量的氧自由基，SOD 活性也隨之上升，當清除完過多的超氧陰離子后，其活性也隨之下降。然而當細胞內(nèi)氧自由基濃度超過一定范圍后，機體自身的抗氧化體系不能完成清除，則機體功能不能恢復(fù)，從而抑制了藻細胞生長繁殖［22］。

圖2 不同濃度香蒲和穗狀狐尾藻水浸提液對水華微囊藻SOD 活性的影響Fig.2 Effects of Different Concentrations of Typha Orientalis and Myriophyllum Spicatum Extracts on SOD Activity of Microcystis Flosaquae

3 結(jié)論

(1)香蒲和穗狀狐尾藻水浸提液低濃度處理(5、10 和20 g/L)對水華微囊藻的葉綠素α 影響不明顯或略有促進作用，高濃度處理(30 和40 g/L)則有明顯的抑制作用。

(2)香蒲和穗狀狐尾藻水浸提液處理對水華微囊藻的SOD 活性有明顯影響，且存在劑量效應(yīng)，濃度越高影響越大。

(3)從本試驗對葉綠素α 和SOD 活性的研究結(jié)果可知穗狀狐尾藻水浸提液對水華微囊藻的化感抑制作用要強于香蒲。

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