陳 靜,程寧寧,郁 慧,許東芳,林靜

(1.上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院 上海 200234； 2.上海師范大學 跨學科研究中心,上海 200234)

配位化學打破了傳統(tǒng)無機化學和有機化學的界線,配位化學從60年代起就成為了生物無機化學的基礎(chǔ),與生命科學密切結(jié)合;一些具有特殊功能(光、電、磁、信息存儲等)的功能性配合物也是當前配位化學的研究熱點[1-3].因此,配位化學成為了近代化學中最活躍的前沿學科之一[4-6].

銅(Cu)屬于過渡金屬,是人類發(fā)現(xiàn)最早的金屬之一.銅與人類的生活密不可分,不僅是生命體必須的元素之一[7-8],更是人類生存的必須元素之一.銅的醫(yī)學用途一直被人們所重視.銅也具有很強的抗菌、抗癌作用.銅自身具有很好的生物活性,選擇一定結(jié)構(gòu)、具有生物活性的配體[9-13],形成穩(wěn)定的配合物后,由于配體與中心離子間的協(xié)同作用[14-15],會增強配體及銅的生物活性.

1-苯基-3-甲基-4-苯甲?；?5-吡唑啉酮能提供具有較強配位能力的O、N原子,它形成的配合物具有具有較好的生物活性[16-18].此類配合物的脂溶性比較好,易穿透細胞膜的雙脂質(zhì)層結(jié)構(gòu),進入細胞體內(nèi)后可破壞細胞的正常結(jié)構(gòu),導致正常細胞死亡,以此達到抗菌等藥效[18-19].2,6-吡啶二羧酸作為配體亦可提供多個配位點,N、O均可參與配位,與金屬離子以配位鍵結(jié)合后可形成穩(wěn)定的螯合物[19-21],2,6-吡啶二羧酸也具有一定的生物活性[19,23-25].

本研究合成了一個新型的三元配合物,探討了這個配合物的光譜學性質(zhì),研究了其與細菌以及與DNA的作用方式與機制.

1 實驗部分

1.1 試劑

CuCl2·2H2O,2,6-吡啶二羧酸,1-苯基-3-甲基-4-苯甲?；?5-吡唑啉酮,N,N-二甲基甲酰胺 (DMF),NaOH,無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司),均為分析純;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙堡肉湯培養(yǎng)基、沙堡瓊脂培養(yǎng)基,生化試劑(上海疾病預(yù)防與控制中心);革蘭氏陰性細菌大腸桿菌(8099) 、革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌(ATCC6538P)均由中國科學院上海藥物研究所提供.

1.2 測試儀器

德國Elementar Vario EL III型元素分析儀;美國Nicolet公司AVATAR 380型FT-IR紅外光譜儀(KBr壓片,攝譜范圍4000～400 cm-1);美國Perkin-Elmer17型紫外可見光譜儀;美國Varian公司VISTA-MPXICP-OES型電感耦合等離子體發(fā)射儀; 日本Ulvac-Phi公司PHI-5000 VersaProbe型X射線光電子能譜;熱重-差熱分析采用美國PerkinElmer Pyris Diamond TG/DTA熱分析儀;透射電鏡采用 日本電子JEM-2010型透射電子顯微鏡;XRD采用Rigaku公司D/Max-2200型X-射線衍射儀,銅靶(Cu-Kα,1.54056?),管壓40 kV,管流80 Ma,掃描速度0.3°/s;美國Varian公司Gray 4000E熒光光度分析儀.

1.3 配合物的合成

將2 mmol 1-苯基-3-甲基-4-苯甲酰基-5-吡唑啉酮(PMBP)溶解在無水乙醇中,用堿調(diào)節(jié)pH≈6.5,然后滴加2 mmol的CuCl2乙醇溶液,60℃下攪拌1 h左右.慢慢滴加2 mmol 2,6-吡啶二羧酸(H2PDA)的二鈉鹽到上述體系中,攪拌3h左右,停止反應(yīng),冷卻后過濾,產(chǎn)物在濾液中析出,抽濾后干燥后保存,產(chǎn)率61%.

2 結(jié)果與討論

2.1 元素分析

配合物中C、N、H含量可以由元素分析儀測定得出實驗值,銅的百分含量由ICP測出,各元素百分含量測定的實驗值見表1,表1中數(shù)據(jù)顯示出C、H、N、Cu 4種元素在結(jié)構(gòu)式中所占的百分含量其理論值與實驗值基本一致.初步推測銅吡唑啉酮雜環(huán)配合物的可能結(jié)構(gòu)式為Na[Cu(PMBP)(PDA)](PMBP為失去一個H的HPMBP,參與配位后的1-苯基-3-甲基-4-苯甲?；?5-吡唑啉酮;PDA表示H2PDA失去了2個-COOH上的2個H參與配位后的2,6-吡啶二羧酸).

表1 吡唑啉酮雜環(huán)配合物Na[Cu(PMBP)(PDA)]的元素分析

注:括號內(nèi)是理論值

配合物的性狀和溶解性與配體明顯不同.銅吡唑啉酮雜環(huán)配合物呈現(xiàn)為深綠色粉末狀.配合物與配體間的溶解性差異,室溫下,HPMBP溶于乙醇,H2PDA溶于水,但銅的配合物卻難溶于水、乙醇、乙腈、丙酮等溶劑,微溶于DMSO、DMF、濃鹽酸等溶劑.

2.2 紅外光譜數(shù)據(jù)

本實驗選用KBr壓片法,測試波數(shù)為4000～400 cm-1,詳見表2,配合物與配體的特征吸收頻率明顯不同.配合物中出現(xiàn)了新的M-O和M-N特征峰,表明Cu參與了配位[26].3058 cm-1為HPMBP烯醇結(jié)構(gòu)中的-OH峰,HPMBP的νC=O從1599 cm-1左右移至約1620 cm-1左右,說明C=O參與了配位;HPMBP的νC=C從1495 cm-1左右移至約1575 cm-1左右,νC-O從1281 cm-1左右移至約1000 cm-1左右.以上變化都表明了HPMBP結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,氧原子可能與銅參與了配位[27].

H2PDA的νc=o與νasCOOH在紅外譜圖中出現(xiàn)了重合,產(chǎn)生了寬而強的紅外特征峰,在配合物中該特征吸收頻率明顯降低;配合物中νC=N波數(shù)較配體H2PDA的1573 cm-1有所降低,是由于配合物較H2PDA中N電子云密度有所降低,使H2PDA的C=N波數(shù)降低;配合物中Δν(νasCOO--νsCOO-)均大于200 cm-1,小于H2PDA的Δν值285 cm-1,而且配合物中仍存在H2PDA的C=O伸縮振動峰,說明H2PDA中COOH以單齒形式與銅配位[28-30],參與配位的O為COOH中-OH上的O.

表2 吡唑啉酮雜環(huán)配合物的紅外特征峰 (cm-1)

2.3 紫外光譜譜圖

室溫下,將配合物及配體溶解在DMF中,所測結(jié)果見圖1,可見配合物與配體特征峰差別明顯.HPMBP在240 nm、278 nm處產(chǎn)生最大吸收峰,H2PDA在270 nm出現(xiàn)最大吸收峰.

配合物在276 nm處出現(xiàn)寬吸收峰,400～500 nm處仍有光譜吸收,與配體相比發(fā)生了明顯變化,推斷可能形成了新的產(chǎn)物.

2.4 XRD譜圖

圖2為配體與配合物的XRD比較圖.圖2顯示了銅配合物Na[Cu(PMBP)(PDA)]與配體峰的明顯差異,說明了HPMBP、H2PDA在與CuCl2·2H2O反應(yīng)時可能生成了新物相,而且Na[Cu(PMBP)(PDA)]的衍射峰強度很高,衍射角也比較清晰,所以Na[Cu(PMBP)(PDA)]的結(jié)晶度相對較好.

圖1 配體與Na[Cu(PMBP)(PDA)]的UV圖

圖2 配體與Na[Cu(PMBP)(PDA)]的XRD圖

2.5 XPS數(shù)據(jù)

配體及配合物的電子結(jié)合能數(shù)據(jù)見表3.HPMBP羰基中的O結(jié)合能是531.37 eV,H2PDA中-COOH的O結(jié)合能為532.04 eV,配合物中O結(jié)合能總體較HPMBP、H2PDA中O有所降低,原因是HPMBP中羰基O、H2PDA羧基上-OH去質(zhì)子后的O均與Cu2+參與配位,2個配體的O負電性增強,電子云密度增大,因此結(jié)合能降低;H2PDA中N結(jié)合能為399.09 eV,銅配合物中N結(jié)合能都增大,是由于N與中心離子配位后電子云密度降低; Na[Cu(PMBP)(PDA)]中Cu的結(jié)合能卻比CuCl2·2H2O的Cu結(jié)合能有所增大,原因是電子云總體偏向配體,導致結(jié)合能降低.

表3 配體與吡唑啉酮雜環(huán)配合物的電子結(jié)合能數(shù)據(jù) (eV)

2.6 TG-DTA分析

實驗條件:空氣氣氛,流速是100 mL·min-1,升溫范圍25～1000 ℃,升溫速率10 ℃·min-1.

表4 吡唑啉酮雜環(huán)配合物的TG-DTA數(shù)據(jù)

注:括號內(nèi)是理論值

表4數(shù)據(jù)顯示配合物總失重率理論值與實測值基本一致.

圖3 Na[Cu(PMBP)(PDA)]的差熱-熱重圖

Na[Cu(PMBP)(PDA)]在270 ℃之前未出現(xiàn)吸熱峰和失重現(xiàn)象,說明配合物是不含結(jié)晶水和配位水的(圖3);表4中數(shù)據(jù)顯示Na[Cu(PMBP)(PDA)]的熔化吸熱峰出現(xiàn)在285 ℃,從而可推斷出Na[Cu(PMBP)(PDA)]的熱穩(wěn)定性較配體是有所提高的,470～625 ℃、645～670 ℃分別對應(yīng)Na[Cu(PMBP)(PDA)]的分解放熱峰;最終銅吡唑啉酮雜環(huán)配合物的氧化分解產(chǎn)物為CuO和Na2O,總失重率的理論值基本符合實驗值.

2.7 TEM圖

圖4所示為Na[Cu(PMBP)(PDA)]的TEM圖,可見銅吡唑啉酮雜環(huán)配合物為微米級片狀結(jié)構(gòu).由于配合物結(jié)構(gòu)式中包含芳香環(huán)剛性平面,且為片狀結(jié)構(gòu),若其具有一定的生物活性,能與DNA發(fā)生作用,則可初步判斷它與DNA的結(jié)合模式可能是插入形式[31].

圖4 Na[Cu(PMBP)(PDA)]的TEM圖

2.8 抑菌試驗

選用抑菌圈法和營養(yǎng)肉湯稀釋法比較了配合物與配體的抑菌活性,溶劑選用DMF,實驗結(jié)果見表5.從表5數(shù)據(jù)可得出結(jié)論:(1)吡唑啉酮雜環(huán)配合物對E.c.和S.a.均表現(xiàn)為中等抑制效果;(2)配合物的抑菌效果均優(yōu)于配體HPMBP、H2PDA,說明配合物形成后,Cu2+與配體間的協(xié)同作用使抗菌效果有所增強.

表5 配體及吡唑啉酮雜環(huán)配合物的抑菌圈直徑及MIC數(shù)據(jù)

2.9 配合物與DNA的作用方式

2.9.1 紫外光譜法

分別配制濃度為1.0×10-5、2.5×10-5、5.0×10-5、10.0×10-5的吡唑啉酮雜環(huán)配合物,將其與固定濃度的CT-DNA混合后在室溫下放置30 min,以保證配合物與DNA的充分作用.圖5為Na[Cu(PMBP)(PDA]與CT-DNA作用后的UV譜圖,初步推斷出Na[Cu(PMBP)(PDA]也是以插入方式與DNA結(jié)合的,結(jié)合TEM圖,進一步驗證了片狀結(jié)構(gòu)的配合物可能會以插入形式與DNA結(jié)合.

2.9.2 熒光光譜法

參照文獻[32-33],在激發(fā)波長為300 nm,狹縫寬度Ex=Em=10 nm,450 V電壓,400～800 nm范圍內(nèi)掃描EB與CT-DNA作用以及配合物與CT-DNA結(jié)合后的熒光譜圖.EB濃度為2×10-4mol·L-1、CT-DNA的濃度為1.5×10-4mol·L-1,二者濃度保持不變,配制6份溶液,分別為EB-DNA,1.0×10-5mol·L-1配合物+EB-DNA,2.5×10-5mol·L-1配合物+EB-DNA,5.0×10-5mol·L-1配合物+EB-DNA,10.0×10-5mol·L-1配合物+EB-DNA,15.0×10-5mol·L-1配合物+EB-DNA,在室溫下放置30 min后,測試其熒光性質(zhì),為Na[Cu(PMBP)(PDA)]與DNA作用后的熒光譜圖,圖6中可觀察到Na[Cu(PMBP)(PDA)]隨著配合物的濃度增加出現(xiàn)了明顯的熒光猝滅現(xiàn)象,進一步證明了吡唑啉酮雜環(huán)配合物與CT-DNA的結(jié)合方式可能為插入模式[34-35].

圖5 Na[Cu(PMBP)(PDA]與DNA作用的UV圖

圖6 Na[Cu(PMBP)(PDA)]與DNA作用的熒光光譜圖

3 結(jié) 論

(1) 本研究合成了銅的吡唑啉酮雜環(huán)配合物,并通過元素分析、IR、UV、XRD、XPS、TG-DTA、TEM等一系列的表征初步確定了配合物結(jié)構(gòu)式可能為Na[Cu(PMBP)(PDA].

(2) 對配合物進行了抗菌活性測試,測試結(jié)果顯示配合物表現(xiàn)為中等的抑菌活性,由于配體與Cu2+間的協(xié)同作用,配合物的抑菌活性要優(yōu)于配體; Na[Cu(PMBP)(PDA]對S.a.的抑制效果相對E.c.比較好.

(3) 通過光譜法測試得到的結(jié)果證明了吡唑啉酮雜環(huán)配合物可能是以插入模式與DNA結(jié)合的.

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