鄭亞潔,高 貝,夏群芳,周樹敏,張 衛(wèi)

(上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 上海市能源作物育種及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200444)

在擬南芥的花藥發(fā)育過程中,已知有一些轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控中起到?jīng)Q定性的作用[1]：如bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子,MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子等[2].其中MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子如：TDF1[3-5](TAPETAL DEVELOPMENTAND FUNCTION1)編碼的是MYB-R2R3家族的轉(zhuǎn)錄因子.它主要在絨氈層以及小孢子母細(xì)胞中表達(dá),突變體中因絨氈層發(fā)育異常,導(dǎo)致胼胝質(zhì)無法降解,使得小孢子聚集在花粉囊中,不能形成正常的花粉粒,最終引起雄性不育表型.

本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中得到了1株在非脅迫溫度范圍內(nèi)花粉育性受溫度顯著影響的擬南芥溫敏雄性不育突變體atms1[6].在16 ℃時(shí),該突變體育性與野生型相似,花粉全部可育；但隨溫度的升高,育性逐漸下降,到23 ℃時(shí),突變體花粉有一半表現(xiàn)為不育；而到27℃時(shí),突變體花粉則全部不育.經(jīng)過對突變基因的圖位克隆,發(fā)現(xiàn)該突變體在AT1G62940基因上的第四外顯子202 bp處發(fā)生點(diǎn)突變,由“G”變?yōu)椤癆”(圖1～2),ATMS1編碼的蛋白第398個(gè)氨基酸由野生型的甘氨酸變?yōu)樘於彼?

圖1 AT1G62940基因上的第四外顯子上發(fā)生點(diǎn)突變

本實(shí)驗(yàn)就是通過在擬南芥atms1突變體中過量表達(dá)TDF1反義RNA,結(jié)合對atms1溫敏雄性不育表型的分析,擬從遺傳分子水平初步探究其中的作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材 料

Col-0生態(tài)型擬南芥(Arabidopsisthaliana)及atms1溫敏雄性不育突變體種子由本實(shí)驗(yàn)室提供.

圖2 ATMS1 CDS序列上的突變位點(diǎn)

菌株DH5ɑ(E.Coli)和GV3101(Agrobacteriumtumefaciens)為本實(shí)驗(yàn)室自制感受態(tài)細(xì)胞并保存；載體pCAMBIA-1300為本實(shí)驗(yàn)室所有并改造后使用；載體pMD18-T、DNA Marker、各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶均購自TaKaRa公司.

1.2 方 法

1.2.1 植物cDNA的提取

Col野生型擬南芥23 ℃條件下培養(yǎng),待其抽薹后,取花序,迅速置于液氮中,Trizol法提取RNA,反轉(zhuǎn)錄得cDNA,Trizol等試劑及cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司.

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及TDF1基因片段的克隆

自www.arabidopsis.org網(wǎng)站上下載TDF1的CDS序列,大小為954 bp.根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)引物,上下游引物兩端分別添加SalI和XbaI酶切位點(diǎn).引物由上海生工生物工程公司進(jìn)行合成.

引物序列為: 上游F(SalI) 5′-GCGTCGACATGGGAAGACCTCCTTGTT-3′,

下游R(XbaI) 5′-CGTCTAGACTAATAATCGAAATCATTCAAGAG-3′.

采用PCR方法對目的序列進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增采用TaKaRa公司生產(chǎn)的KOD PCR擴(kuò)增試劑盒.

擴(kuò)增條件參數(shù)為:

由高保真聚合酶擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物割膠回收后,加PolyA并純化,與pMD18-T載體連接,得到pMD18-T-TDF1.采用熱激法將重構(gòu)的T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增,重組T質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后送往上海美吉公司進(jìn)行測序.

1.2.3 表達(dá)載體構(gòu)建

圖3為本實(shí)驗(yàn)室改造后的pCAMBIA-1300質(zhì)粒圖譜.首先,將p1300質(zhì)粒用SalI、XbaI進(jìn)行酶切并回收質(zhì)粒片段.然后從pMD18-T載體上切取測序正確的帶有SalI、XbaI酶切位點(diǎn)的TDF1 CDS片段,回收后連入p1300質(zhì)粒中,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行篩選和鑒定.

圖3 p1300 質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)示意圖

1.2.4 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與鑒定

采用熱激法將重組質(zhì)粒p35S:TDF1(-)轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中.在含有Rifa,Kana和Gen三重抗性的YEP固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測.將鑒定正確的菌落接種到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),利用浸染法[7-9]轉(zhuǎn)化擬南芥atms1雜合子植株,收取T0代種子.

1.2.5 陽性苗篩選及鑒定

用50 μg/mL潮霉素B(Hygromycin B)對轉(zhuǎn)化的T0代種子進(jìn)行篩選,待抗性板上長出陽性苗后,將其移入土中生長.直至抽薹后,取2～3片葉子,用Edwards一步抽提法提取植株基因組DNA,進(jìn)行遺傳背景鑒定.

引物序列為: 與突變體匹配上游F(M):5′-AGCCAATGTGTAATGCAAGA-3′,與WT匹配上游F(WT):5′-AGCCAATGTGTAATGCAAGG-3′,通用下游R:5′-TGGACGGCTCTAACCTTC-3′.

擴(kuò)增條件參數(shù)為:

1.2.6 花藥育性觀察

將陽性植株置于23 ℃的培養(yǎng)間生長,待其抽薹后,分兩組分別放到16、27 ℃的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2 d后重新置于23 ℃培養(yǎng)間中生長,取溫度處理時(shí)處于花藥發(fā)育第八期的花,用亞歷山大染色法處理后,觀察花粉育性.

1.2.7 過量表達(dá)植株Real-time PCR檢測

常溫培養(yǎng)擬南芥atms1突變體和p35S:TDF1(-)轉(zhuǎn)基因植物,抽薹后平均分成兩組,分別移至16和27 ℃處理24 h后,取花序,抽提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR的檢測,選用的儀器是BIORAD IQ5,管家基因UBQ10作為內(nèi)參,反應(yīng)體系為20 μL,如下：

SYBR Primix Ex Taq (2×) 10 μL

F primer (10×) 0.4 μL

R primer (10×) 0.4 μL

DNA 模板 2 μL

ddH2O 7.2 μL

TOTAL 20 μL

Real-time PCR 擴(kuò)增條件參數(shù)為：

95 ℃ 30 s

表1 Real-time PCR 所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段過量表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)合成引物的退火溫度,設(shè)計(jì)溫度梯度測試,得到最佳退火溫度為58 ℃,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到970 bp左右的目的條帶(圖4).目的片段連入pMD18-T質(zhì)粒,經(jīng)擴(kuò)增、篩選和鑒定后進(jìn)行測序,在NCBI網(wǎng)站上對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析,顯示匹配率100%；將目的片段連入pCAMBIA-1300質(zhì)粒,構(gòu)建成p35S:TDF1(-)過量表達(dá)載體,用XbaI、SalI酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切,得到約970 bp的條帶及剩余載體條帶(圖5),以上結(jié)果說明正確的目的基因被成功連入了pCAMBIA-1300質(zhì)粒,構(gòu)建成了反義RNA載體.

1:擴(kuò)增產(chǎn)物條帶;M：分子marker圖4 TDF1 CDS擴(kuò)增

1、2:p35S:TDF1(-) 過表達(dá)質(zhì)粒載體;M:分子marker圖5 p35S:TDF1(-) 表達(dá)載體的酶切鑒定

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

轉(zhuǎn)基因鑒定采用擴(kuò)增TDF1 CDS全長的引物,陽性苗中會擴(kuò)增出2個(gè)條帶,分別約為1230、970 bp,前者為TDF1的Genomic序列,后者為TDF1的CDS序列,為目的條帶.atms1背景鑒定采用實(shí)驗(yàn)室已有SNP引物(圖2),目的片段大小為523 bp,即：若使用F(M)/R、F(WT)/R引物同時(shí)PCR轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA,只有F(M)/R擴(kuò)增出目的條帶,則該植株為atms1突變體純合子；若只有F(WT)/R引物能夠擴(kuò)增出目的條帶,則該植株為野生型；若兩對引物都能擴(kuò)增出條帶,則該轉(zhuǎn)基因植株背景為atms1雜合子.對12株陽性苗基因組進(jìn)行PCR鑒定,顯示其中9株為轉(zhuǎn)基因植株,分別為1、2、3、4、5、6、8、9、10號(圖6),然后再將這9株植物進(jìn)行atms1背景的鑒定,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株1、2、3、4、5、8、9、10號為atms1雜合子,6號為野生型(圖7).

1～12:陽性苗;+:陽性對照;M:分子marker圖6 轉(zhuǎn)基因植物PCR鑒定

1～6、8～10：轉(zhuǎn)基因陽性苗;F(M)R:突變體基因擴(kuò)增引物;F(WT)/R:野生型基因擴(kuò)增引物圖7 轉(zhuǎn)基因植物atmsl背景鑒定

2.3 花藥育性觀察

將鑒定后1、2、3號陽性苗進(jìn)行傳代,在T3代植株中篩選獲得既是轉(zhuǎn)基因純合子又是atms1純合子背景的植株.通過溫度處理后,對花粉育性進(jìn)行觀察.結(jié)果顯示：atms1突變體在16 ℃時(shí)花粉粒飽滿呈紅色,育性良好(圖8A)；27℃時(shí)花藥中的花粉粒呈綠色,且降解呈碎片狀,表現(xiàn)為完全不育(圖8B)；而轉(zhuǎn)基因atms1植株的花藥花粉在16、27 ℃時(shí)育性都得到恢復(fù)(圖8C、D).

A、B：atms1突變體16、27 ℃處理的花藥;C、D：p35S:TDF1(-)轉(zhuǎn)基因atms1植株16、27 ℃處理的花藥(Bars為20 μm)圖8 不同溫度下轉(zhuǎn)基因植物的花粉亞歷山大染色

2.4 Real-time PCR

溫度處理后的atms1突變體和轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)Real-time PCR檢測結(jié)果顯示(圖9)：atms1突變體中TDF1的表達(dá)量16 ℃處理組遠(yuǎn)高于27 ℃處理組；而在p35S:TDF1(-)轉(zhuǎn)基因atms1中,16、27 ℃組TDF1的表達(dá)量與16 ℃atms1相比明顯下降,說明轉(zhuǎn)基因植株中TDF1的轉(zhuǎn)錄水平受到明顯下調(diào),但是與atms1突變體27℃的表達(dá)量比較,總體水平還是略有增加.另外,ATMS1m表達(dá)量在atms1中呈現(xiàn)16 ℃處理組高于27 ℃處理組,約為27 ℃處理組的5倍,而在p35S:TDF1(-)轉(zhuǎn)基因atms1中ATMS1m的表達(dá)量在16 ℃和27 ℃時(shí)都較atms1突變體27 ℃時(shí)有所增加,這說明ATMS1m的表達(dá)量的上升對于突變體atms1育性的恢復(fù)有積極的作用.

A:p35S :TDF1 (-) 轉(zhuǎn)基因植株和 atms1突變體中,TDF1的表達(dá); B：p35S :TDF1 (-) 轉(zhuǎn)基因植株和 atms1突變體中,ATMS1m的表達(dá)圖9 p35S:TDF1(-)轉(zhuǎn)基因植物和atms1中TDF1、ATMS1m的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

3 討 論

ATMS1是目前已知的第一個(gè)在非脅迫溫度變化范圍內(nèi)直接影響擬南芥雄性不育性狀的基因.在atms1突變體中,16 ℃時(shí)ATMS1mmRNA的積累量明顯高于27 ℃的積累量,表明轉(zhuǎn)錄水平上的變化可能導(dǎo)致了該突變體育性隨溫度不同而發(fā)生變化,即:27 ℃時(shí)花藥完全不育,23 ℃時(shí)呈現(xiàn)部分不育,16 ℃時(shí)育性與野生型相同.

TDF1是MYB-R2R3家族的轉(zhuǎn)錄因子.它的突變體中胼胝質(zhì)無法降解使得小孢子聚集在花粉囊中,表現(xiàn)為完全不育[10].通過在atms1突變體中導(dǎo)入用于降低TDF1轉(zhuǎn)錄水平的反義RNA表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)在p35S:TDF1(-)轉(zhuǎn)基因植株中TDF1的表達(dá)量明顯下降,約為atms1突變體16 ℃時(shí)的四分之一,表明p35S:TDF1(-)這個(gè)反義RNA表達(dá)載體在擬南芥體內(nèi)有效地抑制了TDF1的表達(dá).但這種抑制作用還不足以使轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出tdf1突變體的表型[10]；Real-time PCR的結(jié)果顯示p35S:TDF1(-)反義RNA雖然抑制了TDF1的表達(dá),但與atms1突變體在27 ℃的情況比較,TDF1的表達(dá)量還是有所提高的,反應(yīng)到ATMS1m的表達(dá)水平上就更加明顯,p35S:TDF1(-)轉(zhuǎn)基因atms1中不論16 ℃還是27 ℃,ATMS1m的表達(dá)水平都高于atms1突變體在27 ℃的水平.這提示在擬南芥體內(nèi)ATMS1m的表達(dá)量可能存在一個(gè)閾值,低于此閾值時(shí),植株表現(xiàn)為完全不育,高于此閾值時(shí),對植株育性的影響較小.而TDF1又正調(diào)控于ATMS1m的表達(dá)；當(dāng)TDF1表達(dá)受抑制時(shí),ATMS1m的表達(dá)量也會減少,但只有當(dāng)ATMS1m表達(dá)量低于一定閾值時(shí),花粉的育性才會受到顯著影響.而這個(gè)閾值可能就是ATMS1m在27 ℃的表達(dá)水平.因此,本研究認(rèn)為TDF1對ATMS1m具有一定的正向調(diào)控作用,通過ATMS1m表達(dá)水平的變化最終影響花粉育性的變化,而對于其中更深入的調(diào)控機(jī)制則有待于進(jìn)一步的研究.

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