徐道蘭, 戴錫玲, 徐 穎, 王全喜

(上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院,上海 200234)

0 引 言

植物花器官的發(fā)育受花同源異型基因的調控,其大部分成員都屬于MADS-box基因家族[1].MADS-box基因在植物生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用,除了決定花器官特異性、開花時間和花芽的形成[2-5],還能夠調控植物的營養(yǎng)生長,如:果實形成[6-7]、種子色素沉積、內皮發(fā)育[8]和根發(fā)育[9]等.MADS-box基因家族成員根據(jù)序列結構特征分為2種類型;Ⅰ型和Ⅱ型,這2種類型的基因可能是在大約10億年前通過發(fā)生在植物和動物分化之前的一次基因復制產生的[10]. 植物Ⅰ型MADS-box基因通常含有1～2個外顯子,編碼的蛋白含有一個高度保守的SRF-like MADS域,但缺少K域.植物Ⅱ型MADS-box基因是多內含子和外顯子結構,根據(jù)結構和序列差異進一步分為MIKCc型和MIKC*型[11].該類基因編碼的蛋白主要由4部分組成:MADS域、I域、K域、C域[12].MADS域主要參與結合DNA蛋白質二聚化以及其他因子的功能[13].I域可以促進二聚體的轉錄因子與DNA結合[12,14].K域參與介導蛋白-蛋白雙螺旋的形成,從而促進二聚化的發(fā)生[13,15].C域末端的變化較大,但不同類的MADS-box基因常含有一些保守的基序,這些基序在蛋白復合體的形成和轉錄激活中起重要作用[16].

現(xiàn)今許多開花植物MADS-box基因的功能已進行廣泛而深入的研究,但對于非開花植物,該基因家族的研究還處于初步階段[17].為了探究缺少特異性花器官、擁有原始繁殖器官這類植物中MADS-box基因的功能,研究者們開始對苔蘚、蕨類和擬蕨類植物MADS-box基因進行探究[1,18-21].蕨類和擬蕨類,作為植物進化系統(tǒng)中的過渡類群,擁有一些區(qū)別于種子植物的原始特征[21].為了理解MADS-box基因隨著植物的進化自身的結構和功能發(fā)生了怎樣的改變,一些蕨類植物,如水蕨(Ceratopterisrichardii)、瓶兒小草(Ophioglossum)、江南卷柏(Selaginellamoellendorfii)、疏葉卷柏(Selagnellaremotifolia)中MADS-box基因已被克隆出來并用于進化分析[1, 19-21].本文作者選取水蕨屬(Ceratopteris)水蕨(Ceratopteristhalictroides)作為材料,以植物(尤其是蕨類植物)中已克隆出來的MADS-box基因作為參考,對水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box基因進行克隆,并與其他物種中的MADS-box基因進行結構特征的比較,分析該基因序列結構的變化,通過進化樹的構建補充完善植物MADS-box基因的進化圖譜.本研究的結果為蕨類植物的系統(tǒng)進化研究提供了參考和基礎資料.同時,也為MADS-box基因的進化和功能研究積累了資料.

1 材料和方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

本研究所用的植物材料為水蕨(Ceratopteristhalictroides)配子體.水蕨孢子從成熟孢子體上收集,接種于MS培養(yǎng)基上后,置于相對濕度為75%、晝夜溫度為26 /22 ℃的人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d左右,收集其幼嫩配子體材料.

1.2 RNA 提取和cDNA 合成

收集的水蕨配子體材料于液氮中研磨至細粉狀,總RNA的提取參照康為世紀植物RNA提取試劑盒操作步驟.提取出來的總RNA加入去DNA酶(TaKaRa),37 ℃ 30 min處理以去除其中的DNA雜質.提取的RNA 通過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計進行完整度和純度的檢測.所有的檢測結果顯示所提取的總RNA完整且純度較高(1.8

cDNA的合成使用SuperscriptⅢ反轉錄試劑盒(Invitrogen),接頭引物為T17AP引物 (5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3′).

1.3 PCR擴增CtMADS1和CtMADS2基因的核心片段

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的水蕨(Ceratopterisrichardii)MADS-box基因設計兩對特異性引物.上游引物:MADS1a (5′-CGGTCCGACGCATTTCTA-3′)和MADS1b(5′-TTCTTTCCGCAGATTAGTT-3′).下游引物: MADS2a(5′-TCCTGCCTTCCGCTTTGA-3′)和MADS2b(5′-CCACATTATCCGTTGAGC-3′).PCR擴增體系為50 μL:1 μL cDNA、0.2 μmol·L-1引物、1×LA PCR buffer(Mg2+plus)、 2.5 mmol·L-1dNTPs和2.5 U LA Taq聚合酶.PCR反應程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min.PCR產物用1%含有溴化乙錠(EB)的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測.將含有目的條帶的片段進行純化,連接pEASY-T5載體(Trans)、轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中,挑取的單克隆LB培養(yǎng)基中搖床37 ℃培養(yǎng)14～16 h后,菌液送華大公司測序.

1.4 RACE技術獲得CtMADS1和CtMADS2基因的3′和5′端

3′-RACE采用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA 擴增試劑盒,具體步驟參照說明書.設計的兩對內部特異性引物分別為:CtMADS1F1(5′-AAGTTACAATCAACCGCCTCC-3′),CtMADS1F2(5′-GCAGGTGACATATTCAAAGCG-3′),CtMADS2F1(5′-GCATTCTTTCCGCAGATTAGTT-3′),CtMADS2F2(5′-CGCAATGGTGAGGAGGAAGAT-3′).PCR反應程序為:94 ℃預變性2 min ;94 ℃變性30 s,68 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,25個循環(huán);72 ℃終延伸9 min.5′-RACE參照Invitrogen公司的5′-RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0試劑盒的說明書進行.設計的兩對內部特異性引物分別為:CtMADS1R1(5′-GGCGGTTGATTGTAACTTGTTT-3′),CtMADS1R2(5′-GCTTTGAATATGTCACCTGCT-3′),CtMADS2R1(5′-CTTGATCTTCCTCCTCACCATT-3′),CtMADS2R2(5′-CTTATCCACATTATCCGTTGAGC-3′).PCR反應程序為:94 ℃預變性2 min ;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,35個循環(huán);72 ℃終延伸7 min.PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測.將含有目的片段純化、連接pEASY-Blunt載體(Trans)、轉化后,菌液送華大公司測序.

1.5 CtMADS1和CtMADS2基因ORF擴增

CtMADS1和CtMADS2基因的ORF擴增分別采用的是兩對特異性引物P1(5′-ATGGGGAGAGTGAAGTTGGCG-3′)和P2(5′-TTAAGTATTGTCATTGAACCATG-3′), P3(5′-ATGGTGAGGAGGAAGATCAAG-3′) 和P4(5′-CTACTCAGAGGCAGGTGATTCAT-3′) .PCR擴增體系為50 μL:2 μL cDNA、0.3μmol·L-1specific primers、1×PCR buffer、1.5 mmol·L-1MgSO4、2 mmol·L-1dNTPs和1 U KOD 聚合酶.PCR反應程序為:94 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,35個循環(huán);68 ℃終延伸7 min.PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測.將含有目的片段純化、連接pEASY-Blunt載體(Trans)、轉化后,菌液送華大公司測序.

1.6 序列同源性比較和系統(tǒng)進化分析

MADS-box蛋白序列的比對采用默認參數(shù)的ClustalX軟件[22],并進行一些相應的調整,從而探究水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box蛋白序列與水蕨(Ceratopterisrichardii)以及其他物種中MADS-box蛋白的序列差異.進化樹的構建采用MEGA5.2[23]軟件的maximum likehood (ML)方法,參數(shù)設置如下:Kimura 2-parameter model,complete deletion和bootstrap(1000 replicates)[24],將其蛋白序列與GenBank數(shù)據(jù)庫已登錄的其他物種MADS-box蛋白序列用ClustalW法進行比對后生成系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結 果

2.1 基因全長的克隆

通過3′和5′RACE獲得2條水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box基因cDNAs全長序列,CtMADS1和CtMADS2(圖1,2).CtMADS1全長1162 bp,CtMADS2全長1314 bp(圖3,4).CtMADS1和CtMADS2的起始密碼子分別位于距N端281 bp和282 bp處.CtMADS1和CtMADS2與其他典型的MIKCc和MIKC*型基因比較結果顯示:CtMADS1屬于典型的MIKC*型MADS-box基因,擁有延伸的I域,而CtMADS2屬于典型的MIKCc型,缺少延伸的I域(圖5).

A:核心片段的擴增; B:3′ RACE擴增; C:5′RACE擴增; D:ORF擴增; M:DL 2000 Marker; 1:核心片段的擴增產物; 2:3′ RACE的擴增產物;3:5′ RACE的擴增產物; 4:P1和P2的擴增產物圖1 CtMADS1基因片段的凝膠電泳分析

與已經(jīng)報道的水蕨(Ceratopterisrichardii)MADS-box序列進行比較分析,CtMADS1與其M16高度相似,而 CtMADS2 與其CMADS3同源性較高.然而,其中還是存在一些差異,可能不能被當作同一基因.當然,這還需要更多的證據(jù)去證明.

2.2 序列同源性比較和系統(tǒng)進化分析

現(xiàn)今的系統(tǒng)進化研究已揭示了MADS-box基因家族的主要分支.為了確定水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box基因與其他物種MADS-box基因的進化關系,將得到的2條MADS-box基因與來自于部分苔蘚、蕨類、裸子和被子植物中MADS-box基因構建無根ML 進化樹(圖6).結果顯示選取的70條MADS-box基因可以分為2種類型,MIKCc和MIKC*型,這與之前的系統(tǒng)進化樹一致.對于本實驗克隆得到的2條水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box 基因,系統(tǒng)進化分析也支持CtMADS1屬于MIKC*型, CtMADS2 屬于MIKCc型.

A:核心片段的擴增; B:3′ RACE擴增; C:5′RACE擴增; D:ORF擴增; M:DL 2000 Marker; 1:核心片段的擴增產物; 2:3′ RACE的擴增產物; 3:5′ RACE的擴增產物; 4:P3和P4的擴增產物圖2 CtMADS2基因片段的凝膠電泳分析

圖3 CtMADS1的核苷酸和氨基酸序列下劃線部分為MADS域和K域

圖4 CtMADS2的核苷酸和氨基酸序列(下劃線部分為MADS域和K域)

MADS域和K域均以單下劃線標記.CMADS3 和M16來自于水蕨(Ceratopterisrichardii),LAMB2和LAMB4來自于石松(Lycopodium),AGAMOUS和 APETALA1來自于擬南芥(Arabidopsisthaliana),PPM3和PPM4來自于小立碗蘚(Physcomitrella).其中,CMADS3、M16、LAMB2、LAMB4、AGAMOUS和APETALA1是典型的MIKCc型,PPM3和PPM4是典型的MIKC*型.

除此之外,系統(tǒng)進化分析還揭示了水蕨屬的MADS-box基因組成3個不同的族,散布在種子植物的MADS-box基因家族中;研究者推測蕨類植物與種子植物共同祖先的MADS-box基因經(jīng)過多次獨立復制產生目前數(shù)目繁多的MIKC型基因,從而產生現(xiàn)存的蕨類植物與種子植物.

3 討 論

本研究克隆得到的2條水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box基因豐富了MADS-box基因家族.比對結果表明這2條CtMADSs與其他物種MADS-box基因無論在核苷酸還是氨基酸序列上都有一些差異.根據(jù)系統(tǒng)進化樹的分析,CtMADS1屬于MIKC*分支,與水蕨(Ceratopterisrichardii)M16和M13,小立碗蘚(Physcomitrellapatens)PpMADS2、PpMADS3、PPM3和PPM4 同源性較高.CtMADS2屬于MIKCc分支,與水蕨(Ceratopterisrichardii)CMADS3和CMADS4,石松(Lycopodium)LAMB2、LAMB4和LAMB6[20,25]同源性較高.

然而,系統(tǒng)進化關系再建并沒有為蕨類植物MADS-box基因的功能研究提供明確的線索.Northern和原位雜交手段已經(jīng)探索出一些水蕨屬MADS-box基因的表達[20,26].結果顯示:其大多數(shù)MADS-box基因在其完整的生活史,即孢子體和配子體中均有表達.這種表達模式和種子植物中MADS-box基因特異性表達于特定器官不同[27].這可能對于植物的進化非常重要.本研究因此假設蕨類植物,沒有花器官,已經(jīng)擁有至少一種MIKC型MADS-box基因.這些基因不是花器官決定基因,但在控制發(fā)育和細胞分化等方面具有更廣泛的功能.伴隨著植物的進化,MADS-box基因的器官特異性表達模式導致了現(xiàn)存開花植物的產生.當然,這還需要更多蕨類植物MADS-box基因功能方面的研究來補充完善對這個家族的猜想,這同時也是后續(xù)研究計劃.

圖5 克隆的水蕨(Ceratopteris thalictroides)CtMADSs蛋白序列與部分苔蘚、蕨類和被子植物MADS-box蛋白的多序列比對

圖6 MIKC型MADS-box基因的ML樹分析自展支持率顯示在各分支上(分支長度正比于估計的進化距離,物種名稱顯示在各分支MADS-box基因同系物的后面括號里)

然而,對于完全理解MADS-box基因在植物進化過程中所扮演的角色還有很長的路要走.相比較于種子植物,至今對于非開花植物中的苔蘚和蕨類植物這類陸地植物進化過程中非常重要部分的MADS-box基因知之甚微.

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