周 麗，張留記，屠萬倩，孫丹丹

(1.河南中醫(yī)學(xué)院2011 級碩士研究生，河南 鄭州450008;2.河南省中醫(yī)藥研究院，河南鄭州450004)

近年來，隨著人民生活水平的提高，高脂血癥的發(fā)病率逐年上升，且有患者年輕化的趨勢［1］。脈脂康膠囊為河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑室研制品種，由人參、川芎、當歸、山楂、制何首烏等5 味中藥組成。全方標本兼治，通補結(jié)合，具有益氣補血［2］、活血化瘀［3-4］、健脾化積［5］、降脂通便［6-7］等功能，適用于高脂血癥人群，對動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病具有較好的預(yù)防保健作用。本研究根據(jù)文獻資料所報道的各藥味有效成分的特性及相關(guān)藥理作用，設(shè)計實驗，以期優(yōu)選出脈脂康膠囊的最佳提取工藝。

1 藥品、試劑與儀器

人參皂苷Rb1對照品(批號110704 -200318)、人參皂苷Re 對照品(批號110754 -200421，含量測定用對照品)、人參皂苷Rg1對照品(批號110703-200323，含量測定用對照品)、2，3，5，4＇-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D 葡萄糖苷對照品(批號110844 -200404，含量測定用對照品)，均購自中國藥品生物制品檢驗所。甲醇、乙腈均為色譜純，均購自德國Merck 公司;其他試劑均為分析純;蒸餾水購自鄭州市大成蒸餾水廠;重蒸水為自制。Waters 2695 高效液相色譜儀(2996 紫外檢測器，Empower Ⅱ色譜工作站軟件)，美國Waters 公司產(chǎn)品;恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品;GT -350W 超聲波提取器，濟寧科技超聲電子有限公司產(chǎn)品;日本島津LIBROR-160DPT 萬分之一天平，產(chǎn)地日本;Mettler Toledo 十萬分之一天平，產(chǎn)地瑞士;DZTW 調(diào)溫電熱套，北京永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品;揮發(fā)油提取器，上海玻璃儀器廠產(chǎn)品;DL-1 萬用電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品;101 -2 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海市實驗儀器廠產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 山楂、人參乙醇提取工藝的考察

2.1.1 乙醇提取工藝條件正交試驗法優(yōu)選

在乙醇提取工藝研究中，選取乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)4 個主要影響因素，每個因素選擇3 個水平，按照L9(34)表進行正交試驗。見表1。以人參皂苷Rb1、Rg1和Re 為測定指標優(yōu)選最佳提取工藝。

表1 乙醇提取工藝因素水平表

按處方比例稱取山楂和人參，采用L9(34)正交試驗表，按各試驗號參數(shù)進行實驗，提取液過濾，濾液濃縮至無醇味，轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，即得1 ～9 號乙醇提取液。

2.1.2 乙醇提取液中人參皂苷Rb1、Rg1和Re 的含量測定

色譜條件:色譜柱為美國熱電Hypersil C18ODS填料柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈—水溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表2;體積流量1.0 mL/min;檢測波長203 nm;柱溫40 ℃;理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于3 000。對照品和供試品色譜圖見圖1、圖2。

表2 梯度洗脫時間程序

圖1 人參皂苷(Rg1、Re、Rb1)對照品HPLC 圖

圖2 人參乙醇提取供試品HPLC 圖

對照品溶液的制備:精密稱取人參皂苷Rb1、Rg1、Re 對照品2.9，1.39，1.10 mg，置5 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成每毫升含人參皂苷Rb10.580 mg、Rg10.278 mg、Re 0.220 mg 的混合溶液，即得。

標準曲線:精密吸取對照品溶液2，5，10，15，20 μL，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定人參皂苷Rb1、Rg1、Re 的吸收峰峰面積積分值，以進樣量為橫坐標(X)，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，進行回歸處理，結(jié)果見下表3。

表3 人參皂苷Rb1、Rg1、Re 線性范圍考察

供試品溶液的制備及測定:分別精密吸取2.1.1項下1 ～9 號乙醇提取液各20 mL;用乙酸乙酯振搖提取4 次，每次20 mL;棄去乙酸乙酯液，水層用水飽和正丁醇振搖提取4 次，每次20 mL;合并正丁醇液;用體積分數(shù)40%的氨試液充分洗滌2 次，每次30 mL;棄去氨液;正丁醇液蒸干;殘渣加甲醇溶解，移至5 mL 量瓶中;加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，即得。精密吸取各供試品溶液10 μL 注入液相色譜儀，按照上述色譜條件進行測定，并計算提取液中人參皂苷Rb1、Rg1和Re的總含量，結(jié)果見表4。

表4 乙醇提取正交試驗設(shè)計和人參總皂苷含量測定結(jié)果

根據(jù)上表可知，因素B 的極差R 值最小，以B列為誤差列，對正交試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表5。

表5 乙醇提取正交試驗方差分析表

結(jié)果:由試驗結(jié)果的直觀分析和方差分析可知，在乙醇提取過程中對人參皂苷總含量影響因素的大小順序為A ＞C ＞D ＞B，因素A、C 對試驗結(jié)果均有顯著性影響。根據(jù)正交試驗結(jié)果，選取顯著因素A、C的最佳水平，得到最佳工藝水平A2C1。次要因素B、D 均取第一水平，故山楂、人參乙醇提取的最佳條件為A2B1C1D1，即:山楂和人參用5 倍量750 g/L 乙醇，加熱回流0.5 h 即可。

2.2 制何首烏等藥材水提工藝的優(yōu)選

以煎液中2，3，5，4＇-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(以下簡稱二苯乙烯苷)含量為控制指標，采用L9(34)正交試驗，對煎煮工藝的煎煮次數(shù)、煎煮時間、加水量和浸泡時間等主要影響因素進行考察，優(yōu)選最佳工藝參數(shù)。

2.2.1 水煎煮工藝條件正交試驗因素水平表見表6。

表6 煎煮工藝因素水平表

按脈脂康膠囊處方比例，稱取人參、川芎、當歸、山楂、制何首烏，川芎和當歸加水蒸餾揮發(fā)油，人參、山楂按2.1.2 項下乙醇提取工藝方法進行提取，其藥渣與制何首烏混合，采用L9(34)正交試驗表，按各試驗號參數(shù)進行實驗，煎液濾過，合并，濃縮至約200 mL，完全轉(zhuǎn)移至250 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得1 ～9 號水煎提取液。

2.2.2 提取液中二苯乙烯苷的含量測定

色譜條件:色譜柱為美國熱電Hypersil C18ODS填料柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈—水(20∶80)，體積流量1.0 mL/min;檢測波長320 nm;柱溫40 ℃;理論塔板數(shù)按二苯乙烯苷峰計算應(yīng)不低于2 000。對照品和供試品色譜圖見圖3、圖4。

對照品溶液的制備:精密稱取二苯乙烯苷對照品2.665 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成每毫升含0.053 3 mg 的溶液，即得。

標準曲線:精密吸取對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定二苯乙烯苷吸收峰峰面積積分值，以進樣量為橫坐標(X)，以峰面積積分為縱坐標(Y)，進行回歸處理。回歸方程為Y =3．63 ×106X -3．79 ×104，r =0.999 8。結(jié)果提示:二苯乙烯苷在0. 106 6 ～0.629 6 μg 范圍內(nèi)，進樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

圖3 二苯乙烯苷對照品HPLC 圖

圖4 供試品HPLC 圖

供試品溶液的制備及測定:精密吸取2.2.1 項下1 ～9 號水煎煮正交實驗提取液各5 mL，置25 mL量瓶中，緩緩滴加950 g/L 乙醇，振搖，稀釋至刻度，靜置，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，即得。精密吸取各供試品溶液2 μL，注入液相色譜儀，按照上述2.2.2 項下色譜條件進行測定計算提取液中二苯乙烯苷的含量。結(jié)果見表7。

表7 正交試驗設(shè)計和二苯乙烯苷含量測定結(jié)果

由表7 可知，因素D 的極差R 值最小，以D 列做誤差列，對正交試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表8。

表8 方差分析表

由表8 可知:對試驗結(jié)果進行直觀分析和統(tǒng)計分析，水煎煮提取過程中對二苯乙烯苷含量影響因素大小順序依次為:B ＞A ＞C ＞D，其中因素B、A 對試驗結(jié)果均有顯著性影響。根據(jù)正交試驗結(jié)果可知，最佳工藝條件為B3A2。影響因素C、D 對試驗結(jié)果影響較小，不呈顯著性，為節(jié)約生產(chǎn)成本、加快提取效率，加水量和浸泡時間均選擇最低水平，即C、D 均取1 水平。因此，通過綜合考慮，得到煎煮提取最佳工藝為:B3A2C1D1，即何首烏等藥材加5 倍量水，不需浸泡，直接煎煮2 次，每次2 h。

2.3 濃縮干燥工藝考察

2.3.1 不同濃縮干燥方式樣品的制備

按脈脂康膠囊處方比例，稱取相同質(zhì)量的藥材2 份，分別按照優(yōu)選出的最佳提取工藝進行提取。取1 份將乙醇提取液和水煎液混合濃縮至稠膏狀，干燥;另一份乙醇提取液和水煎液分別濃縮至稠膏狀，分別烘干后混合。

2.3.2 人參皂苷含量測定對比

色譜條件和對照品溶液的制備:按2.1.2 項下方法。

供試品溶液的制備及測定:分別取混合濃縮和單獨濃縮的干膏適量，分別粉碎成細粉;取3 g 左右，精密稱定，置索氏提取器中，用乙酸乙酯提取至無色，濾紙筒揮干溶劑，再用甲醇提取至無色，甲醇提取液蒸干;加20 mL 水溶解，用水飽和正丁醇每次20 mL 振搖提取5 次，合并正丁醇液;用體積分數(shù)40%的氨試液洗滌2 次，每次30 mL，棄去氨液，正丁醇液水浴蒸干;殘渣用甲醇溶解至5 mL 的量瓶中，搖勻，用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，即得。精密吸取供試品溶液30 μL，進行測定，計算混合濃縮和單獨濃縮后混合的粉末中人參總皂苷的含量，結(jié)果見表9。結(jié)果表明:不同的濃縮干燥工藝對人參皂苷含量影響較大，混合濃縮干燥工藝的人參皂苷轉(zhuǎn)移率明顯低于單獨濃縮方式。

表9 干燥方式對人參總皂苷含量的結(jié)果對比

3 討 論

3.1 工藝路線的擬定

脈脂康膠囊處方中的川芎、當歸含有較多揮發(fā)油［8-9］，應(yīng)先蒸餾提取揮發(fā)油。人參中的主要活性成分人參皂苷類成分［10］。山楂中的主要活性成分總黃酮和有機酸等，均為脂溶性物質(zhì)，乙醇溶解度較好，應(yīng)先采用乙醇提取。制何首烏中的主要活性成分為二苯乙烯苷等苯乙醇苷類成分，易溶于水。制何首烏可與川芎、當歸蒸餾揮發(fā)油后的藥渣及人參、山楂乙醇提取后的藥渣混合，采用加水煎煮的方法進行提取。乙醇和水煎煮提取液濃縮干燥后，粉碎，混勻，將揮發(fā)油噴于干燥粉末中，密封過夜，再低溫烘干。

3.2 最佳提取工藝的確定

通過正交試驗對山楂和人參的乙醇提取工藝、制何首烏等藥材的水煎煮工藝分別進行優(yōu)選，得出的最佳提取工藝參數(shù)為:山楂和人參加5 倍量的750 g/L 乙醇，加熱回流提取1 次，0.5 h;何首烏等藥材加10 倍量的水，不需浸泡，煎煮2 次，每次2 h。

3.3 不同濃縮干燥方式的比較

在濃縮干燥工藝方式研究中，主要考察了濃縮方式及出膏率。結(jié)果顯示:混合濃縮對人參皂苷等有效成分的保留明顯低于單獨濃縮，應(yīng)選擇單獨濃縮的方式;濃縮方式對出膏率無影響。通過本研究，確定了脈脂康膠囊的最佳制備工藝，對擬定的生產(chǎn)工藝進行3 批中試生產(chǎn)驗證，結(jié)果證明所優(yōu)選的生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。脈脂康膠囊工藝改進后，可減小服藥量，并保證臨床用藥的安全有效性。

［1］王艷寧，張迪. 阿伐他汀片與辛伐他汀片治療混合性高脂血癥的成本效果分析［J］. 醫(yī)學(xué)信息，2008，21(2):258 -260.

［2］張前進. 人參的化學(xué)成分和藥理活性［J］. 光明中醫(yī)，2011，26(2):368 -369.

［3］王雪梅.當歸有效成分及其藥理作用的研究進展［J］.甘肅中醫(yī)，2009，22(11):50 -51.

［4］李秋怡，干國平，劉焱文.川芎的化學(xué)成分及藥理研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(7):1298 -1299.

［5］王春雷，蘆柏震，侯桂蘭. 山楂的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用［J］.海峽藥學(xué)，2010，22(3):75 -78.

［6］李貴海，孫敬勇.山楂降血脂有效成分的實驗研究［J］.中草藥，2002，33(1):50 -52.

［7］張印發(fā). 何首烏的藥理作用研究［J］. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2007，45(15):149 -151.

［8］葉璟.川芎有效成分的提取技術(shù)［J］. 中國高新技術(shù)企業(yè)，2009，126:55 -56.

［9］袁久榮，容蓉，楊東.當歸飲片揮發(fā)油成分的研究［J］.中國中藥雜志，1998，23(10):601 -603.

［10］唐斌，程緒，劉江，等.人參皂苷藥理作用研究進展［J］.西南軍醫(yī)，2005，7(3):45 -47.