張學(xué)超 陳至坤 崔傳金 （河北聯(lián)合大學(xué)電氣工程學(xué)院 河北 唐山 063000）

奶牛乳腺炎(Cow Mastitis)是指奶牛乳腺組織由病原微生物感染所引起的炎癥反應(yīng)，是奶牛所有疾病中發(fā)病率最高，危害最為嚴(yán)重的一種疾病，美國每年因奶牛乳腺炎造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億美元[1,2]。中國每年的牛奶產(chǎn)量為3555.8萬t[3]，而中國廣東氣候炎熱潮濕，奶牛的隱性乳腺炎平均月發(fā)病率為30%，季度平均發(fā)病時間為13%，受感染的奶牛平均感染時間為兩個季度，所以控制奶牛隱性乳腺炎的發(fā)病率顯得尤為重要[4]。

新鮮牛奶中的體細(xì)胞數(shù)量(SCC)與奶牛乳腺炎[5,6]、牛奶質(zhì)量密切相關(guān)。不同患病程度的乳腺炎奶牛，其體細(xì)胞數(shù)量不同、細(xì)胞大小百分比也不同[7]。體細(xì)胞含量已經(jīng)作為許多國家監(jiān)控牛群健康狀況、牛奶質(zhì)量和牛奶定價收購的重要指標(biāo)[8]。因此，如何實(shí)現(xiàn)牛奶中體細(xì)胞的準(zhǔn)確、快速、在線檢測具有重要意義。

傳統(tǒng)體細(xì)胞數(shù)檢測存在檢測時間長、操作復(fù)雜、成本高和不能在線檢測的問題[2,9]，而使用電參數(shù)檢測法來檢測體細(xì)胞數(shù)量，并與美國加州牛乳腺檢測方法(California Mastitis Test, CMT)[10]相對比，來間接判斷奶牛乳腺炎患病程度、牛奶質(zhì)量，是未來乳品檢測行業(yè)發(fā)展的主流方向，而電檢測方法具有快捷方便的特點(diǎn)和在線檢測的應(yīng)用前景[9]。

在電導(dǎo)率檢測乳腺炎中，溫度對牛奶的電導(dǎo)率影響很大[11]。但是，目前從細(xì)胞電容的角度研究電容值、細(xì)胞含量和細(xì)胞大小百分比之間關(guān)系的文章比較少。Xiong Z Q[12]等研究了在發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)生物量與電容值之間的關(guān)系之間存在線性關(guān)系和Shramik Sengupta[13]等研究了大腸桿菌在培養(yǎng)基上生長代謝的情況，發(fā)現(xiàn)微生物數(shù)量與電容值之間也存在線性關(guān)系。這都是因?yàn)槲⑸铩⒓?xì)胞的表層是不導(dǎo)電的原生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)[14]。當(dāng)具有完整膜結(jié)構(gòu)的微生物處于電場中時，在電場力作用下微生物會表現(xiàn)出微小電容效應(yīng)，微生物含量與電容值呈正相關(guān)[13,15]。

本文通過微通道電化學(xué)傳感器測取不同細(xì)胞含量新鮮奶樣的電容值，用電容、溫度和細(xì)胞大小百分比3參數(shù)建立預(yù)測體細(xì)胞含量的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，以其達(dá)到準(zhǔn)確、快速、在線診斷奶牛乳腺炎和評判牛奶質(zhì)量的目的。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

日本HIOKI3532-50 LCR測試儀、BCD-219SKDE冷藏柜、高精度溫度計(jì)(精度為0.001℃)、培英THZ-C恒溫振蕩器、奧林巴斯CX21生物光學(xué)顯微鏡等。主要數(shù)據(jù)分析處理采用Matlab7.3軟件。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 奶樣采集 奶樣采自100多頭正常生理期[11]的同一品種黑白花奶牛。采樣時先用溫開水擦拭乳頭，然后用75%的酒精對乳頭進(jìn)行消毒，并用醫(yī)用棉簽擦干，棄去前兩次擠出的牛奶，再進(jìn)行奶樣采集。每個乳區(qū)的牛奶分別擠入50ml干凈的帶有編號玻璃瓶內(nèi)密封。在運(yùn)輸過程中放入裝有冰袋的隔熱泡沫塑料盒內(nèi)進(jìn)行保鮮。最后將當(dāng)天采集到的奶樣帶回實(shí)驗(yàn)室測試，來不及馬上測試的奶樣需4℃冷藏保存，防止牛奶變質(zhì)影響測試。

1.2.2 細(xì)胞含量測定 牛奶中體細(xì)胞含量的測定采用改進(jìn)的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。奶樣取回后，將裝有奶樣的奶樣瓶放入恒溫振蕩器中，在40℃的恒溫水浴鍋中震蕩15min后取出[16]，使得細(xì)胞均勻地懸浮在牛奶中，同時配置碘酊染液：每毫升生理鹽水中滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的碘酊3滴，混勻即可，現(xiàn)用現(xiàn)配。再用移液槍吸取0.1ml的奶樣注入編號試管內(nèi)，再用移液槍吸取1.9ml碘酊染液注入試管內(nèi)，輕輕搖動，混合均勻，靜置3～5min。最后用移液槍吸取少量染色后的奶樣(約半滴)輕輕接觸蓋玻片和計(jì)數(shù)板的結(jié)合處，讓其自動流入并充滿計(jì)算室，然后進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)，在目物鏡15×40的放大倍數(shù)下，將計(jì)算室四角4個大方格內(nèi)的全部體細(xì)胞按順序計(jì)數(shù)；調(diào)節(jié)顯微鏡倍數(shù)，計(jì)算不同直徑范圍內(nèi)的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。為避免重復(fù)和遺漏，采用“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的計(jì)數(shù)原則，即對壓在方格左邊和上邊線上的體細(xì)胞計(jì)在本格內(nèi)。最后，牛奶體細(xì)胞含量按公式計(jì)算：SCC=T×5 ×104(1)。式中：SCC―牛奶中每毫升的體細(xì)胞含量(個/ml)；T―4個大方格內(nèi)的體細(xì)胞數(shù)目之和。

試驗(yàn)中，同一奶樣重復(fù)鏡檢計(jì)數(shù)4次，取其平均值作為奶樣體細(xì)胞含量，并記錄不同直徑范圍內(nèi)的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，見表1。共測取了80份奶樣，并根據(jù)細(xì)胞含量和加利福尼亞CMT標(biāo)準(zhǔn)[17]，將奶樣劃分到5個不同的等級，見表2。

表1 新鮮牛奶樣品中細(xì)胞大小的百分比 (萬個/ml，mm)

表2 CMT法檢測奶牛乳腺炎的標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 牛奶電容測量 因?yàn)闇囟葘y量牛奶電容值的影響較大，所以測量過程中需記錄并保持被測奶樣溫度。使用HIOKI 3532-50 LCR測試儀測量并記錄奶樣電容值。為避免測試奶樣之間的交叉污染，每測完一個奶樣后，注射器和傳感器都必須用蒸餾水清洗干凈，并用一定量的下一個奶樣沖洗3次，在進(jìn)行該奶樣的測試。所有的奶樣都在采集后的12h內(nèi)全部測試完畢。

2 微通道電化學(xué)傳感器的設(shè)計(jì)

電極材料采用99.99%的高純度鉑金材料，購于天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司。電極體材料和微通道管體材料采用透明、絕緣性好的聚四氟乙烯材質(zhì)。電極引線采用銅質(zhì)屏蔽線。為突出容抗的作用，根據(jù)Xc=1/(c)= 1/(2fc)（2）式中：Xc—容抗、c—電容、—電極兩端激勵源信號角頻率、f—激勵源信號頻率。在激勵源信號頻率一定的情況下，要想得到較高的容抗，根據(jù)c=A/L(3)式中：—電容率、L—電極間距離、A—電極橫截面積。正是從減小電極橫截面積和增加傳感器長度兩方面來增加容抗，所以設(shè)計(jì)了微通道電化學(xué)傳感器。

3 細(xì)胞含量神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型

BP(Back Propagation)算法是目前應(yīng)用最為廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)算法，可實(shí)現(xiàn)輸入和輸出間的任意非線性映射，具有一定的泛化功能[18]。將奶樣的電容、溫度和細(xì)胞大小百分比3個向量作為網(wǎng)絡(luò)的輸入，輸入層神經(jīng)元數(shù)為3。網(wǎng)絡(luò)的輸出向量為體細(xì)胞數(shù)，輸出層神經(jīng)元數(shù)為1。該網(wǎng)絡(luò)采用了2個隱層。兩隱層之間傳遞函數(shù)為Tansig，輸出層函數(shù)為Purelin，訓(xùn)練函數(shù)選用trainlm。在網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練前，將數(shù)據(jù)用mapstd()標(biāo)準(zhǔn)化函數(shù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理，以避免數(shù)據(jù)飽和并加速網(wǎng)絡(luò)的收斂速度。

通過調(diào)整隱層的節(jié)點(diǎn)數(shù)和相關(guān)的訓(xùn)練參數(shù)對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)。經(jīng)過多次的訓(xùn)練仿真，發(fā)現(xiàn)當(dāng)最大迭代次數(shù)為10000，誤差性能目標(biāo)值為0.1。網(wǎng)絡(luò)模型的兩隱層神經(jīng)元數(shù)為6和4時結(jié)果較為滿意，模型結(jié)構(gòu)為3-6-4-1，如圖1所示。

圖1 模型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

3.1 模型分析

模型的評價指標(biāo)和預(yù)測結(jié)果分別見圖2、3和表3、4。由表3可知，模型的相關(guān)性很高，相關(guān)系數(shù)R達(dá)到了0.9916，模型均方根誤差RMSE為6.3094；預(yù)測集的預(yù)測相關(guān)系數(shù)Rp也達(dá)到了0.9963；預(yù)測均方根誤差RMSEp為10.2916。由圖2可以看出，模型的擬合效果比較滿意，決定系數(shù)也較高，R2為0.9833。因此說明所建立的奶牛乳腺炎的檢測模型基本可靠。

圖2 模型輸出值與實(shí)際值線性回歸圖

圖3 模型預(yù)測輸出值與實(shí)際值線性回歸圖

表3 模型評價參數(shù)

表4 各級正確檢出率

3.2 模型預(yù)測結(jié)果與分析

由圖3可以看出，模型的預(yù)測決定系數(shù)R2為0.9926。表3中，模型對9個剩余奶樣進(jìn)行建模預(yù)測，正確預(yù)測檢出率為89.58%；80個奶樣的總體檢出率為78.8%與S.Ankinakatte[19]等研究的用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)檢測乳腺炎的靈敏度75%基本吻合。N級和T級正確檢出率偏低，分別為73.56%和65.78%。但是1級和2級正確檢出率明顯提高，分別達(dá)到89.03%和94.32%。原因很可能是由于體細(xì)胞含量，在N級和T級中，細(xì)胞含量總體上比較低，所產(chǎn)生的電容信息比較少，而極化產(chǎn)生的界面電容占總電容比重較大[13]，因此，測取的電容值不能很好地反映低濃度細(xì)胞含量，最終導(dǎo)致N、T級的檢出率偏低。另外，T級正確檢出率略低于N級，可能是T級的奶樣數(shù)目較少所致。1級和2級的正確檢出率較高，可能是體細(xì)胞的濃度較高，細(xì)胞極化電容占總電容比重升高，這時所測電容值就能很好地反映體細(xì)胞含量，細(xì)胞含量越高，這種關(guān)系就越顯著，而2級中的奶樣體細(xì)胞含量不低于120萬/ml，所以正確檢出率就達(dá)到了94.32%。

4 結(jié)論

通過使用微通道電化學(xué)傳感器來檢測牛奶體細(xì)胞電容值，結(jié)果表明：電容值、溫度和和細(xì)胞大小百分比與體細(xì)胞含量之間有著密切關(guān)系，細(xì)胞含量越高，檢測效果越好。但在較低細(xì)胞含量下關(guān)系并不明顯，這是因?yàn)榻缑鏄O化電容淹沒了有用的奶體電容。所以，從減小界面電容著手，深入研究微通道電化學(xué)傳感器結(jié)構(gòu)，提高傳感器檢測精度一個重要的研究課題。

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