馬海濤 韓承慧, 滕照軍 劉相全 楊建敏 田玉秋 姜海濱①

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室 煙臺 264006;2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306; 3. 日照市海洋水產(chǎn)資源增殖站 日照 276805)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)和星斑川鰈(Platichthys stellatus)隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes), 但大菱鲆屬于鲆科(Bothidae)、菱鲆屬(Scophthalmus), 星斑川鰈屬于鰈科(Pleuronectidae)、川鰈屬(Platichthys)。大菱鲆是原產(chǎn)于歐洲的重要海水名貴養(yǎng)殖魚種(雷霽霖等, 2003), 1992年由中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所首次引入中國, 目前已成為我國特別是北方地區(qū)的主要養(yǎng)殖品種(于飛等,2008)。但該品種對水質(zhì)要求高, 要求水質(zhì)清澈, 水溫較低, 最適宜水溫為14—17°C (曹樹香等, 2008)。另外近年來也出現(xiàn)比較嚴重的種質(zhì)退化現(xiàn)象, 如成活率降低、生長速度減慢、抗逆性差、白化嚴重等(申雪艷等, 2004; 雷霽霖, 2005; 馬愛軍等, 2008)。星斑川鰈主要分布于北太平洋的亞洲和美洲沿岸(尤鋒等,2007), 其生長速度較快, 抗病能力強, 廣溫(存活溫度0—30°C), 廣鹽(5—40), 適應能力強(曹樹香等, 2008)。在養(yǎng)殖實踐中, 人們以大菱鲆為母本、星斑川鰈為父本進行了雜交, 獲得了雜交種。雜交種在養(yǎng)殖生產(chǎn)中表現(xiàn)出了比較明顯的雜種優(yōu)勢, 比如生長速度快、抗病抗逆性強等優(yōu)點。目前已經(jīng)在山東、遼寧等地進行了推廣養(yǎng)殖, 并形成了一定的養(yǎng)殖規(guī)模, 顯示出較好的經(jīng)濟開發(fā)潛力。

形態(tài)學特征作為雜交育種研究的重要指標, 是育種的直接選擇參數(shù)(樓允東, 2001)。因此, 雜交種與父母本的形態(tài)學差異比較對深入研究大菱鲆與星斑川鰈雜交制種和養(yǎng)殖具有重要的理論意義和實踐意義。國內(nèi)外學者已經(jīng)將多元分析法廣泛應用于魚類雜交種分析(劉蘇等, 2011; 張穎等, 2012)。但有關大菱鲆、星斑川鰈及其雜交種的形態(tài)差異比較及形態(tài)判別分析的研究還未見報道。本研究利用方差分析、聚類分析、判別分析和主成分分析等多元分析方法, 對三者的可數(shù)性狀和可量性狀進行了分析, 為人工養(yǎng)殖條件下大菱鲆、星斑川鰈及其雜交種的識別鑒定及野生種質(zhì)資源保護利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大菱鲆和雜交種樣品均采自于煙臺泰華海洋科技有限公司, 星斑川鰈樣品采自于日照市海洋水產(chǎn)資源增殖站。樣品采集前一天, 先進行停食處理, 然后活體運回山東省海洋水產(chǎn)研究所進行形態(tài)學測量。所采樣品均為體型正常且健康無病的個體, 樣品的數(shù)量和規(guī)格見表1。

表1 本實驗觀測樣本的數(shù)量和規(guī)格Tab.1 Number of observed samples and specifications of S. maximus, P. stellatus, and the hybrid

1.2 數(shù)據(jù)測量

試驗樣品經(jīng)電子天平稱重(精確到0.01g)后對形態(tài)學數(shù)據(jù)進行了測量。形態(tài)學數(shù)據(jù)包括可數(shù)性狀和可量性狀, 可數(shù)性狀有背鰭條數(shù)、胸鰭條數(shù)、腹鰭條數(shù)、臀鰭條數(shù)、尾鰭條數(shù)(共5項), 可量數(shù)據(jù)包括: 全長、軀干長、體寬、吻長、眼徑、眼后頭長、眼間距、胸鰭長、臀鰭長、背鰭長、尾鰭長、腹鰭長、尾柄長、尾柄高、體厚度、消化道長、腸長度、體重、內(nèi)臟團重、消化道重、肝胰臟重(共22項)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將所測量的原始數(shù)據(jù)整理到Microsoft Excel中,為了消除魚體規(guī)格差異對形態(tài)分析的影響, 先將可量性狀中所有長度數(shù)據(jù)除以體長, 所有重量數(shù)據(jù)除以體重進行校正, 再分別求出各組材料樣品每個參數(shù)的平均比值, 得到20個可量性狀的校正值和5個可數(shù)性狀的數(shù)據(jù)。對可數(shù)性狀數(shù)據(jù)和可量性狀比值計算雜交種的雜種指數(shù)HI (hybrid index) (Witkowskiet al, 1980; Crivelliet al, 1987):

其中,Hi: 雜交種平均值;Mi1: 母本平均值;Mi2: 父本平均值, HI介于45與55之間屬中間性狀, HI<45為偏母本性狀, HI>55為偏父本性狀, HI>100或HI<0為超親偏離性狀。

再利用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析, 主要運用卡方檢驗、方差分析、聚類分析、判別分析及主成分分析5種分析方法。

1.3.1 卡方檢驗 對可數(shù)性狀數(shù)據(jù)進行卡方檢驗,比較三者之間數(shù)據(jù)的差異顯著性。

1.3.2 方差分析 對大菱鲆、星斑川鰈及雜交種共90個樣本的18個比例可量性狀, 采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比較進行分析, 找出差異顯著的性狀。

1.3.3 聚類分析 運用校正后可量性狀數(shù)據(jù)的平均值進行聚類分析, 計算群體間的歐氏距離, 并作聚類分析樹狀圖。

1.3.4 判別分析 采用逐步判別法, 每步選擇Wilks的λ統(tǒng)計量值最小的變量進入判別函數(shù)(趙建等, 2007)。

1.3.5 主成分分析 從所有的形態(tài)數(shù)據(jù)中篩選特征根值大于1的主成分, 計算各主成分負荷值和貢獻率, 并根據(jù)各主成分繪制散點圖。

2 結(jié)果

2.1 外形特征比較

雜交種的外部形態(tài)特征與大菱鲆的相似程度比較高, 與星斑川鰈的差別較大。雜交種的表面斑紋跟大菱鲆相似, 呈黑褐色, 而星斑川鰈有白色斑點。

雜交種和大菱鲆的體寬較寬, 而星斑川鰈的體寬較窄, 顯得扁長。但雜交種與大菱鲆也有比較明顯的不同, 雜交種整個背部的觸感都有凹凸感, 而大菱鲆只有內(nèi)臟團周圍具有凹凸感。

2.2 可數(shù)性狀

大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的可數(shù)性狀均值與范圍見表2, 卡方檢驗結(jié)果見表3。雜交種的背鰭鰭條數(shù)、臀鰭鰭條數(shù)、胸鰭鰭條數(shù)、尾鰭鰭條數(shù)與父母本都有重疊, 不能利用可數(shù)性狀將三者直觀地區(qū)分, 在腹鰭鰭條數(shù)上三者一致(均為6個)。在雜交種指數(shù)方面, 除了背鰭鰭條數(shù)、胸鰭鰭條數(shù)、尾鰭鰭條數(shù)屬于超親偏離性狀外, 雜交種的臀鰭鰭條數(shù)屬于偏母本性狀。

表2 大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的可數(shù)性狀Tab.2 Meristic data from S. maximus, P. stellatus, and the hybrid

表3 大菱鲆、雜交種和星斑川鰈間可數(shù)性狀的卡方檢驗結(jié)果Tab.3 Results of chi-square analysis for meristic data from S.maximus, P. stellatus, and the hybrid

卡方檢驗后可知, 在分析的4個可數(shù)性狀性狀中,雜交種與母本大菱鲆都為差異不顯著, 而與父本星斑川鰈都為差異極顯著。大菱鲆和星斑川鰈除胸鰭鰭條數(shù)外, 其它3個可數(shù)性狀都為差異顯著或極顯著。

2.3 可量性狀

大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的20個可量性狀的均值、范圍及方差分析結(jié)果見表4。除腹鰭長/體長性狀在三者中的差異都不顯著外, 雜交種在吻長/體長、臀鰭長/體長、背鰭長/體長、腹鰭長/體長、尾柄高/體長、體厚度/體長、內(nèi)臟團重/體重、消化道重/體重、肝胰臟重/體重9個性狀中與大菱鲆差異不顯著, 占所有可量性狀的45%, 而雜交種的19個可量性狀與星斑川鰈都有顯著差異。通過對20個可量性狀計算雜種指數(shù), 得到的偏母本性狀有13個, 它們分別為:全長/體長(HI=32.99)、軀干長/體長(HI=23.79)、體寬/體長(HI=29.1)、眼后頭長/體長(HI=28.13)、臀鰭長/體長(HI=21.44)、背鰭長/體長(HI=24.86)、腹鰭長/體長(HI=13.96)、尾鰭長/體長(HI=32.99)、尾柄高/體長(HI=15.10)、體厚度/體長(HI=18.03)、消化道長/體長(HI=29.39)、腸長度/體長(HI=16.61)、內(nèi)臟團重/體重(HI=4.53)占可量性狀總和的65%; 偏父本性狀2個,分別是眼徑/體長(HI=76.60)胸鰭長/體長(HI=68.23),占可量性狀總和的10%; 超雙親性狀有吻長/體長(HI= –11.40)、眼間距/體長(HI= –18.93)、尾柄長/體長(HI= –42.89 )、消化道重/體重(HI= –23.71)、肝胰臟重/體重(HI= –25.04), 占據(jù)可量性狀總和的25%。而所有可量性狀的雜種指數(shù)平均值為15.56, 說明雜交種的性狀傾向于與母本相似。

2.4 聚類分析

對大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的20個形態(tài)比例性狀計算歐式距離(表5), 用UPGMA法對其平均值進行聚類分析(圖1)。結(jié)果表明雜交種與大菱鲆形態(tài)較為接近, 先聚為一支, 歐氏距離為1.005; 再與星斑川鰈聚為一支, 歐式距離為1.051; 大菱鲆與星斑川鰈最后聚為一支, 歐式距離為2.041。

2.5 判別分析

經(jīng)過判別分析得到了10個對結(jié)果影響貢獻率較大的參數(shù), 它們分別是軀干長/體長、體寬/體長、眼徑/體長、眼間距/體長、胸鰭長/體長、尾鰭長/體長、尾柄長/體長、尾柄高/體長、體厚度/體長、腸長度/體長。以X1—X10表示這10個參數(shù), 可以構(gòu)建如下判別公式:

大菱鲆:

雜交種:

星斑川鰈:

表4 大菱鲆、雜交種和星斑川鰈的可量性狀數(shù)據(jù)Tab.4 Proportional values of traditional metric characters of S. maximus, P. stellatus, and the hybrid

表5 大菱鲆、星斑川鰈和雜交種間的歐式距離Tab.5 Euclidean distance values of S. maximus, P. stellatus,and the hybrid

上述判別式對大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的綜合判別準確率達到98.9%(表6), 判別效果顯著。用于判斷三種魚屬于哪個類別時, 將所測得的數(shù)據(jù)校正后代入判別公式中, 函數(shù)值最大的即為所屬種類。

圖1 大菱鲆、雜交種和星斑川鰈形態(tài)可量性狀的聚類分析圖Fig.1 Dendrogram of clustering conducting on metric of S.maximus, P. stellatus, and the hybrid

表6 判別式對大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的預測分類及判別準確率Tab.6 Predicted classification of discriminant equations for S.maximus, P. stellatus, and the hybrid

2.6 主成分分析

對大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的20個可量比例性狀進行主成分分析, 共獲得4個主成分(表7)。其中, 主成分1的方差貢獻率為54.468%, 主成分2的方差貢獻率為7.325%, 主成分3的方差貢獻率為6.139%, 主成分4的方差貢獻率為5.557%, 對變異的累積貢獻率為73.490%。在第一主成分中, 具有較大方差貢獻率的變量主要取決于全長/體長、軀干長/體長、體寬/體長、吻長/體長、眼后頭長/體長、眼間距/體長、尾鰭長/體長、尾柄長/體長、腸長度/體長, 因此大菱鲆、星斑川鰈和雜交種在這9種參數(shù)上存在較明顯的差異。

為了更清晰地顯示出大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的差異情況, 利用提取的4個主成分繪制散點圖,其中第一主成分對第三主成分的散點圖可以將三者清楚地區(qū)分開(圖2), 表明三者之間形態(tài)特征差異顯著。

表7 20個性狀對4個主成分的特征向量及主成分的貢獻率Tab.7 Eigenvectors and contributive proportion of four principal components from 20 morphological traits

3 討論

圖2 大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的第一、第三主成分散點圖Fig.2 Distribution of factor (3)×factor (1) coordinate in S.maximus, P. stellatus, and the hybrid

4個可數(shù)性狀中, 雜交種與大菱鲆都為差異不顯著, 而與父本星斑川鰈都為差異極顯著; 雜種指數(shù)方面, 除超親偏離性狀外, 雜交種的臀鰭鰭條數(shù)屬于偏母本性狀。20個可量性狀中, 除腹鰭長/體長性狀在三者中的差異都不顯著外, 雜交種有9個性狀與大菱鲆差異不顯著, 但其19個可量性狀與星斑川鰈都為顯著差異; 雜種指數(shù)方面, 除超親偏離性狀外, 偏母本性狀有13個, 偏父本性狀有2個, 而可量性狀的雜種指數(shù)平均值為15.56, 顯示雜交種可量性狀總體屬于偏母本。由以上結(jié)果可知, 雜交種更多繼承了母本的形態(tài)特征, 外部形態(tài)與大菱鲆更為相似。另外對三者的20個可量性狀進行了聚類分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交種先與大菱鲆聚為一支, 再與星斑川鰈聚為一支, 同樣印證了上述結(jié)論。這也與大多數(shù)已有雜交育種試驗結(jié)果相吻合, 大多數(shù)雜交后代的形態(tài)性狀都偏向于母本, 如團頭魴(♀)×三角魴(♂)(楊懷宇等, 2002)、荷包紅鯉魚(♀)×元江鯉(♂)(馬仲波等, 1981)、鯽魚(♀)×禾花魚(♂)(孫翰昌等, 2011)等。除了形態(tài)特征外, 一些雜交種的胚胎發(fā)育時間(夏仕玲等, 1990)、胚胎孵化時間(宓國強等, 2009)等也出現(xiàn)偏向于母本。原因可能與母體效應影響, 或者線粒體基因在雜交種受精卵在發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用有關(Bolnicket al, 2008; 吳常信, 2010; Anderssonet al, 2011)。

在魚類的分類上, 形態(tài)上的差異最為直觀, 因此形態(tài)鑒別指標非常重要。傳統(tǒng)的形態(tài)學分析是采用可數(shù)性狀及可量性狀的單一比較, 這種方法被廣泛用于種間及種以上魚類的鑒別(Cadrin, 2000)。本研究中,雜交種的外部形態(tài)特征與星斑川鰈的差別較大, 與大菱鲆非常相似, 很難從外部形態(tài)上直接將雜交種與大菱鲆進行區(qū)分。在可數(shù)性狀中, 除腹鰭鰭條數(shù)都一致外, 三者在背鰭鰭條數(shù)、臀鰭鰭條數(shù)、胸鰭鰭條數(shù)和尾鰭鰭條數(shù)的均值存在較大差異, 但由于其區(qū)間范圍存在著重疊, 因此無法作為區(qū)分三者的直接依據(jù), 必須借助多元統(tǒng)計分析方法對三者進行分析。

判別分析主要應用于鑒定不同水系和不同雜交品系水產(chǎn)動物的鑒別分析, 通過建立判別公式正確區(qū)分不同水系和不同品系的水產(chǎn)動物, 對防止種質(zhì)混雜具有重要的理論意義(張堯庭等, 1982; 李思發(fā)等,1998; 吳常信, 2010)。本研究中, 貢獻率最大的10個參數(shù)分別位于頭部、軀干部和尾部, 差異性狀分布比較分散。利用這些參數(shù)分別構(gòu)建了其判別函數(shù), 對大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的綜合判別準確率達到98.9%, 判別效果非常顯著。

主成分分析通過將多參數(shù)綜合成少數(shù)因子來說明不同種群的差異大小, 根據(jù)主成分值得出各群體在各主成分上差異較大的參數(shù)(張志強等, 2005)。本研究共獲得了4個主成分, 其累積總變異的貢獻率為73.49%。其中第一主成分中具有較大方差貢獻率的性狀遍布全身, 這與判別分析得出的結(jié)果一致, 其可以將星斑川鰈與另外兩種區(qū)分開, 但不能徹底區(qū)分大菱鲆和雜交種。大菱鲆和雜交種的形態(tài)差異主要表現(xiàn)在第三主成分上, 第三主成分上具有較大方差貢獻率的性狀為腹鰭長和體厚度, 說明雜交種在這兩個性狀上更多繼承了星斑川鰈的特征。

本研究結(jié)果表明, 雜交種在形態(tài)上與大菱鲆非常相似, 但在生長速度、抗病性等性能上較父母本有優(yōu)勢, 雜交種在養(yǎng)殖業(yè)中的優(yōu)勢作用一定會越來越明顯。本研究中, 采用多元分析方法鑒別大菱鲆、星斑川鰈和雜交種的形態(tài), 結(jié)果證明該法比較有效。這對于養(yǎng)殖生產(chǎn)中雜交種的物種鑒定及養(yǎng)殖管理具有很重要的理論和實踐意義。

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