李應東 孫世春

(中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所 青島 266003)

褪黑激素(melatonin)是在生物進化過程中非常保守的一類激素, 廣泛存在于藻類、無脊椎動物和脊椎動物體內(nèi)(Vivien-Roelset al, 1984; Hardelandet al,1996; 李經(jīng)才等, 2000)。自1958年首次在牛的松果體中發(fā)現(xiàn)以來(Lerneret al, 1958), 它的分泌、合成以及生理功能一直是學者們研究的熱點。

在水生無脊椎動物中, 前人的工作先后在甲殼動物、軟體動物、扁形動物、腔腸動物和紐形動物等檢測到褪黑激素的存在(Vivien-Roelset al, 1986; Moritaet al, 1987; Anctilet al, 1991; Arnoultet al, 1994)。褪黑激素被認為是調(diào)節(jié)水生無脊椎動物生長、發(fā)育和繁殖的關鍵激素(Vivien-Roelset al, 1993; Mechawaret al,1997)。其主要作用包括清除自由基、調(diào)節(jié)生理節(jié)律和免疫等(Hardelandet al, 2003; Galanoet al, 2011)。

紐形動物褪黑激素的相關研究開始較晚, 僅有的少量工作都是由Arnoult等圍繞Ramphogordius lacteus開展的。研究發(fā)現(xiàn),R. lacteus體內(nèi)的褪黑激素含量會隨著繁殖周期和晝夜節(jié)律而改變, 其濃度在性腺成熟期低于休止期, 在白天低于夜間(Arnoultet al,1994); 外源的褪黑激素會影響R. lacteus性腺發(fā)育以及組織再生速度(Arnoultet al, 1995, 1996); 褪黑激素的主要合成酶之一羥基吲哚-O-甲基轉移酶(HIOMT)位于R. lacteus腦神經(jīng)節(jié)內(nèi)(Arnoultet al, 2001)。

本文通過測定香港細首紐蟲(Cephalothrix hongkongiensisSundberget al.)的性腺(精巢, 卵巢)和卵母細胞大小的變化, 研究了手術(去頭)和褪黑激素對其性腺發(fā)育的影響, 并通過Western bolt和免疫組織化學方法對香港細首紐蟲頭部的HIOMT進行了測定和定位。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用的香港細首紐蟲均采自青島太平角潮間帶石下或粗砂中, 在實驗室暫養(yǎng)兩周后開始實驗。暫養(yǎng)期間每4—5天投喂淡水寡毛類1次, 投喂5h后換全量水, 海水鹽度31, 溫度20°C。實驗開始前5天停止投喂。去頭實驗(1.2)和褪黑激素毒性實驗(1.3)所用紐蟲采于2012年9月上旬, 體重為(16.7±3.4)mg(11.4—19.7mg)。褪黑激素對性腺發(fā)育影響實驗(1.3)及HIOMT測定和定位實驗(1.4和1.5)所用紐蟲采于2012年10月上旬, 體重為(15.8±4.1)mg (10.8—17.9mg)。

1.2 去頭對性腺發(fā)育的影響

處理組紐蟲用7.5%的MgCl2麻醉后, 將紐蟲頭部(口前)切除。對照組使用正常紐蟲。實驗容器為15cm培養(yǎng)皿, 每個培養(yǎng)皿隨機放入5條紐蟲, 設置12個平行。用恒溫光照培養(yǎng)箱控制實驗條件(溫度20°C, 鹽度31, 光照周期12D : 12L)。實驗開始前隨機抽取20條蟲體固定, 實驗開始20天后第1次取樣,之后每隔5天取樣1次, 每次每個培養(yǎng)皿取1條紐蟲固定, 備做組織學研究。實驗過程中, 每隔5天換水1次, 不投餌。

用于石蠟切片的紐蟲用7.5% MgCl2麻醉后于身體中后部取5—10mm長的片段, Bouin’s液固定。梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋、切片(厚度8μm)。常規(guī)H.E染色。Nikon Eclipse E600顯微鏡觀察,Olympus DP72數(shù)碼成像系統(tǒng)拍照, CellSens stardard軟件測量性腺/卵子的長徑(a)和短徑(b)。并用下列公式估算標準化直徑: 標準化直徑每個樣品測量6組數(shù)據(jù), 取最大值用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析(即以最大數(shù)據(jù)表示樣品的性腺發(fā)育水平)。

1.3 褪黑激素對成活率及性腺發(fā)育的影響

參照其他學者對渦蟲(Yoshizawaet al, 1991)和紐蟲(Arnoultet al, 1996)的研究, 選取6個濃度的褪黑激素(25, 50, 75, 100, 150和200mg/L)及1個空白(0mg/L)對照, 首先對香港細首紐蟲進行毒性實驗, 旨在找到其耐受濃度。用恒溫光照培養(yǎng)箱控制實驗條件(溫度20°C, 鹽度31, 光照周期12D : 12L)。實驗容器為15cm培養(yǎng)皿, 每個培養(yǎng)皿放入褪黑激素海水溶液100mL。每個濃度3個平行, 每個平行10條紐蟲。實驗共進行60天, 實驗過程中不投餌, 每5天全量更換試液。

參考毒性試驗的結果, 選取3個濃度(25, 50和75 mg/L)的褪黑激素及1個對照(0mg/L)對去除頭部的香港細首紐蟲進行試驗, 檢測外源褪黑激素對性腺發(fā)育的影響。每個濃度6個平行。實驗容器同上, 每個培養(yǎng)皿放試液100mL, 10條紐蟲。實驗過程中不投餌, 每5天全量更換試液。實驗開始前對實驗紐蟲隨機抽取20條固定, 實驗開始后第1次取樣在培養(yǎng)20天后, 之后每隔10天取樣1次, 每次每個培養(yǎng)皿隨機抽取2條紐蟲固定, 進行組織學研究。組織學研究方法同1.2。

1.4 羥基吲哚-O-甲基轉移酶(HIOMT)的Western blot測定

取10條紐蟲, 迅速割取頭部(口前部分), 0.01mol/L的PBST洗3次, 每次5min。之后冰盒上勻漿, 4°C離心。取100μL上清液沸水浴10min, 加入上樣緩沖液進行12% SDS-PAGE電泳。蛋白質(zhì)轉膜。BSA 4°C孵育膜過夜。一抗使用BSA稀釋500倍的兔抗小鼠ASMTY/HIOMT(Abcam公司), 4°C孵育過夜。PBST洗3次, 每次5min。二抗使用PBST稀釋2000倍的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG, 37°C孵育2h。PBST洗3次, 每次5min, DAB顯色。

1.5 羥基吲哚-O-甲基轉移酶(HIOMT)的免疫組織化學定位

選取活躍的紐蟲, MgCl2麻醉后割取頭部(口前部分), 4%多聚甲醛固定。梯度酒精脫水, 二甲苯透明,石蠟包埋、切片(厚度5μm), 甘油蛋白粘片。經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復水后, 0.01mol/L的PBST洗3次,每次5min。3% H2O2-PBS孵育10min。PBST洗3次,每次5min, 10%山羊血清室溫封閉2h。一抗使用10%山羊血清稀釋400倍的兔抗小鼠ASMTY/HIOMT(Abcam公司), 4°C孵育24h后再室溫孵育1h。PBST洗3次, 每次5min。二抗使用PBST稀釋2000倍的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG, 37°C孵育2h。PBST洗3次, 每次5min, DAB顯色。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan多重比較。顯著性水平用P<0.05表示。

2 實驗結果

2.1 手術(去頭)對性腺發(fā)育的影響

見圖1。在實驗開始時, 性腺均未發(fā)育。培養(yǎng)20天后, 去頭個體性腺已經(jīng)發(fā)育, 精巢、卵巢和卵母細胞的平均直徑分別為(85.0±43.8) μm、(121.4±25.7) μm和(57.4±9.5) μm; 30天時, 精巢、卵巢的大小及配子成熟度均高于20天, 卵母細胞的平均直徑在80μm左右;40天時, 卵細胞成熟, 平均直徑接近100μm, 并且精巢中有大量成熟精子。對照組個體在整個實驗過程中未見性腺發(fā)育。

圖1 去除頭部對香港細首紐蟲性腺發(fā)育的影響——精巢、卵巢和卵母細胞的標準化直徑(平均值±標準差; n=12)Fig.1 The effect of decapitation on gonad development of C.hongkongiensis. Data are presented as standardized diameters of testes, ovaries, and oocytes (mean±SD; n=12)

2.2 褪黑激素對成活率和性腺發(fā)育的影響

不同濃度的褪黑激素對香港細首紐蟲成活率的影響見圖2。結果表明, 隨著褪黑激素濃度的上升, 紐蟲出現(xiàn)活性變差、不攝食、斷尾、吐吻、對外界刺激無反應和死亡率高等現(xiàn)象。濃度大于75mg/L的褪黑激素對香港細首紐蟲有較高的致死率。在濃度為200、150和100mg/L條件下, 香港細首紐蟲分別在15天、20天和25天內(nèi)全部死亡。在75mg/L濃度下, 60天內(nèi)全部死亡; 50mg/L條件下60天后存活率約為70%。25mg/L濃度對紐蟲的成活率無影響。實驗期間, 對照組紐蟲的存活率為100%, 也未見異常行為。

褪黑激素對香港細首紐蟲性腺發(fā)育具有顯著的抑制作用(圖3)(P<0.05), 并且隨褪黑激素濃度的增加,抑制作用增強。在實驗開始時, 性腺未發(fā)育。培養(yǎng)20天后, 受試紐蟲性腺均已發(fā)育, 但褪黑激素組紐蟲的性腺和卵母細胞大小均顯著小于對照組(P<0.05)。第30、40天時, 各個處理組的性腺(精巢、卵巢)和卵母細胞的大小均表現(xiàn)為75mg/L組<50mg/L組<25mg/L組<0mg/L組。其中, 第40天時, 75mg/L組的性腺已退化消失。

圖2 不同濃度褪黑激素對香港細首紐蟲成活率的影響(平均值±標準差; n=3)Fig.2 Survival rate of C. hongkongiensis under melatonin solutions of different concentrations (mean±SD; n=3)

圖3 不同濃度褪黑激素對香港細首紐蟲性腺發(fā)育的影響——精巢、卵巢及卵母細胞的標準化直徑(平均值±標準差; n=12)Fig.3 Impact of melatonin on gonad development of C.hongkongiensis. Data are presented as standardized diameters of testes, ovaries, and oocytes (mean±SD; n=12)

2.3 HIOMT的測定和定位

香港細首紐蟲頭部蛋白與兔抗小鼠HIOMT抗體Western blot免疫印跡實驗顯示, 在約38kDa處有明顯的陽性條帶(圖4)。說明香港細首紐蟲的頭部存在HIOMT。由圖5可以看出, HIOMT親和免疫定位發(fā)生在腦神經(jīng)節(jié)內(nèi)側的幾個神經(jīng)細胞中, 呈對稱分布。對照組無陽性反應。

圖4 香港細首紐蟲頭部HIOMT的Western blot檢測Fig.4 Western blot for HIOMT of the cephalic region of C.hongkongiensis

圖5 香港細首紐蟲腦部HIOMT的免疫組織化學定位Fig.5 Immunocytochemistry of HIOMT in the cerebral ganglia of C. hongkongiensis

3 討論

大多數(shù)水生無脊椎動物會通過神經(jīng)系統(tǒng)來對生長、發(fā)育和繁殖進行調(diào)節(jié)(Golding, 1974; Hartenstein,2006)。去除其主要的神經(jīng)激素中心, 會使生長和繁殖受到影響。如切除甲殼動物的眼柄, 會使其性腺發(fā)育速度加快(Primavera, 1978); 去除渦蟲的頭部會使其斷裂再生速度加快(Moritaet al, 1984)。對紐蟲的研究也發(fā)現(xiàn), 手術去除Ramphogordius lacteus的腦部會使其性腺發(fā)育速度加快(Gontcharoffet al, 1958)。Vernet等(1988)認為紐蟲腦神經(jīng)中樞分泌的性腺發(fā)育抑制激素(GIH)是控制其性腺發(fā)育的主要激素, 去除這種激素會使紐蟲的性腺迅速發(fā)育。去頭術可迅速誘導香港細首紐蟲的性腺發(fā)育, 表明香港細首紐蟲的頭部也存在GIH或類似物抑制其性腺發(fā)育。一些學者們推測, 紐蟲GIH分泌可能受褪黑激素的直接或間接調(diào)節(jié)(Vernetet al, 1993; Arnoultet al, 1994,2001)。

自Vivien-Roels等(1984)在昆蟲的復眼中發(fā)現(xiàn)褪黑激素以來, 已在多種無脊椎動物體內(nèi)檢測到褪黑激素(Vivien-Roelset al, 1993; Roopinet al, 2012)。在對紐形動物的研究中, Arnoult等(2001)應用放射免疫法在異紐目紐蟲R. lacteus的腦和眼點中檢測到褪黑激素的存在, 且其含量存在晝夜變化, 說明該激素的合成可能受光的調(diào)控(Arnoultet al, 1994)。本文通過Western blot方法在香港細首紐蟲的頭部組織檢測到了褪黑激素合成酶HIOMT[褪黑激素合成的一種特異性標記(Arnoultet al, 2001)] (圖4), 免疫組化結果顯示其分布于腦神經(jīng)節(jié)的少數(shù)幾個細胞(圖5), 說明香港細首紐蟲的中樞神經(jīng)也具有合成褪黑激素的功能。Arnoult等(2001)認為紐蟲腦神經(jīng)節(jié)中的這些細胞可能與脊椎動物松果體、視網(wǎng)膜中的光受體細胞類似。

雖然很多研究指出褪黑激素具有抗衰老、延長壽命的功能(Bakaevet al, 1997), 但外源褪黑激素對無脊椎動物的作用因濃度和物種而不同。過高的環(huán)境褪黑激素濃度可能具有毒性效應, 如: 當褪黑激素濃度超過100mg/L時, 線蟲Caenorhabditis elegans的壽命變短(Bakaevet al, 1997); 超過10mg/L時草履蟲Paramecium tertaurelia的壽命變短(Thomaset al,1997); 當褪黑激素濃度達到50mg/L時, 已研究的兩種紐蟲R. lacteus(Arnoultet al, 2001)和香港細首紐蟲(圖2)均出現(xiàn)死亡率上升、壽命變短現(xiàn)象。一些學者認為, 褪黑激素的抗衰老效果可能與其在細胞內(nèi)清除自由基的能力有關(Anisimov, 2003)。然而, 在高濃度條件下, 褪黑激素可能成為助氧化劑(prooxidant), 進而影響動物的壽命(Anisimov, 2003; 張軍等, 2008)。

外源褪黑激素不但會影響紐蟲的壽命, 還會參與調(diào)節(jié)其它生理過程的節(jié)律, 如再生和繁殖(Arnoultet al, 1995, 1996)。對R. lacteus的研究顯示, 其體內(nèi)褪黑激素含量在繁殖期顯著低于靜止期, 外源褪黑激素可延遲性成熟(Arnoultet al, 1994)。本文實驗中,外源褪黑激素沒有阻斷去頭對香港細首紐蟲性腺發(fā)育的誘導作用, 但明顯抑制了其性腺發(fā)育速度, 且長期暴露還導致了已發(fā)育的性腺退化(圖3)。這與Arnoult等(1996)的研究結果相似, 他們認為, 褪黑激素對性腺發(fā)育的抑制作用是間接的, 即通過影響GIH的分泌而影響性腺發(fā)育。

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