王曉雯 梁 艷 邢 婧 劉旭雅 黃 倢①

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 青島 266003; 2. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所青島 266071)

Runt轉(zhuǎn)錄因子家族(RUNX)是一種在細(xì)胞增殖、分化和維持干細(xì)胞方面起著重要作用的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(Braunet al, 2009; Cohen, 2009), 普遍存在于哺乳動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物, 具有進(jìn)化保守性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 第一個(gè)Runt基因是從果蠅中被發(fā)現(xiàn)的, 它編碼一個(gè)Runt蛋白的一個(gè)結(jié)構(gòu)域(Gergenet al, 1988)。對(duì)不同物種的Runx基因研究顯示, 其編碼的蛋白產(chǎn)物都由α、β亞單位構(gòu)成異二聚體。α亞單位含有一個(gè)128個(gè)氨基酸組成的RD (Runt domain)保守域, 可介導(dǎo)RD與DNA結(jié)合及蛋白之間的相互作用(Bartfeldet al,2002; Miyazonoet al, 2004)。目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了3種Runx基因(runx1, runx2, runx3), 其中Runx1在造血系統(tǒng)中起著重要作用, Runx2與骨生成作用有關(guān), Runx3則控制胃上皮細(xì)胞的增殖(Specket al,1999)?，F(xiàn)在對(duì)哺乳動(dòng)物(尤其是人類)Runt基因功能的研究已經(jīng)很詳細(xì), 更多的研究轉(zhuǎn)向無脊椎動(dòng)物方面, 以了解Runt在分化過程中更為原始的蛋白功能。在果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)晶體細(xì)胞(crystal cells)區(qū)別于漿血細(xì)胞(plasmatocytes), 不參與細(xì)胞吞噬, 而是通過發(fā)生黑化來參與免疫反應(yīng)。晶體細(xì)胞可以表達(dá)果蠅分化必需的細(xì)胞因子Lz蛋白(一種Runt家族蛋白), 而在缺乏Lz表達(dá)的生物體內(nèi)則缺乏晶體細(xì)胞(Rizkiet al, 1959; Canonet al, 2000; Lebetskyet al, 2000)。

無脊椎動(dòng)物沒有特異性免疫系統(tǒng), 當(dāng)體外受到刺激或者造成對(duì)自身健康機(jī)體威脅時(shí), 血細(xì)胞會(huì)急劇減少。迅速地恢復(fù)血細(xì)胞, 發(fā)揮吞噬作用、黑化作用等清除異物的功能, 對(duì)機(jī)體來說很關(guān)鍵(S?derh?llet al, 1998; Johanssonet al, 2000)。因此造血作用和釋放血細(xì)胞到循環(huán)系統(tǒng)在無脊椎動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著最重要的免疫功能。Runt結(jié)構(gòu)域蛋白被證實(shí)參與了哺乳動(dòng)物和果蠅的造血作用和促進(jìn)血細(xì)胞分化作用。在軟尾太平蝲蛄(Pacifastacus leniusculus) Runt蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)注射外源葡聚糖(β-1,3-glucan), 可在短時(shí)間內(nèi)顯著提高造血細(xì)胞中Runt的轉(zhuǎn)錄量, 而proPO卻幾乎檢測(cè)不到。另外, Runt轉(zhuǎn)錄發(fā)生在顆粒細(xì)胞和半顆粒細(xì)胞中, 可能是造血細(xì)胞成熟為顆粒細(xì)胞的指示基因(S?derh?llet al, 2003), 在調(diào)節(jié)和維持血細(xì)胞數(shù)量上有著重要作用。目前尚未有關(guān)于對(duì)蝦類Runt家族蛋白的相關(guān)研究報(bào)道。

在本研究中, 作者克隆得到了凡納濱對(duì)蝦Runt基因的cDNA全長(zhǎng), 分析了其在不同組織中的轉(zhuǎn)錄分布, 以及人工注射造血激素(Astakine, AST)和感染病毒后對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的影響, 以期為進(jìn)一步了解Runt轉(zhuǎn)錄因子在無脊椎甲殼類動(dòng)物中的功能提供分析數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 凡納濱對(duì)蝦

凡納濱對(duì)蝦于2012年7月20日購(gòu)自青島寶榮水產(chǎn)公司, 體長(zhǎng)約8cm, 25尾/組, 暫養(yǎng)于50L水體中,鹽度25, 溫度26°C, 每天換水1/2, 投喂一次飼料,暫養(yǎng)一周。按國(guó)標(biāo)方法經(jīng)PCR檢測(cè)無WSSV感染(GB/T 28630.2-2012)。

1.2 白斑綜合征病毒(WSSV)毒種液

取100g本實(shí)驗(yàn)室－80°C保存的感染W(wǎng)SSV的凡納濱對(duì)蝦去除肝胰腺的頭胸甲, 剪碎, 加入預(yù)冷的TESP緩沖液(50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl, pH 8.5, 使用時(shí)加入1×蛋白酶抑制劑PMSF), 10000r/min高速勻漿5s, 8000r/min 4°C下離心5min, 取上清過篩絹, 用0.45μm濾膜過濾除菌,分裝并保存于－80°C冰箱待用。

1.3 凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞RNA的提取

取凡納濱對(duì)蝦血淋巴400μL與檸檬酸鈉抗凝劑(27mmol/L檸檬酸鈉, 336mmol/L NaCl, 115mmol/L葡萄糖, 9mmol/L EDTA.2Na)按1︰1比例混合, 1200r/min離心10min, 收集細(xì)胞沉淀, 加入800μL TRIzol (Takara),按照其附的操作方法采用氯仿抽提法提取總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 凡納濱對(duì)蝦Runt(lvrunt)全長(zhǎng)cDNA的克隆

1.4.1 同源克隆lvruntcDNA片段 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中9個(gè)已知物種Runt基因序列(軟尾太平蝲蛄,AJ506096; 果蠅, AF217651和X56432; 紫色球海膽,U41512; 薩氏九杯蛛, AJ272529; 爪蟾, AF035446;原雞, Z36530; 小家鼠, D26532; 人, L34598), 設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物runt-F和runt-R (表1)。以凡納濱對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行同源克隆, 獲取Runt cDNA的部分片段。25μL反應(yīng)體系中含10μL 10×Buffer, 8μL 2.5mmol/L dNTP, 各1μL的10mmol/L runt-F和runt-R, 0.2μL 5U/μL Ex Taq酶(Takara), 1 μL cDNA模板, 于94°C預(yù)變性5min, 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s, 35個(gè)循環(huán), 72°C延伸10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過膠回收后進(jìn)行TA克隆(Frolanmanet al, 1988),并將陽(yáng)性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

根據(jù)同源克隆獲得的cDNA片段序列設(shè)計(jì)特異性引物GSPI、NP3、GSPII和NP5, 分別用于RACE實(shí)驗(yàn), 引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的引物序列Tab.1 Primers used in the experiment

1.4.2lvrunt基因的5′-RACE 5′-RACE擴(kuò)增使用了商品試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech, 美國(guó)), 以提取的總RNA(濃度為200μg/μL)為模板, 按其使用手冊(cè)方法合成5′- RACEReady cDNA。以基因特異性引物GSPII (5′)和NP5分別與UPM(通用接頭引物, 試劑盒提供)為引物,5'-RACE-Ready cDNA為模板進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增。20μL體系中含10μL 10×Buffer, 8μL 2.5mmol/L dNTP,各1μL的10mmol/L GSPII(5′)(NP5)和UPM, 0.2μL 5U/μL Ex Taq酶(TaKaRa), 1μL cDNA模板。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TA克隆后送華大基因公司測(cè)序, 獲取lvruntcDNA的5′末端序列。

1.4.3lvrunt基因的3′-RACElvrunt基因的3′- RACE擴(kuò)增使用了商品試劑盒Trans Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix Kit(TransGen, 北京), 以提取的總RNA(濃度為200μg/μL)為模板, 用接頭引物3′CDs-primerA取代試劑盒中的Oligo(dT)18, 合成3′-RACE-cDNA。20μL體系中含500ng RNA模板,10pmol 3′CDs-primerA, 10μL 2×TS Reaction Mix,1μL Enzyme Mix, 42°C保溫30 min后, 于85°C終止反應(yīng)5min, 冰上冷卻。以基因特異性引物GSPI(3′)和UPM(試劑盒提供)為引物, 3′-RACE-cDNA為模板,進(jìn)行第一輪PCR; 再以此擴(kuò)增產(chǎn)物為模板, 用基因特異性引物NP3和接頭引物UPM, 進(jìn)行套式PCR, 2次PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94°C預(yù)變性5min; 94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 40s循環(huán)數(shù)為10; 94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 40s, 循環(huán)數(shù)為25; 72°C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TA克隆后并測(cè)序, 以獲得lvruntcDNA3′端序列。

1.5 lvrunt全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼的多肽序列分析

用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和在線SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de)分析全長(zhǎng)lvruntcDNA序列及其編碼的多肽序列, 利用Clustaxl軟件對(duì)該基因編碼氨基酸和其它種類的runt-family編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì), 利用MEGA5.1軟件建立進(jìn)化樹。

1.6 lvrunt基因的組織表達(dá)分析

隨機(jī)選取凡納濱對(duì)蝦3尾, 分別采集其鰓、腸、肝胰腺、類淋巴、心臟、肌肉組織和血淋巴, 按1.4方法用氯仿抽提法提取總RNA。以提取的總RNA (濃度為300μg/μL)為模板, 采用Trans Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒(TransGen, 北京),以O(shè)ligo(dT)為反轉(zhuǎn)錄引物, 按試劑盒操作手冊(cè)合成cDNA。根據(jù)已得到的lvrunt基因序列設(shè)計(jì)引物(Lvrunt-F, Lvrunt-R), 并以凡納濱對(duì)蝦18S rRNA (引物設(shè)計(jì)為18S-F, 18S-R)作為內(nèi)參, 使用Bio-Rad熒光定量PCR儀, 對(duì)各組織lvrunt表達(dá)量進(jìn)行分析, 熒光定量PCR反應(yīng)條件為: 95°C預(yù)變性5min, 95°C 15s,61°C 30s, 40個(gè)循環(huán)。設(shè)定腸中該基因的表達(dá)量為“1”,結(jié)果采用2–ΔΔCt法計(jì)算, 用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 注射重組表達(dá)的凡納濱對(duì)蝦造血激素(rLvAST)對(duì)lvrunt基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

選用凡納濱對(duì)蝦225尾(25尾/箱)分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 每組3個(gè)平行, 各25尾, 分別于第二腹節(jié)肌肉注射50μL的PBS、BSA(50μg)和BSA與rLvAST(各25μg)混合物, 每組3個(gè)平行。分別于注射后0、3、6、12、24、36、48和72h采集2尾對(duì)蝦的血淋巴, 按1.6方法測(cè)定lvrunt表達(dá)量。

軟件定義天地一體化網(wǎng)絡(luò)：架構(gòu)、技術(shù)及挑戰(zhàn)…………………………許方敏，仝宗健，趙成林，秦智超 24-2-59

1.8 白斑綜合征病毒感染后凡納濱對(duì)蝦Runt基因的表達(dá)分析

選取凡納濱對(duì)蝦30尾, 在對(duì)蝦第二腹節(jié)肌肉內(nèi)注射20μL稀釋了1000倍的WSSV毒種液, 感染凡納濱對(duì)蝦, 于感染后0、1、7、12h和3、5和10d抽取對(duì)蝦血淋巴, 按1.6方法檢測(cè)lvrunt表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 凡納濱對(duì)蝦Runt基因(lvrunt)全長(zhǎng)的擴(kuò)增

通過在線軟件CODEHOP設(shè)計(jì)了不同種類Runt基因的保守區(qū)上下游簡(jiǎn)并引物, 對(duì)從凡納濱對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增, 得到174bp產(chǎn)物(圖1a), 經(jīng)測(cè)序和初步分析, 序列所編碼的氨基酸序列與Runt基因保守區(qū)編碼的氨基酸序列相似, 確定所獲產(chǎn)物為lvrunt片段的部分序列。

根據(jù)已知的lvrunt部分序列進(jìn)行5′-RACE, 設(shè)計(jì)外側(cè)引物GSPII (5′), 與接頭引物進(jìn)行第一次擴(kuò)增,得到了一條大約500bp的條帶(圖1b)。將第一次擴(kuò)增所得產(chǎn)物稀釋10倍作為模板, 用內(nèi)側(cè)引物NP5進(jìn)行套式PCR, 獲得約500bp的特異條帶(圖1c), 經(jīng)測(cè)序獲得核苷酸序列466bp。

根據(jù)已知的lvrunt部分序列進(jìn)行3′-RACE, 設(shè)計(jì)外側(cè)引物GSPI (3′), 與接頭引物UPM一起對(duì)凡納濱對(duì)蝦血淋巴來源的cDNA進(jìn)行第一次擴(kuò)增, 獲得彌散分布的產(chǎn)物(圖1d), 再以第一次擴(kuò)增產(chǎn)物的1/50稀釋度為模板, 用內(nèi)側(cè)引物NP3進(jìn)行套式PCR, 獲得約1000bp的特異條帶(圖1e), 經(jīng)測(cè)序, 得到1040bp核苷酸序列。

根據(jù)5′-RACE和3′-RACE所得序列, 拼接得到lvrunt的全長(zhǎng)序列。

2.2 lvrunt全長(zhǎng)序列特征

拼接所得的凡納濱對(duì)蝦runt的cDNA全長(zhǎng)序列共1754bp(圖2), 經(jīng)分析, 該全長(zhǎng)序列中含有1個(gè)663bp開放閱讀框(ORF), 編碼221aa, 理論分子量為23.6kDa, 5′-UTR (非編碼區(qū))為466bp, 3′-UTR(非編碼區(qū))為625bp, 其中包含1個(gè)PolyA尾, 并出現(xiàn)一加尾信號(hào)。

2.3 凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄因子(LvRunt)蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄因子(LvRunt)通過估算, 分子量為23.6kDa, 預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為7.57。通過SMART、NCBI、OMIGA的分析表明LvRunt蛋白序列的第4—148個(gè)氨基酸范圍內(nèi)是一個(gè)runt-family結(jié)構(gòu)域(圖3),53—139aa為IG_FLMN域(細(xì)絲蛋白型的免疫球蛋白域), 62—89aa為KOW模體, 104—111aa為ATP/GTP結(jié)合模體, 46—50aa為DNA結(jié)合區(qū)域, 210—219aa是低復(fù)雜性區(qū)域(LCR)。

圖1 凡納濱對(duì)蝦Runt基因全長(zhǎng)的分段擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of the fragments of L. vannamei Runt gene full-length

圖2 凡納濱對(duì)蝦Runt基因cDNA全長(zhǎng)序列及編碼氨基酸序列Fig.2 The full-length nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of L. vannamei runt gene cDNA

2.4 不同種類Runt保守性分析

從GenBank上獲得了分別屬于扁形動(dòng)物門、節(jié)肢動(dòng)物動(dòng)物、半索動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的16個(gè)不同物種的Runt蛋白氨基酸序列, 通過Mega 5.05軟件進(jìn)行保守性分析(圖4)。結(jié)果表明凡納濱對(duì)蝦Runt氨基酸序列與軟尾太平蛄(Pacifastacus leniusculus)(CAD 44570.1)的相似度為88.1%, 與麗蠅蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)(XP_001603414.2)有74.3%的相似度, 與埃及伊蚊(Aedes aegypt)(XP_001657548.1)有61%的相似度, 與其他種類的氨基酸序列相似性在30%—52.4%范圍內(nèi), 該蛋白表現(xiàn)較高的種間保守性。另外,這些Runt蛋白均有一個(gè)runt-family結(jié)構(gòu)域runt domain(RD)。凡納濱對(duì)蝦Runt蛋白的RD與軟尾太平蝲蛄的相似度高達(dá)97.7%, 與其他物種蛋白的相似度在72.3%—97.7%(圖5)。

圖3 凡納濱對(duì)蝦runt氨基酸序列的SMART蛋白功能分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The SMART analysis for the protein function and the secondary structure prediction on the ammonia acid sequence of the L.vannamei runt

圖4 利用NJ法繪制的不同動(dòng)物的Runt同源蛋白進(jìn)化樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenic tree of amino acid sequences of runt genes and its homologous gene runx from different species

2.5 lvrunt基因在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的不同組織表達(dá)差異

以18S rRNA為目的基因, 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)lvrunt在凡納濱對(duì)蝦不同組織的表達(dá)分析, 檢測(cè)到這7種組織均有l(wèi)vruntmRNA的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過溶解曲線驗(yàn)證了擴(kuò)增的特異性, 不存在非特異性擴(kuò)增及引物二聚體的干擾。根據(jù)2-ΔΔCt方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析, 以腸組織作為校正樣品(Calibrator), 表達(dá)量設(shè)為1, 比較不同組織中l(wèi)vrunt在凡納濱對(duì)蝦組織中的表達(dá)(圖6)。結(jié)果顯示lvruntRNA在血淋巴中表達(dá)量最大, 顯著高于其他組織, 是其他組織中表達(dá)量的20—346倍。由于對(duì)蝦是開放的循環(huán)系統(tǒng), 各組織中均有血淋巴細(xì)胞的存在, 推測(cè)其他組織中l(wèi)vrunt的表達(dá)很可能都是由于組織中血淋巴細(xì)胞的表達(dá)所致,換而言之,lvrunt基因的表達(dá)可能作為組織中血淋巴細(xì)胞量的一種指示。

2.6 注射對(duì)蝦造血激素(Astakine)后lvrunt基因轉(zhuǎn)錄水平變化

對(duì)凡納濱對(duì)蝦注射PBS、BSA和BSA+rLvAST的三個(gè)組的lvrunt轉(zhuǎn)錄量均在注射6h達(dá)到峰值(圖7),BSA+AST組的lvrunt表達(dá)量急升到原來的接近600倍, 12h內(nèi)下降并基本維持穩(wěn)定, 但72h內(nèi)仍然高于初始基本水平。其中BSA和BSA+AST注射組Runt基因表達(dá)量明顯高于PBS注射組, 而BSA+AST注射組lvrunt基因表達(dá)量約為BSA注射組的3.35倍, 差異顯著(P<0.05)。

圖5 不同種類的Runt結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)Fig.5 Sequence alignment of the Runt domain in different species

圖6 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR對(duì)lvrunt在凡納濱對(duì)蝦不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.6 Quantitative analysis of the lvrunt mRNA in different tissues of L. vannamei by real-time RT-PCR

2.7 注射WSSV后lvrunt基因的表達(dá)變化

凡納濱對(duì)蝦經(jīng)注射WSSV毒種液后, 其血淋巴中的lvrunt表達(dá)經(jīng)熒光定量PCR分析(圖8), 顯示在注射后12h, 凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞的lvrunt轉(zhuǎn)錄量達(dá)到最大值, 達(dá)到正常值的25倍左右。但隨著時(shí)間延長(zhǎng), 在感染后第3天顯著下降, 但仍比初始水平高約5倍左右, 隨著感染進(jìn)程的延伸,lvrunt的表達(dá)量又逐漸升高, 在10d時(shí)達(dá)到初始水平的10倍左右。

圖7 注射造血激素后凡納濱對(duì)蝦血淋巴中Runt轉(zhuǎn)錄水平情況Fig.7 Expression levels of lvrunt in hemocytes after injection of rLvAST

圖8 感染W(wǎng)SSV后凡納濱對(duì)蝦血淋巴Runt基因轉(zhuǎn)錄量分析Fig.8 Temporal expression patterns of lvrunt in hemocytes after challenged with WSSV

3 討論

Runt基因是普遍存在于多種生物的一種轉(zhuǎn)錄因子, 含有一個(gè)DNA結(jié)合域(Runt Domain), 這個(gè)結(jié)合域從昆蟲到哺乳動(dòng)物都高度保守(Kagoshimaet al,1993; Wolffet al, 1999; Kataokaet al, 2000)。本研究克隆得到的凡納濱對(duì)蝦的Runt蛋白序列中就包含了這個(gè)runt family功能區(qū)域, 并與軟尾太平喇姑有高達(dá)97.7%的相似度, 與其他種類也是相對(duì)保守的, 這可能與Runt在不同生物的生命活動(dòng)中發(fā)揮的作用相似有關(guān)。據(jù)報(bào)道, 最早發(fā)現(xiàn)的果蠅體內(nèi)的Runt結(jié)構(gòu)域基因runt和lozenge可以在生長(zhǎng)過程中發(fā)揮多種作用,并且lozenge可以促進(jìn)晶體血細(xì)胞的分化(Canonet al,2000)。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)了三類Runt基因, 證明是造血作用和骨生成必不可少的因子(Westendorfet al, 1999; Linggiet al, 2002; Ottoet al, 2002)。還有研究還表明, Runt基因的缺失會(huì)影響細(xì)胞周期蛋白B(cyclin B)與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶cdc 2(cell division cycle)復(fù)合物的活性, cyclin B-cdc 2復(fù)合物不僅決定細(xì)胞是否進(jìn)入M期, 也決定細(xì)胞是否能退出M期。如果細(xì)胞不進(jìn)入M期它將不進(jìn)行分裂, 如果在M期退不出來會(huì)使細(xì)胞過度增殖, 產(chǎn)生腫瘤等有害影響(翟中和等, 2002; 曾亞, 2004)。本文克隆結(jié)果表明, 凡納濱對(duì)蝦僅存在一種Runt基因(lvrunt), 這與兩棲動(dòng)物和海膽中只存在一種基因類型的報(bào)道是一致的(葛輝等, 2007)。lvrunt序列與軟尾太平蝲蛄相比, 在Runt結(jié)構(gòu)域相似度很高, 但是RD下游的序列差異較大, 并且沒有Runt基因常見的VWRPY序列作為C末端, 這一motif不會(huì)或者很少會(huì)影響轉(zhuǎn)錄活性(Okudaet al, 2000), 可能會(huì)在促進(jìn)DNA結(jié)合的功能上產(chǎn)生一些差異(Kagoshimaet al, 1993)。

對(duì)凡納濱對(duì)蝦Runt基因的不同組織表達(dá)分析顯示,lvrunt幾乎只在血淋巴有表達(dá), 在其他組織的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于血淋巴, 可以認(rèn)為是分析其他組織時(shí)候有部分血細(xì)胞存在的影響, 因此Runt的表達(dá)量也可能作為組織中血細(xì)胞數(shù)量的一個(gè)分子指標(biāo)。表達(dá)組織分布結(jié)果也揭示了lvrunt在血液系統(tǒng)中發(fā)揮著主要作用, 這與Runt在果蠅內(nèi)促進(jìn)血細(xì)胞分化, Runx1在高等哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有造血功能的研究結(jié)果相吻合(Specket al, 1999)。

已有研究表明, 造血激素在螯蝦體內(nèi)有促進(jìn)造血和血細(xì)胞分化的作用, 而Runt也有促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和血細(xì)胞分化作用。實(shí)驗(yàn)中注射了造血激素后, 對(duì)蝦血淋巴中l(wèi)vrunt轉(zhuǎn)錄水平顯著增加, 可見造血激素促進(jìn)了Runt基因轉(zhuǎn)錄。尤其是在注射后6hlvrunt轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高值, 這樣可能會(huì)通過細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo), 進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂狀態(tài)。對(duì)凡納濱對(duì)蝦注射WSSV后12h,lvrunt轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值。有研究顯示, 斑節(jié)對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后12h總血淋巴數(shù)(THC)達(dá)到一個(gè)最低值, 但這時(shí)WSSV在體內(nèi)的感染應(yīng)該還處于潛伏期, 病毒含量沒有達(dá)到很高水平(張濤等, 2012), 而在3—10d的時(shí)期是WSSV感染的高峰期,lvrunt的表達(dá)卻比12h時(shí)低得多, 這提示lvrunt的表達(dá)不是因?yàn)閃SSV感染所致, 12h時(shí)lvrunt的高表達(dá)可能是由于血淋巴細(xì)胞對(duì)異物刺激發(fā)生反應(yīng), 數(shù)目急劇下降, 通過活化lvrunt的轉(zhuǎn)錄, 來促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化, 以使機(jī)體有能力參與免疫反應(yīng)。

本文通過RACE方法克隆得到了凡納濱對(duì)蝦的Runt基因的序列, 是首個(gè)關(guān)于對(duì)蝦屬的相關(guān)研究。本文還通過該基因的組織表達(dá)分布特征分析, 揭示其主要在血淋巴細(xì)胞表達(dá), 這可能與其作用有關(guān)。并且采用熒光定量 PCR的方法分析了凡納濱對(duì)蝦在注射rLvAST和經(jīng)過WSSV感染后的轉(zhuǎn)錄變化, 初步了解lvrunt的表達(dá)狀況, 為更深入了解對(duì)蝦的造血機(jī)制以及參與對(duì)蝦免疫作用奠定了基礎(chǔ)。

張 濤, 郭志勛, 黃建華等, 2012. 低劑量對(duì)蝦白斑綜合征病毒粗提液對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)潛伏期病毒及血細(xì)胞的影響.水產(chǎn)學(xué)報(bào), 36(10): 1544—1552

葛 輝, 王秀利, 仇雪梅等, 2007. 海膽Runt基因保守序列的克隆與初步分析. 生物技術(shù)通報(bào), 4: 125—127

曾 亞, 2004. 國(guó)外醫(yī)學(xué)——生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè), 22(2):103—105

翟中和, 王喜忠, 丁明孝, 2000. 細(xì)胞生物學(xué). 北京: 高等教育出版社, 358—372

Bartfeld D, Shimon L, Graeme C Coutureet al, 2002. DNA recognition by the RUNX1 transcription factor is mediated by an allosteric transition in the RUNT domain and by DNA bending. Structure, 10: 1395—1407

Braun T, Woollard A, 2009. RUNX factors in development:lessons from invertebrate model systems. Blood Cells,Molecules, and Diseases, 43: 43—48

Canon J, Banerjee U, 2000. Runt and Lozenge function inDrosophiladevelopment. Semin Cell Dev Biol, 11(5): 327—336

Cohen M M Jr, 2009. Perspectives on RUNX genes: an update.American Journal of Medical Genetics Part A, 149A: 2629—2646

Gergen J P, Butler B A, 1988. Isolation of theDrosophilasegmentation gene runt and analysis of its expression during embryogenesis. Genes & Development, 2: 1179—1193

Johansson M W, Keyser P, Sritunyaluksana Ket al, 2000.Crustacean hemocytes and haematopoiesis. Aquaculture, 191:45—52

Kagoshima H, Shigesada K, Satake Met al, 1993. The runt domain identifies a new family of heterometric transcriptional regulators. Trends in Genetics, 9(10): 338—341

Kataoka H, Ochi M, Enomoto Ket al, 2000. Cloning and embryonic expression patterns of the zebrafish Runt domain genes, runxa and runxb. Mechanisms of Development, 98:139—143

Lebetsky T, Chang T, Hartenstein Vet al, 2000. Specification ofDrosophilahematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science, 288: 146—149

Linggi B, Muller-Tidow C, Van de Locht Let al, 2002. The fusion protein, AML1 ETO, specifically represses the transcription of the p14(ARF) tumor suppressor in acute myeloid leukemia. Nature Medicine, 8: 743—750

Miyazono K, Maeda S, 2004. Imamura T coordinate regulation of cell growth and differentiation by TGF-β superfamily and Runx proteins. Oncogene, 23: 4232—4237

Okuda T, Takeda K, Fujita Yet al, 2000. Biological characteristics of the leukemia-associated transcriptional factor AML1 disclosed by hematopoietic rescue of AML1-deficient embryonic stem cells by using knock-in strategy. Molecular and Cellular Biochemistry, 20: 319—328

Otto F, Kanegane H, Mundlos S, 2002. Mutations in the RUNX2 gene in patients with cleidocranial dysplasia. Human Mutation, 19: 209—216

Rizki M T M, Rizki R, 1959. Functional significance of the crystal cells in the larva ofDrosophila melanogaster.Cytology, 5: 235—240

S?derh?ll I, Bangyeekhun E, Mayo Set al, 2003. Hemocyte production and maturation in an invertebrate animalproliferation and gene expression in heatopoietic stem cells ofPacifastacus leniusculus. Developmental and Comparative Immunology, 27: 661—672

S?derh?ll K, Cerenius L, 1998. Role of phenoloxidase activating system in invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology, 10: 23—28

Speck N A, Stacy T, Wang Qet al, 1999. Core-binding factor: a central player in hematopoiesis and leukemia. Cancer Research, 59: 1789—1793

Westendorf J J, Hiebert S W, 1999. Mammalian runt-domain proteins and their roles in hematopoiesis, osteogenesis, and leukemia. Journal of Cellular Biochemistry-Supplement,32/33: 51—58

Wolff C, Pepling M, Gergen Pet al, 1999. Structure and evolution of a pair-rule interaction element: runt regulatory sequences inD. melanogasterandD. virilis. Mechanisms of Development, 80(1): 87—99