蔡 巖 周永燦 馮永勤 吳開暢 謝珍玉 郭偉良 王世鋒①

(1. 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南大學(xué) ?？?570228;2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 廣州 510300)

法螺(Chanoria tritonisLinnaeus)隸屬于軟體動(dòng)物門Mollusca、腹足綱Gastropoda、中腹足目Mesogastropoda、嵌線螺科Cymatiidae、法螺屬Charonia, 為大型珊瑚礁單殼貝類, 因其貝殼具有美麗的孔雀羽毛狀的花紋, 又名鳳尾螺, 是世界著名的四大觀賞貝類之一,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(張素萍等, 2004)。此外, 由于法螺是珊瑚礁敵害生物長(zhǎng)棘海星的天敵, 因而在熱帶珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中還扮演著珊瑚保衛(wèi)者的重要角色。然而近年來巨額的經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)吸引人們大量捕撈法螺,加之環(huán)境污染、珊瑚礁棲息地的破壞等因素, 致使法螺自然資源受到嚴(yán)重破壞, 很多世界著名的熱帶珊瑚礁海域法螺已難覓蹤跡(Endean, 1982; Antonelliet al, 1984; Bellwoodet al, 2004)。為了保護(hù)法螺這一獨(dú)特而美麗的物種, 開展法螺生物資源的保護(hù)及繁育工作迫在眉睫。核型分析是開展雜交育種、多倍體誘導(dǎo)和雌核發(fā)育等遺傳育種工作的基礎(chǔ), 對(duì)生物分類和系統(tǒng)演化研究也具有重要意義。然而由于法螺的活體樣本的獲得較為困難, 迄今為止, 法螺染色體數(shù)目與核型的研究尚未見報(bào)道。本文以法螺的面盤幼體為材料, 對(duì)法螺染色體數(shù)目與核型進(jìn)行了研究, 以期為法螺細(xì)胞遺傳學(xué)、遺傳育種學(xué)提供基礎(chǔ)資料, 并為最終法螺生物資源的保護(hù)與可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

法螺親螺采自南海西沙附近海域, 于三亞水產(chǎn)技術(shù)推廣站室內(nèi)水池中飼養(yǎng)數(shù)月后, 于繁殖季節(jié)收集法螺卵囊, 在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)人工孵化得到法螺面盤幼體。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

收集法螺面盤幼蟲放入含有0.5g/L的秋水仙素海水中處理2—3h, 用0.075mol/L的KCl溶液低滲45min, 以500轉(zhuǎn)/min離心5min; 棄上清液, 輕輕彈散沉淀, 緩慢加入低滲液, 37°C水浴20—40min; 500轉(zhuǎn)/min離心5min, 去上清液, 打散沉淀, 緩慢加入適量新配制的卡諾氏固定液, 室溫固定20min, 之后重復(fù)此步驟兩次(即固定3次); 然后置于冰箱(–20°C)內(nèi)過夜備用。制備染色體標(biāo)本前, 棄去上清后, 在幼蟲懸液中加入體積分?jǐn)?shù)為50%的冰醋酸吹打均勻, 熱制片自然風(fēng)干。以雙蒸水︰Giemsa原液 = 20︰1的比例配制Giemsa染液, 對(duì)玻片進(jìn)行染色, 時(shí)長(zhǎng)為15—20min, 染色完成后即用雙蒸水將玻片沖洗干凈, 自然晾干后置于顯微鏡下觀察, 初步保留分裂較好的中期分裂相標(biāo)本, 以便在油鏡下觀察、拍照。

染色體的形態(tài)分組以對(duì)10個(gè)中期分裂相測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)值為依據(jù), 參照Levan等(1964)的建議標(biāo)準(zhǔn),將染色體分為中部著絲粒染色體(m)、亞中部著絲粒染色體(sm)、亞端部著絲粒染色體(st)和端部著絲粒染色體(t)。染色體的臂數(shù)按中部和亞中部著絲粒染色體(m組和sm組)作為雙臂, 亞端部和端部著絲粒染色體(st組和t組)作為單臂計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 法螺染色體的二倍體數(shù)目

在顯微鏡下對(duì)法螺分散良好的100個(gè)中期分裂相進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù), 并經(jīng)過拍照和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì), 確定其二倍體數(shù)目。結(jié)果表明, 法螺染色體的二倍體數(shù)目2n=70 (表1), 非眾數(shù)部分的染色體數(shù)目可能是由于制片處理過程中藥品的處理與人為因素導(dǎo)致的染色體數(shù)目的丟失, 或者是細(xì)胞重疊造成的。

2.2 法螺的染色體核型分析

本實(shí)驗(yàn)所獲得的法螺細(xì)胞的中期分裂相形態(tài)較清晰, 著絲點(diǎn)部位較為突出。通過測(cè)量計(jì)算, 獲得法螺的染色體的相對(duì)長(zhǎng)度(RL)和臂比(AR), 如表2所示。根據(jù)Levan等(1964)的染色體分類標(biāo)準(zhǔn), 以著絲點(diǎn)的位置確定染色體類型?？梢缘贸龇輥喍瞬恐z粒染色體(st)為10對(duì); 亞中部著絲粒染色體(sm)為9對(duì); 中部著絲粒染色體(m)為16對(duì)。

通過對(duì)10個(gè)中期分裂相進(jìn)行測(cè)量、統(tǒng)計(jì)和分析,選取一個(gè)最好的中期分裂相(圖1), 利用測(cè)量的數(shù)據(jù)結(jié)果對(duì)中期分裂相中的同源染色體進(jìn)行配對(duì), 獲得染色體配對(duì)對(duì)數(shù)為35對(duì), 經(jīng)過圖片剪貼, 構(gòu)建出法螺的核型, 見圖2。圖2中2號(hào)和16號(hào)染色體缺失部位可能為染色體次縊痕。另外在一定比例的法螺核型中出現(xiàn)了一對(duì)異形染色體, 推測(cè)可能為性染色體, 有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表1 法螺二倍體染色體計(jì)數(shù)結(jié)果Tab.1 The counting results of diploid chromosome numbers in C. tritonis

表2 法螺染色體的核型指數(shù)Tab.2 Karyotype indices of C. tritonis

圖1 法螺染色體中期分裂相Fig.1 The metaphase of chromosomes of C. tritonis

圖2 法螺核型圖Fig.2 The karyotype of C. tritonis

3 討論

全世界現(xiàn)存軟體動(dòng)物約11.5萬種, 其中腹足綱約88000種(周暾等, 1988), 已知染色體數(shù)目的腹足類僅291種(Thiriot-quiévreux, 2003)。已記載分布于我國(guó)的軟體動(dòng)物約4000余種(孫振興, 2004), 其中相當(dāng)一部分是腹足綱貝類, 但有染色體研究報(bào)道的腹足綱貝類僅10科17屬27種(表3), 僅占我國(guó)貝類總數(shù)的0.68%。而中國(guó)魚類中僅淡水種類已知核型的就達(dá)200余種(余先覺等, 1989)?？梢娤啾扔谄渌锓N, 我國(guó)貝類染色體研究還相對(duì)滯后。這與貝類本身染色體較小, 貝類成體染色體制備技術(shù)尚不完善, 貝類幼體及胚胎染色體制備受繁殖季節(jié)限制等制約因素有關(guān)。

從表3歸納的情況來看, 中國(guó)腹足綱貝類染色體2n數(shù)目類型變異較多, 而且不連續(xù)。如, 蛾螺科內(nèi)4個(gè)屬就有4個(gè)2n數(shù): 30、34、60、66; 田螺科的3個(gè)屬有3個(gè)2n數(shù): 16、18、24。這表明同一科不同屬或種之間的染色體數(shù)目存在較大差異。但從染色體數(shù)目同樣可以看出, 同一個(gè)屬的種類染色體數(shù)目相同的居多, 如角螺屬、荔枝螺屬、東風(fēng)螺屬、環(huán)棱螺屬、圓田螺屬等。這又在一定程度上體現(xiàn)了同屬腹足綱貝類在其生物進(jìn)化過程中染色體數(shù)目的保守性。

早期研究認(rèn)為, 貝類染色體數(shù)和系統(tǒng)分類有著顯著的關(guān)系, 分類地位越原始, 其染色體數(shù)越少, 分化越高, 其染色體數(shù)就越多(稻葉明彥, 1985; 王梅林等, 2004; 曹伏君等, 2008)。目前, 較多研究結(jié)果也都印證了這一理論(王先志等, 1990; 葉冰瑩等, 1995;陳菲等, 2011)。如Nishikawa(1962)研究顯示原始腹足目染色體單倍體數(shù)多在9—21之間, 而中腹足目染色體的單倍體數(shù)多在15—18之間, 新腹足目染色體單倍體數(shù)多在在28—36之間。近年來, 我國(guó)發(fā)表的貝類染色體研究成果中, 染色體數(shù)最多的種類(香螺,2n=60; 細(xì)角螺, 管角螺, 2n=60; 泥東風(fēng)螺, 方斑東風(fēng)螺, 2n=66)也都隸屬于新腹足目(王先志等, 1990;曹伏君等, 2008; 陳菲等, 2011)。然而本研究對(duì)我國(guó)已進(jìn)行過染色體核型研究的腹足綱貝類(表3)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)表明, 染色體數(shù)目最少的田螺科三種環(huán)棱螺(角形環(huán)棱螺Bellamya angularis, 銅銹環(huán)棱螺Bellamya aeruginosa, 方形環(huán)棱螺Bellamya quadrata, 2n=16)和染色體數(shù)目最多的嵌線螺科的法螺(2n=70)同屬于分類地位居中的中腹足目。Thiriot-quiévreux(2003)對(duì)全世界291種腹足綱貝類染色體核型統(tǒng)計(jì)亦顯示, 原始腹足目染色體單倍體數(shù)范圍為8—18之間, 中腹足目染色體的單倍體數(shù)范圍在7—36之間, 新腹足目的單倍體數(shù)范圍在13—36之間, 即中腹足目染色體數(shù)變化范圍最大。由此可見, 若依據(jù)最新的腹足綱貝類研究成果, 至少在目的級(jí)別上, 染色體數(shù)越多進(jìn)化地位越高的理論是不完全適用的。然而, 筆者同時(shí)也注意到, 若比較Thiriot-quiévreux(2003)研究中各目染色體數(shù)的平均值, 則原始腹足目<中腹足目<新腹足

目, 即原有的染色體數(shù)增加與進(jìn)化相關(guān)的理論將依然成立。在腹足綱貝類中, 究竟是染色數(shù)較多的種類較為進(jìn)化, 還是染色體較少的種類較為進(jìn)化, 在科學(xué)界還有一定爭(zhēng)論。如王先志等(1990)在觀察了蛾螺科三種螺的核型后認(rèn)為, 染色體數(shù)相近的種類,也可能染色體數(shù)較少的種類較為進(jìn)化。因?yàn)椴荒芘懦旧w減少形成新物種的可能。筆者認(rèn)為, 究竟貝類染色體數(shù)目與進(jìn)化是何關(guān)系現(xiàn)在下結(jié)論還為時(shí)過早, 畢竟已知染色體數(shù)的腹足類還不到腹足類總數(shù)的1%, 大量數(shù)據(jù)還有待補(bǔ)充。另外, 在不同生物類群中核型的演化方式和方向可能不同, 應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況加以分析, 不能一概論之。最后, 探討染色體與進(jìn)化的關(guān)系亦不能簡(jiǎn)單停留在染色體數(shù)目和組成上, 還應(yīng)包括染色體形態(tài), 結(jié)構(gòu)等多方面特征來綜合判斷。

表3 我國(guó)若干腹足綱貝類的染色體組型Tab.3 The karyotype of some Chinese Gastropoda

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