黃 文 楊憲寬 徐 新 肖 玲 李水生 趙會宏 張海發(fā) 張 勇① 林浩然,

(1. 中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點實驗室 廣州 510275; 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院廣州 510642; 3. 廣東省海洋漁業(yè)試驗中心 惠州 516081; 4. 海南大學(xué)海洋學(xué)院 ?？?570228)

石斑魚是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類, 屬鱸形目(Perciformes)、科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)。石斑魚肉質(zhì)鮮美, 營養(yǎng)豐富, 為餐桌中的上等佳肴,深受各地消費者的喜愛, 在熱帶和亞熱帶地區(qū)的沿海漁業(yè)中占有重要地位(Pierreet al, 2008)。

我國大陸石斑魚人工養(yǎng)殖興起于20世紀(jì)80年代(馬榮和等, 1987)。隨后, 我國學(xué)者圍繞石斑魚人工繁育進(jìn)行研究, 在親魚培育和產(chǎn)卵、苗種培育技術(shù)以及石斑魚的病害防治技術(shù)等方面取得突破, 促進(jìn)了石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的社會化分工, 在我國南方形成了石斑魚苗種繁育和健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)(劉付永忠等, 2000; 陳國華等, 2001)。

由于石斑魚是典型的雌雄同體、雌性先熟種類,高齡魚才性轉(zhuǎn)變?yōu)樾埕~。這種狀況造成了在人工繁育中往往存在雄魚缺乏或雌雄不同步的現(xiàn)象, 嚴(yán)重制約了石斑魚人工繁育工作的開展。在自然海域, 雌性斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)的初次性成熟年齡為3—4齡, 人工培育條件下可提前至2.5齡, 其發(fā)生性轉(zhuǎn)變的年齡至少在4齡以上(趙會宏等, 2003)。已有研究表明, 應(yīng)用外源激素可以誘導(dǎo)石斑魚雌魚提早發(fā)生性轉(zhuǎn)變?yōu)樾埕~, 能夠滿足繁殖的需要(方永強(qiáng)等, 1992; 鄒記興等, 2000)。石斑魚性別控制技術(shù)的研究與推廣應(yīng)用, 將為石斑魚類種苗的穩(wěn)定大批量生產(chǎn)提供技術(shù)保證。

有些魚類如羅非魚(Oreochromis)和異育銀鯽(Allogynogenetic crucian carp,Carassius auratus gibelio)等, 在發(fā)育早期經(jīng)一定劑量的雄激素處理后就能產(chǎn)生出功能性的雄魚(張甫英等, 2000; 王揚(yáng)才等,2003)。石斑魚是典型的雌雄同體魚類, 其性腺中同時存在雌性和雄性生殖細(xì)胞, 如果受到雄激素的刺激,性腺就有可能朝著雄性化的方向發(fā)育。因此, 本文作者在研究斜帶石斑魚性腺發(fā)育過程的基礎(chǔ)上, 在性腺發(fā)育早期投喂甲基睪酮(MT)激素, 以誘導(dǎo)石斑魚幼魚雄性化。

1 材料與方法

1.1 樣品

斜帶石斑魚均養(yǎng)殖于廣東省海洋漁業(yè)試驗中心,分別選取3、6、9、12、18、24、30、36月齡的石斑魚, 解剖后取性腺, 用Bouin’s液固定。選取8月齡斜帶石斑魚幼魚用于雄激素誘導(dǎo)性分化實驗, 設(shè)1個對照組, 2個實驗組, 每組2個網(wǎng)箱, 分別養(yǎng)殖在6個網(wǎng)箱中(網(wǎng)箱大小: 1.5m×1.5m×1.5m), 每個網(wǎng)箱100尾, 共600尾魚, 在自然水溫(26—30°C) 條件下, 流水飼養(yǎng)到6個月。實驗重復(fù)1次。

1.2 方法和處理

1.2.1 不同年齡階段石斑魚性腺發(fā)育狀況 對不同年齡階段的斜帶石斑魚性腺, 經(jīng)石蠟切片, H.E染色, 觀察和拍照, 確定斜帶石斑魚性腺分化和發(fā)育時期。

1.2.2 雄激素誘導(dǎo)性別分化 對實驗組的斜帶石斑魚幼魚, 投喂含有10mg/kg MT激素的配合飼料,誘導(dǎo)其往雄性方向發(fā)展; 對照組投喂正常飼料。喂料頻率為每天1次。利用魚肝油溶解MT激素, 與飼料攪拌均勻, 魚肝油與飼料的比例為: 10mL魚肝油比100g飼料, 攪拌后置于空氣中晾干30min再投喂。

每月對實驗組和對照組分別取8尾斜帶石斑魚,解剖后取性腺用Bouin’s液固定, 石蠟切片, H.E染色,拍照觀察性腺分化和發(fā)育情況。

1.2.3 中斷雄激素投喂后石斑魚性腺發(fā)育狀況雄激素投喂3個月后, 一個實驗組繼續(xù)投喂含MT激素的配合飼料, 為持續(xù)投喂組; 另一組中斷MT激素投喂, 改為正常飼料投喂, 為中斷投喂組; 對照組照常喂養(yǎng)。喂料頻率不變, 養(yǎng)殖方法不變。比較持續(xù)投喂組、中斷投喂組、對照組石斑魚性腺的發(fā)育狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工養(yǎng)殖條件下斜帶石斑魚性腺發(fā)育過程

斜帶石斑魚在人工養(yǎng)殖條件下不同年齡階段的性腺發(fā)育過程如圖1所示(時期劃分參照Chenet al,2011): 3月齡石斑魚幼魚性腺處于性原基形成時期,為未分化時期; 6月齡石斑魚幼魚性腺處于卵巢腔形成時期, 性腺已向雌性分化; 9月齡石斑魚幼魚性腺中形成大量的性原細(xì)胞, 卵巢腔已經(jīng)形成, 還沒有開始發(fā)育, 尚未發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞; 12月齡石斑魚性腺中開始形成初級卵母細(xì)胞(primary-growth stage oocyte,O1), 卵巢開始發(fā)育; 18月齡石斑魚性腺中出現(xiàn)大量的O1期卵母細(xì)胞, 但還未出現(xiàn)皮層小泡, 處在初級卵母細(xì)胞生長期; 24月齡石斑魚性腺的卵母細(xì)胞體積增大, 處于皮層小泡生成時期(cortical-alveolus stage oocyte, O2); 30月齡石斑魚性腺仍處于O2期, 卵母細(xì)胞中皮層小泡明顯增多, 但還未出現(xiàn)卵黃囊; 36月齡石斑魚處于卵母細(xì)胞卵黃形成時期(vitellogenic stage oocyte, O3), 卵母細(xì)胞中存在大量的卵黃囊, 此時斜帶石斑魚已經(jīng)發(fā)育成熟。

2.2 MT激素誘導(dǎo)斜帶石斑魚性腺發(fā)育過程

對8月齡斜帶石斑魚幼魚投喂MT激素后, 其性腺發(fā)育如圖2, 詳細(xì)過程: 實驗開始階段, 對照組和實驗組斜帶石斑魚幼魚性腺細(xì)胞均為性原細(xì)胞, 石斑魚幼魚卵巢還未發(fā)育, 如圖2(A0)和圖2(B0)所示;投喂1個月后, 對照組性腺細(xì)胞所處時期不變, 仍為性原未分化細(xì)胞, 石斑魚卵巢還處在未發(fā)育狀態(tài)[圖2(A1)]; 實驗組石斑魚幼魚開始往雄性方向發(fā)育, 性腺切片中觀察到育精囊, 育精囊(SG)中有精原細(xì)胞(Sg)和初級精母細(xì)胞(PSc)出現(xiàn), 如圖2(B1); 投喂2個月后, 對照組性腺細(xì)胞仍為性原細(xì)胞, 表明石斑魚卵巢發(fā)育還未啟動[圖2(A2)]; 實驗組石斑魚繼續(xù)往雄性方向發(fā)育, 性腺中開始出現(xiàn)了次級精母細(xì)胞(SSc),如圖2(B2); 投喂3個月后, 對照組性腺切片中開始出現(xiàn)了O1期細(xì)胞, 說明正常情況下斜帶石斑魚在11—12月齡左右, 卵巢發(fā)育開始啟動, 性腺往雌性方向發(fā)展; 相比之下, 實驗組石斑魚精巢繼續(xù)發(fā)育[圖2(B3)],性腺出現(xiàn)了精細(xì)胞(St), 甚至有少量的精子出現(xiàn)(Sz),可以確定斜帶石斑魚幼魚在MT激素的誘導(dǎo)下已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄孕埕~[圖2(B3)]。

2.3 中斷投喂MT激素后的斜帶石斑魚性腺發(fā)育過程

圖1 斜帶石斑魚性腺發(fā)育過程切片圖Fig.1 Gonad development sections of E. coioides

發(fā)現(xiàn)石斑魚幼魚轉(zhuǎn)化成雄性后, 對一個實驗組停止投喂含MT的配合飼料, 另一個實驗組持續(xù)投喂含MT的配合飼料, 跟蹤觀察性腺發(fā)育狀況, 見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 中斷投喂1個月后, 對照組性腺與上個月相比, 沒有明顯的變化[圖3(A4)]; 持續(xù)投喂組性腺繼續(xù)往雄性方向發(fā)展, 性腺中精子的數(shù)量開始增多[圖3(B4)];中斷投喂組性腺的雄性特征變得不明顯, 表現(xiàn)在性原細(xì)胞的比例顯著增大, 雄性相關(guān)的細(xì)胞數(shù)量大幅減少, 沒有發(fā)現(xiàn)有Sz的出現(xiàn)[圖3(C1)]; 中斷投喂2個月后, 對照組與上個月相比, 性腺中O1期卵母細(xì)胞數(shù)量有增多的趨勢, 表明斜帶石斑魚已向雌性卵巢發(fā)育[圖3(A5)]; 持續(xù)投喂組性腺繼續(xù)往雄性方向發(fā)展, 性腺精巢腔隙中出現(xiàn)大量的精子[圖3(B5)]; 而中斷投喂組性腺雄性特征持續(xù)退化, 性腺中St不再出現(xiàn), SSc細(xì)胞在性腺中所占的比例比上個月更低,性腺中性原細(xì)胞占大部分比例[圖3(C2)]; 中斷投喂3個月后, 對照組與上個月相比, 性腺中O1期卵母細(xì)胞開始大量出現(xiàn), 斜帶石斑魚雌性特征明顯[圖3(A6)]; 持續(xù)投喂組性腺雄性特征更加明顯, 性腺精巢腔隙中出現(xiàn)的精子密度更加濃密[圖3(B6)]; 中斷投喂組性腺則全部退化為性原細(xì)胞時期[圖3(C3)]。

3 討論

石斑魚屬于雌雄同體雌性先熟的種類, 對多種石斑魚類的染色體核型分析均未發(fā)現(xiàn)異型染色體(王世峰, 2007), 表明石斑魚的染色體遺傳無差異, 如Chan等(1981)的觀點: 動物中存在由環(huán)境影響及具有遺傳無差異特性的性別決定方式。本研究的斜帶石斑魚均養(yǎng)殖于廣東省海洋漁業(yè)試驗中心的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 石斑魚幼魚卵巢腔形成于6—9月齡之間,之后卵巢開始發(fā)育, 以卵巢腔形成為石斑魚性別分化為雌性的標(biāo)志(Ryosukeet al, 2012)。硬骨魚類的性別分化(性別決定或遺傳意義上的分化)一般在胚后發(fā)育的較早時期發(fā)生, 例如, 鯉科魚類在孵化后的4—6周性腺就開始分化, 此時就要開始投喂激素; 如果太晚投喂, 就有可能性逆轉(zhuǎn)效果很差, 或達(dá)不到永久性逆轉(zhuǎn)的效果(張甫英等, 2000; 岳敏娟等, 2009)。石斑魚是雌雄同體雌性先成熟魚類, 前人對石斑魚的性逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)在雌魚卵巢發(fā)育之后, 均能成功誘導(dǎo)成為雄性。如方永強(qiáng)等(1992)經(jīng)過連續(xù)投喂含有MT的餌料, 成功的誘導(dǎo)2齡及以上的赤點石斑魚發(fā)生性逆轉(zhuǎn); 鄒記興等(2000)采用埋植混合激素藥條的方法誘導(dǎo)3齡以上巨石斑魚提早性逆轉(zhuǎn); 作者早期的研究表明投喂含有MT和ADSD的餌料, 均可誘導(dǎo)2齡斜帶石斑魚提前發(fā)生性轉(zhuǎn)化, MT可誘導(dǎo)實驗魚產(chǎn)生精液, ADSD可誘導(dǎo)實驗魚到雌雄同體階段(趙會宏,2003)。眾多激素處理均能成功誘導(dǎo)石斑魚性別轉(zhuǎn)變,表明石斑魚的性別決定屬類固醇激素依賴型, 即雄性類固醇激素達(dá)到一定量時, 抑制或關(guān)閉了雌性相關(guān)基因的表達(dá), 而啟動了雄性相關(guān)基因, 導(dǎo)致一系列生理變化, 促進(jìn)卵巢退化和吸收、性腺組織結(jié)構(gòu)的重組, 以及雄性配子細(xì)胞的增殖(桂建芳, 2007)。

圖2 投喂MT激素誘導(dǎo)斜帶石斑魚幼魚轉(zhuǎn)雄性腺切片圖Fig.2 Gonad sections of juvenile E. coioides sex-change to male by MT food

作者在石斑魚性別分化為卵巢發(fā)育之前, 選取斜帶石斑魚幼魚進(jìn)行雄激素誘導(dǎo), 以誘導(dǎo)其性別往雄性方向發(fā)展。由于斜帶石斑魚幼魚馴料時間較長,而6月齡的幼魚配合飼料進(jìn)食不夠均勻, 個體差異較大。因此作者選取8月齡的斜帶石斑魚幼魚進(jìn)行投喂實驗, 以期獲得比較均一的結(jié)果。本研究中, 斜帶石斑魚幼魚在8月齡的時候卵巢還未開始發(fā)育; 投喂激素一個月后, 性腺開始往雄性方向發(fā)展, 性腺中出現(xiàn)了雄性的生殖細(xì)胞; 保持相同的激素量, 在連續(xù)投喂三個月后, 石斑魚性腺中開始出現(xiàn)精子, 在雄激素的持續(xù)作用下, 性腺中雄性生殖細(xì)胞也持續(xù)地往后期發(fā)展, 最后精子的出現(xiàn)證明石斑魚已經(jīng)發(fā)育成為雄魚。相似的投喂誘導(dǎo)效果還見于東大西洋石斑魚(Glamuzinaet al, 1998)、青銅石斑魚(Hasssinet al,1997)、七帶石斑魚(Tanakaet al, 1999)、蜂巢石斑魚(Kobayashiet al, 1999)等的研究。

圖3 中斷MT激素投喂后各實驗組性腺切片圖Fig.3 Gonad sections of E. coioides while stopping MT food

中斷激素投喂后, 雄性斜帶石斑魚性腺發(fā)生退化, 斜帶石斑魚幼魚性腺中本來存在的精子、精細(xì)胞等退化消失了, 出現(xiàn)更為原始的精母細(xì)胞; 三個月后,性腺中不再存在雄性的細(xì)胞結(jié)構(gòu), 都退化為性原細(xì)胞, 呈現(xiàn)出未分化的狀態(tài)。表明沒有了外源雄激素的刺激, 斜帶石斑魚幼魚不能繼續(xù)往雄性方向發(fā)育。外源雄激素誘導(dǎo)魚類性逆轉(zhuǎn)的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn): 17α-MT主要是通過直接作用于性腺或者影響與性腺發(fā)育有關(guān)的生理過程起作用的(Leeet al, 1995; Kitanoet al, 2000; 李廣麗等, 2006)。本文中, 石斑魚幼魚雖然被誘導(dǎo)往雄性方向發(fā)展, 卻不能啟動石斑魚自身的雄性發(fā)育機(jī)制, 這種外源性的雄激素一旦消失,石斑魚幼魚就按照自身遺傳基因控制的方向朝雌性發(fā)育。

綜合前人的研究結(jié)果, 作者認(rèn)為雌雄同體魚類的性別決定過程可分為生殖腺分化時的初級性別決定和分化后完成生殖腺發(fā)育時(雌或雄)的次級性別決定。雌雄同體魚類的初級性別決定調(diào)控與其他魚類高度相似, 受遺傳因子的調(diào)控; 但次級性別決定過程則受到年齡、體型和社會因子的影響。Fishelson(1970)對長棘花鰭(Anthias squamipinnis)的研究發(fā)現(xiàn), 雄魚的存在與否會影響雌性的性轉(zhuǎn)變過程。Liu等 (2004)對黑鲙(Cephalopholis boenak)的研究認(rèn)為: 體型小的雌魚比體型大的雌魚更容易發(fā)生性轉(zhuǎn)變。石斑魚是典型的雌雄同體雌性先熟的魚類, 初級性別決定其在早期性分化為雌性, 如不受外源激素影響, 正常發(fā)育為雌魚。卵巢未發(fā)育的雌魚經(jīng)雄激素誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌? 停止藥物處理后會再度性轉(zhuǎn)變?yōu)榇菩? 表明石斑魚次級性別決定可能受到時間軸因子和社會因子的強(qiáng)烈影響。Chan等(1981)認(rèn)為, “社會學(xué)因素”主要是通過神經(jīng)內(nèi)分泌途徑來溝通外部刺激與性轉(zhuǎn)變的,有關(guān)石斑魚性轉(zhuǎn)變的整個過程可能涉及到中樞神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦—垂體—性腺軸等內(nèi)分泌器官的一系列變化。

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