廖紅芳 鄭忠明① 馮 堅 朱津永 丁露露 蔣珊娜

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室 寧波 315211; 2. 舟山市普陀區(qū)海洋與漁業(yè)局 舟山 316100)

近幾年, 隨著海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展, 養(yǎng)殖活動對周圍海域環(huán)境影響的問題日益凸顯。養(yǎng)殖過程中大量的殘餌、糞便等廢棄物沉積到沉積層, 導(dǎo)致沉積物有機污染并引發(fā)周圍海域水體富營養(yǎng)化(Karakassiset al, 2000; Grigorakiset al, 2011), 及引發(fā)養(yǎng)殖病害等生態(tài)環(huán)境問題(胡文佳等, 2007; Jianget al,2010)。因此, 網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)沉積環(huán)境的健康狀況逐漸受到重視。

20世紀70年代初, 人們就開始尋找評估沉積物質(zhì)量的方法。目前已經(jīng)發(fā)展出多種方法來評估沉積環(huán)境的健康狀況。細菌由于敏感性強(Gilleret al, 1998)能對周圍環(huán)境的早期變化做出迅速的反應(yīng), 且有很多分類群, 對不同的環(huán)境污染有不同的反應(yīng)(Elliset al, 2001), 已成為評價沉積環(huán)境健康狀況的重要的指示生物。然而, 底泥細菌種類豐富, 細菌群落結(jié)構(gòu)與周圍環(huán)境密切相關(guān), 細菌作為指示生物的模式尚未成熟, 仍處在探索階段。Tamminen等(2011)比較研究了地中海四種不同規(guī)模類型的漁場, 發(fā)現(xiàn)不同規(guī)模的漁場沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)顯著不同, 淺水中型水產(chǎn)養(yǎng)殖比開放水域養(yǎng)殖對沉積物細菌群落結(jié)構(gòu)影響更大。Fodelianakis等(2014)認為養(yǎng)殖活動會改變底泥細菌群落結(jié)構(gòu), 群落結(jié)構(gòu)的差異和該點與漁場的距離有關(guān)。

象山港是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖基地, 為半封閉型港灣,水體交換能力弱, 粉砂質(zhì)黏土。大黃魚(Pseudosciaena crocea)是我國重要的經(jīng)濟魚類, 近幾年養(yǎng)殖業(yè)取得了較好的經(jīng)濟效益, 但與此同時, 由于養(yǎng)殖密度過高、餌料投喂不合理等因素, 加重了養(yǎng)殖環(huán)境尤其是沉積環(huán)境的負擔。有關(guān)近海養(yǎng)殖活動對沉積物中細菌的影響國內(nèi)外已有一些報道, 如: Vezzulli等(2002)調(diào)查了利古里亞海(地中海北部的一個海域)一個建成的漁場表層底泥細菌群落結(jié)構(gòu)與有機物的關(guān)系, 指出細菌群落的變動可以作為評估有機污染的工具。Bissett等(2007)對塔斯馬尼亞鮭魚養(yǎng)殖區(qū)及周圍鄰近區(qū)域沉積物中的細菌豐度、多樣性等進行了研究。國內(nèi)有關(guān)報道相對較少, 關(guān)于大黃魚養(yǎng)殖對周圍環(huán)境的影響更為缺乏。本文調(diào)查了象山港大黃魚養(yǎng)殖區(qū)及鄰近海域沉積物中有機物含量和細菌生態(tài)分布特征,并與其它養(yǎng)殖區(qū)進行比較, 同時探討了細菌生態(tài)分布與沉積物有機物含量的關(guān)系。為近海養(yǎng)殖沉積環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測及近海生態(tài)環(huán)境保護提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣區(qū)位于象山西瀘港生態(tài)養(yǎng)殖基地, 共三個采樣點, 即大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)(FS)、距離大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)50m(C1)及100m(C2)。于大黃魚養(yǎng)殖投餌期(2013年8月)及越冬期(2013年11月)用無擾動沉積物采樣器(王友紹等, 2004)采集底泥, 每個點取3個以上重復(fù)樣?，F(xiàn)場將底泥按原位分割為0—5cm、5—10cm層, 分裝到已滅菌的自封袋中, 然后放到冰盒中冷凍保存。用采水器采集水樣。用YSI Proplus型多參數(shù)測量儀現(xiàn)場測定水溫及水中溶解氧。樣品采好后1h內(nèi)帶回實驗室。

1.2 理化因子的測定

1.3 菌株分離計數(shù)與純化

沉積物樣品帶回實驗室后, 立即培養(yǎng)。將10.0g左右的樣品放入盛有90mL無菌海水的錐形瓶中, 180 r/min振蕩30 min。靜置后取上清液, 按十倍稀釋法稀釋成10–1、10–2、10–3, 接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(配培養(yǎng)基所用的水按陳海水︰蒸餾水1︰1配制)及TCBs培養(yǎng)基上。每個稀釋度接三個平板。待平板上長出明顯的菌落后計數(shù)。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上, 每個樣品隨機挑取20個左右的菌株分離純化直至得到純菌。

1.4 16S rDNA基因擴增及鑒定

選取純培養(yǎng)菌株, 用水煮法提取細菌DNA, 然后進行PCR擴增。擴增引物為細菌16S通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGTTACCTTGTTAC GACTT-3′)。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2min, 94°C變性30s, 58°C退火30s,72°C延伸1min, 循環(huán)31次。72°C終延伸2min。PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果后, 送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司純化并進行DNA序列測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H’)(Hillet al,2003)衡量細菌的多樣性, 計算公式為:

式中,Pi為第i屬細菌在群落中的相對豐度,S為群落中所含有的細菌屬數(shù)。

采用SPSS(17.0)進行統(tǒng)計分析, 沉積物中TON、TOC及TP含量先進行單因素方差分析, 然后用Duncan法進行多重比較。方差分析時, 部分數(shù)據(jù)先進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換(百分比數(shù)據(jù): TOC和TON含量采用反正弦轉(zhuǎn)換, 細菌數(shù)量采用對數(shù)轉(zhuǎn)換), 然后再進行統(tǒng)計分析。采用斯皮爾曼等級相關(guān)法分析異養(yǎng)細菌數(shù)與沉積物中氮磷有機質(zhì)含量的關(guān)系。用Origin 8.0作圖。將獲得的16S rDNA序列通過Blastn進行序列比對,獲取相似度較高的菌株信息及序列。用Cluster 1.81進行多序列比對, 然后采用Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)

同一時期采樣點海水中營養(yǎng)鹽、溶解氧濃度及水溫值相差不大, 不同時期則有一定差異(表1)。養(yǎng)殖區(qū)沉積物(0—5cm層)中總磷、總有機氮含量在投餌期和越冬期均顯著高于對照區(qū)的, 但是總有機碳含量只在投餌期時有顯著性差異(P<0.05)(圖1a, b, c); 5—10cm層沉積物中, 越冬期養(yǎng)殖區(qū)沉積物中的TP、TON含量顯著高于對照區(qū)(圖1d, e), 而在投餌期只觀察到養(yǎng)殖區(qū)的TP含量與對照區(qū)C1有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 沉積物中細菌數(shù)量分布

養(yǎng)殖區(qū)沉積物中異養(yǎng)細菌數(shù)量分布在1.7×105—5.2×105CFU/g之間, 對照區(qū)(C1, C2)的異養(yǎng)細菌數(shù)量分布在3.2×104—3.4×105CFU/g之間(圖2)。同一采樣期, 養(yǎng)殖區(qū)沉積物中異養(yǎng)細菌數(shù)量顯著高于對照區(qū)C1 (P<0.05); 除了投餌期0—5cm沉積層外, 養(yǎng)殖區(qū)異養(yǎng)細菌數(shù)量顯著高于對照區(qū)C2 (P<0.05); 隨著深度的增加, 沉積物中的異養(yǎng)細菌數(shù)量減少。在時間分布上, 投餌期和越冬期表層沉積物(0—5cm層)中異養(yǎng)細菌數(shù)量差異不大, 但是5—10cm層沉積物中, 投餌期異養(yǎng)細菌數(shù)量要大于越冬期。異養(yǎng)細菌數(shù)量與沉積物中TON、TP含量有一定的線性相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.515 (n=12)、0.559 (n=12), 而與沉積物中TOC含量的相關(guān)性較弱(r=0.182,n=12)。沉積物中弧菌數(shù)量分布在2.2×103—1.7×105CFU/g之間(圖3)。投餌期, 養(yǎng)殖區(qū)沉積物中的弧菌數(shù)量顯著高于對照區(qū)C1 (P<0.05); 越冬期, 觀察到養(yǎng)殖區(qū)中的弧菌數(shù)量高于對照區(qū)C1、C2, 且有顯著性差異(P<0.05)。

表1 養(yǎng)殖區(qū)(FS)及對照區(qū)(C1, C2)海水溫度(WT)、水中溶解氧(DO)、硝酸鹽+亞硝酸鹽、銨鹽濃度Tab.1 Water temperature (WT), concentrations of dissolved oxygen (DO), nitrate + nitrite, phosphorus, and ammonium in water in the fish farm (FS), the control station C1 and C2 in the feeding period (August) and wintering period (November)

圖1 養(yǎng)殖區(qū)(FS)、對照區(qū)(C1, C2)在投餌期及越冬期兩個時期沉積物中總磷(TP)、總有機氮(TON)、總有機碳(TOC)含量Fig.1 The values of total phosphorous (TP), total organic nitrogen (TON) and total organic carbon (TOC) in sediment under the fish farm (FS), the control station C1 and C2 in feeding period and wintering period

2.3 異養(yǎng)細菌群落結(jié)構(gòu)

分離純化后共得到151株細菌, 分屬于22個屬(表2)。養(yǎng)殖區(qū)投餌期的優(yōu)勢屬為弧菌屬(占71.4%),但是越冬期芽孢桿菌屬成為了優(yōu)勢屬(占38.2%), 其次為假單胞菌屬; 對照區(qū)投餌期的優(yōu)勢屬為弧菌屬(占57.6%), 其次為假交替單胞菌屬, 越冬期的優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬(占33.3%), 其次為假交替單胞菌屬、假單胞菌屬。各采樣區(qū)異養(yǎng)細菌的多樣性表現(xiàn)為養(yǎng)殖區(qū)小于對照區(qū), 越冬期高于投餌期。

圖2 養(yǎng)殖區(qū)(FS)及對照區(qū)(C1, C2)沉積物中異養(yǎng)細菌分布圖Fig.2 Distribution of heterotrophic bacterial abundance in sediment of the farm site (FS) and control station (C1, C2)

圖3 養(yǎng)殖區(qū)(FS)及對照區(qū)(C1, C2)沉積物中弧菌分布圖Fig.3 Distribution of Vibrio abundance in sediment in farm site (FS) and control station (C1, C2)

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將比對后的細菌16S rDNA序列用MEGA 5.0構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹。養(yǎng)殖區(qū)沉積物中的異養(yǎng)細菌分屬于γ-變形菌綱、芽孢菌綱, 且γ-變形菌綱的種類比芽孢菌綱的種類豐富(圖4)。非養(yǎng)殖區(qū)沉積物細菌也有γ-變形菌綱、芽孢菌綱(圖5)。γ-變形菌綱中, 雖然養(yǎng)殖區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)均含有弧菌、希瓦氏菌、交替單胞菌等, 但是兩個研究區(qū)域沉積中細菌群落結(jié)構(gòu)不一樣。前者分離到了耐鹽桿菌, 后者有海單胞菌、不動桿菌。對于芽孢菌綱, 除均含有芽孢桿菌等外, 養(yǎng)殖區(qū)還分離到了葡萄球菌, 而非養(yǎng)殖區(qū)中有動性球菌。在非養(yǎng)殖區(qū)中還分離到了屬于放線菌綱的細菌:鏈霉菌、棒狀桿菌、節(jié)細菌及考克氏菌。此外, 非養(yǎng)殖區(qū)中分離得到的某些細菌屬于α-變形菌綱, 如根瘤菌、副球菌。

表2 養(yǎng)殖區(qū)(FS)、對照區(qū)(C1, C2)在投餌期(FP)及越冬期(WP)兩個時期沉積物中細菌菌群組成Tab.2 Composition of bacterial community in sediment under the fish farm (FS), the control station C1 and C2 in feeding period (FP) and wintering period (WP)

圖4 象山港大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)沉積物中分離得到的細菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of bacteria isolated from cage culture sediment in the Xiangshan Bay

圖5 象山港大黃魚非養(yǎng)殖區(qū)沉積物中分離得到的細菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of bacteria isolated from sediment of non-culture area in the Xiangshan Bay

3 討論

海水養(yǎng)殖活動因殘餌和糞便等常會導(dǎo)致大量的有機物輸入到底部(Carrollet al, 2003), 使有機物在沉積物中堆積。本實驗中養(yǎng)殖區(qū)沉積物(0—5cm層)中總磷、總有機氮含量在投餌期和越冬期均顯著高于對照區(qū), 表明養(yǎng)殖區(qū)沉積物積累了有機物。微生物是各種有機物質(zhì)的分解者和轉(zhuǎn)化者, 初期有機物的增加會提高微生物的豐度, 但是大量有機物的存在導(dǎo)致生物分解加劇, 使沉積物中氧氣含量下降, 可能會抑制微生物的生長。本研究中, 養(yǎng)殖區(qū)沉積物中異養(yǎng)細菌數(shù)量均高于對照區(qū)的, 這可能是有機物的積累為細菌生長提供了合適的基質(zhì), 刺激細菌繁殖(Vezzulliet al, 2002)。這與Bissett等(2007)對塔斯馬尼亞鮭魚養(yǎng)殖區(qū)的研究結(jié)果一致。Vezzulli等(2002)對利古里亞海的金頭鯛網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)的研究也指出網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)沉積物由于有機物的積累促使異養(yǎng)細菌數(shù)量增加。本研究發(fā)現(xiàn)對照區(qū)沉積物中異養(yǎng)細菌數(shù)量與第勒尼安海剛建立半年的金頭鯛網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)下沉積物中異養(yǎng)細菌數(shù)類似(La Rosaet al, 2004), 這暗示著象山港大黃魚養(yǎng)殖活動對鄰近海域沉積物造成了一定的有機污染。相關(guān)性分析表明異養(yǎng)細菌數(shù)與沉積物中TON、TP含量呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為0.515, 0.559;n=12), 表明沉積物中可培養(yǎng)異養(yǎng)細菌數(shù)受有機氮含量和磷酸鹽含量的限制, 同時進一步說明了異養(yǎng)細菌數(shù)量與沉積環(huán)境有機污染程度密切相關(guān)。異養(yǎng)細菌的生長與繁殖需以有機物為原料獲得能量, 氮磷是細菌電子反應(yīng)的主要基質(zhì), 這可能是異養(yǎng)細菌受氮鹽和磷酸鹽限制的一個重要原因。Thingstad等(2005)及Sebastián等(2012)的研究也指出沉積物中細菌數(shù)受磷酸鹽含量的限制。

細菌群落對環(huán)境的改變非常敏感, 有研究表明漁場輸入的有機物會改變沉積物中的細菌群落結(jié)構(gòu)(Kawaharaet al, 2009; Fodelianakiset al, 2014), 甚至引起細菌群落結(jié)構(gòu)持久性變化(Danovaroet al, 1999)。本研究中, 養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)的異養(yǎng)細菌群落結(jié)構(gòu)不一樣且同一地點不同時期群落結(jié)構(gòu)也不同(表2), 支持了上述觀點, 即細菌群落結(jié)構(gòu)對環(huán)境的改變非常敏感, 且受養(yǎng)殖活動的影響。養(yǎng)殖區(qū)沉積物中的可培養(yǎng)細菌絕大部分為兼性厭氧菌, 可能是因為有機物的積累使微生物大量繁殖導(dǎo)致氧氣迅速消耗, 在沉積物中形成亞氧化層甚至造成缺氧環(huán)境, 最終好氧細菌減少(Canfieldet al, 1993)?；【械哪承┓N類為重要的致病菌或條件致病菌, 弧菌大量增殖可能會引起養(yǎng)殖生物患病甚至死亡(Korsneset al, 2006)。西班牙養(yǎng)殖的鱸魚由于患弧菌病造成了巨大的經(jīng)濟損失(Rodgerset al, 1998), 我國海南三亞網(wǎng)箱養(yǎng)殖的點石斑魚苗由于發(fā)生了弧菌病, 一周內(nèi)魚苗全部死亡(陳曉燕等, 2003)。本實驗中, 投餌期的優(yōu)勢屬為弧菌屬(表2)(占71.4%)且養(yǎng)殖區(qū)的弧菌數(shù)量顯著高于對照區(qū)C1, 這可能與有機物的大量輸入有關(guān)。有機物的富集刺激弧菌的繁殖(La Rosaet al, 2001), 導(dǎo)致最終弧菌密度增加。這也暗示著該養(yǎng)殖系統(tǒng)存在著患病的風(fēng)險。在投餌量少甚至不投餌的越冬期, 在碳氮循環(huán)中扮演著重要角色的芽孢桿菌屬和假單胞菌屬成為優(yōu)勢菌群。有小娟等(2013)及劉晶晶等(2010)對象山港養(yǎng)殖區(qū)沉積物的研究也表明假單胞菌屬是優(yōu)勢菌群。

系統(tǒng)發(fā)育分析可知, 養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)沉積物中主要為γ-變形菌綱和芽孢菌綱, Li等(2013)在秦皇島養(yǎng)殖區(qū)沉積物中細菌群落多樣性的測定中, 也發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱和芽孢菌綱占優(yōu)勢。這表明γ-變形菌綱和芽孢菌綱適合在有機物富集的環(huán)境中生長。受漁場養(yǎng)殖活動影響的沉積物中α-變形桿菌數(shù)增加, 甚至成為優(yōu)勢菌群(Bissettet al, 2006; Kunihiroet al,2008)。雖然本研究中對照區(qū)沉積物也發(fā)現(xiàn)了α-變形桿菌, 但是在養(yǎng)殖區(qū)并未檢測到α-變形桿菌, 可能是當有機物達到一定含量時不適合α-變形桿菌生長, 也可能是沉積物的α-變形桿菌絕大部分是不可培養(yǎng)的。這也反映出了可培養(yǎng)法的缺陷, 只能培養(yǎng)小部分細菌。

異養(yǎng)細菌群落多樣性與沉積物中有機物輸入量密切相關(guān)。養(yǎng)殖區(qū)沉積物異養(yǎng)細菌的多樣性小于對照區(qū), 表明養(yǎng)殖活動可能會降低沉積物異養(yǎng)細菌多樣性。Luna等(2013)對地中海的四個漁場的研究結(jié)果也表明網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)沉積物中的細菌多樣性低于對照區(qū)。本研究中越冬期微生物的多樣性高于投餌期, 推測其原因為投餌期餌料投喂較多而越冬期投餌量少甚至不投餌。大量有機物輸入到沉積物中, 可能會使底質(zhì)向缺氧環(huán)境轉(zhuǎn)變, 從而降低非厭氧菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性, 甚至造成毀滅性的破壞(Chivilevet al,1997)?？膳囵B(yǎng)法能夠在一定程度上反映非厭氧菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的變化, 為初步鑒定有機污染情況提供有效數(shù)據(jù)。

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