王 婷 黃智慧 馬愛軍① 馬得友 王新安 夏丹丹 馬本賀

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島 266071; 2. 大連海洋大學 大連 116023)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬于鰈形目、鲆科、菱鲆屬, 在我國俗稱“多寶魚”。原產(chǎn)于歐洲大西洋東北部, 20世紀70年代, 英國首度成功開發(fā)了大菱鲆人工養(yǎng)殖技術(shù), 于1992年引入我國, 目前已成為我國北方沿海工廠化養(yǎng)殖業(yè)的主導品種之一(雷霽霖等, 2002)。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大, 集約化程度的不斷提高, 大菱鲆疾病頻發(fā)、養(yǎng)殖周期長、養(yǎng)殖成本上升等嚴重制約了我國大菱鲆的養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展(雷霽霖等, 2012)。因此, 對大菱鲆進行遺傳改良、選育新品種已成為提高養(yǎng)殖效益和健康化養(yǎng)殖水平的當務之急。

大規(guī)模發(fā)掘大菱鲆分子標記, 是儲備種質(zhì)資源、構(gòu)建性狀相關(guān)遺傳解析、開發(fā)分子遺傳育種技術(shù)的基礎工作。單核苷酸多態(tài)性標記(single nucleotide polymorphism, SNP)是美國學者Lander于1996年提出的第三代DNA遺傳標記(Lander, 1996)。由于SNP數(shù)目多、覆蓋密度大(Sachidanandamet al, 2001), 具有遺傳穩(wěn)定性和代表性(Collinset al, 1997), 便于高通量自動化檢測等優(yōu)點, 已經(jīng)廣泛應用在構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、關(guān)聯(lián)分析、分子輔助育種、群體遺傳系統(tǒng)、品種鑒定等方面, 并表現(xiàn)出良好的應用前景(Liuet al, 2004)。在水產(chǎn)動物中, SNP的開發(fā)和應用已經(jīng)有若干報道, 如鯰魚(Kucuktaset al, 2009)、櫛孔扇貝(Jianget al, 2011)、蟹(Maet al, 2011)、蝦夷扇貝(Liuet al, 2011)、對蝦(吳瑩瑩等, 2013)等。在大菱鲆中也有部分開發(fā)和應用(劉慶明等, 2012; Navajaset al, 2012; Veraet al, 2013), 但數(shù)量還未達到構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜的要求。

目前大規(guī)模SNP位點信息的獲得主要是通過基因組測序, 伴隨序列拼接比對而產(chǎn)生, 但是這種方法成本較高。對于沒有基因組信息的非模式生物, 多利用已知的EST序列自行篩選, 但是EST序列與實際序列有一定差異, 所以這種方法前期準備工作比較艱巨, 開發(fā)效率比較低, 覆蓋率不夠廣, 目的性不夠強(Liuet al, 2006; 劉慶明等, 2012)。目前大菱鲆已知的EST序列只有15641個, 使得該物種SNP篩選工作難度更高; 隨著第二代測序技術(shù)的快速發(fā)展, 高通量轉(zhuǎn)錄組測序成本大幅降低, 為解決這些難題提供了契機。通過新一代高通量測序技術(shù), 能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本及基因序列, 并且可以準確檢測出高度復雜的序列, 通過一系列對比識別大量的SNP位點(Zhouet al, 2010)。本研究首次利用大菱鲆雌雄高通量轉(zhuǎn)錄組測序信息, 去冗余后得到71107 contig,為大菱鲆的SNP標記大規(guī)模開發(fā)提供了豐富的序列資源和位點信息, 而且為進一步的QTL定位、性別控制等研究帶來了極大便利。

迄今已經(jīng)有很多種檢測開發(fā)SNP多態(tài)性的技術(shù)方法, 如基于雜交的基因芯片技術(shù)(Gene chips)(Wanget al, 1998)、探針技術(shù)(TaqMan) (Martinsohnet al, 2009), 基于核酸構(gòu)象的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Singlestrand conformational polymorphism, SSCP) (Heet al,2008)等。雖然方法很多, 但是存在著開發(fā)量低、消耗時間多、操作步驟冗長、實驗費用昂貴、適用范圍有限等問題, 限制了SNP標記的利用和推廣。高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(High Resolution Melting, HRM),是近年來興起的一種SNP檢測的新手段, 可以迅速的檢測出DNA片段中堿基的突變(Liet al, 2012); 因其操作簡便快速, 結(jié)果準確效率高, 費用成本低, 并且實現(xiàn)了真正的閉管操作, 已受到廣泛的關(guān)注(羅文龍等, 2011)。另外, HRM的小片段法特異性好, 避開了探針設計的誤差和不對稱PCR的復雜操作, 降低了開發(fā)成本, 提高了開發(fā)效率(Liewet al, 2004)。本研究在大菱鲆轉(zhuǎn)錄組Solexa高通量測序數(shù)據(jù)基礎上,根據(jù)預測的SNP位點設計引物, 通過小片段HRM分型技術(shù), 成功開發(fā)了大菱鲆EST-SNP標記21個, 為大菱鲆遺傳圖譜構(gòu)建、性狀相關(guān)QTL定位和分子遺傳育種提供了候選標記資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用大菱鲆來自本實驗室在煙臺天源水產(chǎn)國家級良種場所構(gòu)建的家系(馬愛軍等, 2012), 共96尾魚,樣品詳細資料見表1。DNA取樣品尾鰭, 使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取, 用超微量紫外分光光度計定量, 稀釋至40ng/μL, –20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 大菱鲆SNP標記開發(fā)樣品信息Tab.1 Sample information of turbot for SNP in S. maximus

1.2 SNP位點的查找和小片段法引物設計

大菱鲆轉(zhuǎn)錄組Solexa高通量測序、contig的拼裝和SNP位點的預測由國家人類基因組南方研究中心完成。根據(jù)高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果, 查找覆蓋度大于500的候選SNP位點, 共得到147個位點。

利用Primer5.0對每一個候選位點設計一組引物,要求引物長度20bp左右, GC含量為45%—65%, 產(chǎn)物長度小于80bp; 利用Oligo7.0分析引物參數(shù), 不能有能值高的錯配、二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)。高低溫內(nèi)標為兩段長度50bp的DNA片段, 提供獨立于PCR產(chǎn)物的大約68°C和88°C的熔解曲線。分別為5-ATCGTG ATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAA TTTCATTTT-3’和5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGG TAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’及各自的反向互補序列(Seippet al, 2007)。引物和內(nèi)標由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.3 PCR引物驗證和HRM小片段法分型

以8個群體, 每個群體6個個體DNA等量混合作為模板DNA, 進行引物檢測。PCR反應體系為10μL: 40 ng/μLDNA模板1μL, 2×ES Taq Master Mix 4.5μL, 上游引物(10μmol/L) 0.5μL; 下游引物(10μmol/L) 0.5μL,ddH2O 3.5μL。PCR反應程序為: 95°C預變性5min;94°C變性30 s, 退火溫度(視具體引物Tm值而定)退火30s, 72°C延伸30s, 共35個循環(huán); 最后72°C延伸7min, 4°C保存。用含Genefinder染料的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

根據(jù)電泳結(jié)果, 選擇目的條帶清晰單一的位點進行高低溫內(nèi)標雜交并加入LC Green Plus染料。每個PCR反應體系中加入染料1.0μL, 高溫內(nèi)標和低溫內(nèi)標的正負向引物各加0.25μL, 95°C變性5min后,降溫至4°C保存。

使用LightScanner儀器進行HRM分型, 要求以0.1°C/s的速度, 從56°C快速升溫到97°C, 以1/s的密度采集熒光信號, 得到高分辨率溶解曲線。結(jié)束后用 LightScanner配套軟件對采集曲線進行基因分型。

1.4 遺傳多態(tài)性檢測

SNP位點的分型結(jié)果采用POPGEN32 (version 1.32)軟件處理, 純合子分別記為AA和BB, 雜合子記為AB, 統(tǒng)計各位點的有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne), 期望雜合度(Expected heterozygosity,He),觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho), 統(tǒng)計各位點基因型分布及其頻率和最小等位基因頻率(Minor allele frequency, MAF)。用PIC_CALC(0.6)計算各位點多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)。

2 實驗結(jié)果

2.1 引物驗證和小片段HRM分型

本課題組高通量測序系統(tǒng)大規(guī)模測序的結(jié)果共獲得8642個SNP位點, 轉(zhuǎn)換顛換比為1.3。在覆蓋度大于500的SNP位點中, 根據(jù)兩側(cè)序列特點, 選取45個位點設計引物63組, 經(jīng)過PCR體系條件優(yōu)化, 設置最佳的Tm值, 利用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,有21對引物產(chǎn)生大小符合預期的單一條帶。其中部分SNP位點的詳細信息見表2。對擴增出目的條帶的位點, 用8個群體96個個體進行重新PCR, 變性, 經(jīng)過小片段HRM (LightScanner)驗證, 21個位點均能明顯區(qū)分不同基因型。一共有11個顛換, 10個轉(zhuǎn)換, 其中C/T和G/A最常見(圖1)。

表2 部分SNP位點信息Tab.2 Detailed information of part of the SNP loci in S.maximus

圖1 SNP突變類型分布Fig.1 Distribution of SNP variants

圖2a所示為位點S3的小片段HRM分型圖, 是轉(zhuǎn)換, 其中紅色曲線為純合峰, 峰值較低,Tm約78.7°C,是T/T型; 藍色曲線為純合峰, 峰值較高,Tm值79.4°C, 是C/C型; 灰色為雜合峰, 是T/C型。圖2b所示為位點S16的小片段HRM分型圖, 是顛換, 其中紅色曲線為純合峰, 峰值較高,Tm約80.7°C, 是T/T型; 藍色曲線為純合峰, 峰值較低,Tm值80.1°C,是A/A型; 灰色為雜合峰, 是A/T型。

2.2 SNP位點多態(tài)性分析

所得的基因型數(shù)據(jù)利用POPGEN32(version 1.32)統(tǒng)計分析, 結(jié)果顯示21個SNP位點均含有兩個單倍體(表3); 觀測雜合度Ho的分布范圍為0.256—1.000,期望雜合度He的范圍從為0.276—0.518。有效等位基因數(shù)Ne分布范圍1.352—2.051。最小等位基因頻率MAF分布范圍0.0426—0.5000。多態(tài)信息含量分析顯示21個位點的PIC值范圍為0.226—0.446, 其中2個位點(CS5, S7)屬于低度多態(tài)(PIC<0.25), 其余19個位點屬于中度多態(tài)(0.25

2.3 SNP位點序列的功能分析

利用NCBI的BlastP, 對成功篩查到的21個多態(tài)SNP位點所在的contig序列進行功能注釋, 21個SNP位點所在的20個contig均有明確有效功能注釋, 涉及細胞周期調(diào)控、細胞骨架、能量轉(zhuǎn)換及RNA的加工修飾等(表4)。

利用ORF finder推測出開發(fā)閱讀框, 在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對, 確保ORF選擇的正確性, 并確定SNP位點在遺傳密碼子的位置, 與標準密碼子比對發(fā)現(xiàn)CS1位于5’UTR區(qū), S11、S15、S16、S42、S3、CS10位于3’UTR區(qū); 而CS5、S7位于密碼子的首位, CS9位于密碼子第三位, 造成了編碼氨基酸的改變, 為錯義突變。其余11個位點都在密碼子第三位, 為同義突變(表5)。

圖2 SNP位點小片段HRM分型結(jié)果Fig.2 Genotyping result using HRM with small amplicon

3 討論

SNP標記的興起, 極大地促進了遺傳學和育種繁殖學的微觀發(fā)展和深度發(fā)掘。然而, 開發(fā)和檢測SNP是最關(guān)鍵的兩個技術(shù)難點, 也限制了SNP標記在非模式生物(特別是水產(chǎn)動物)中的開發(fā)和利用。目前,SNP標記的大規(guī)模開發(fā), 一般是利用基因組測序獲得的序列結(jié)果進行對比推測, 這種途徑比較昂貴(莊偉, 2010); 或者利用EST序列, 但是由于序列誤差的存在, 增加了驗證的難度(劉慶明等, 2012)。高通量轉(zhuǎn)錄組測序的推廣很好地彌補了這兩種途徑的缺陷(周華等, 2012), 得到的大量EST序列既可以提供相對更準確的序列信息, 又降低了成本。本研究利用Solexa高通量測序技術(shù)獲得大量EST-SNP位點, 經(jīng)過生物信息學分析, 篩選出4314個覆蓋度大于10的候選SNP位點, 明確了其基因功能。數(shù)量低于其它水產(chǎn)動物, 除物種差別, 另外可能的原因是篩查條件較為嚴格(Maet al, 2011; Veraet al, 2011)。

表3 大菱鲆21個SNP位點的遺傳多態(tài)性Tab.3 Genetic variability at 21 SNPs in S. maximus

表4 20個序列預測蛋白的基因注釋信息Tab.4 Gene annotation of 20 predicted proteins

表5 SNP位點的氨基酸突變Tab.5 Amino acid mutations of SNPs

由于轉(zhuǎn)錄組測序的樣本是大菱鲆mRNA, 有一定的剪切和編輯, 本研究選取的45個SNP位點中有5個位點(11%)的PCR產(chǎn)物大于預期, 推測可能是由于內(nèi)含子的存在而造成的。但是此數(shù)據(jù)遠小于使用其它方法的比例(李紀勤等, 2013), 原因應是本研究使用的是小片段法HRM, 設計引物時, 使目的片段盡可能地小, 有效避免了內(nèi)含子的出現(xiàn)。另外有4個位點,有可觀的多態(tài)性, 但是沒有準確的分型結(jié)果, 因為產(chǎn)物溶解峰與高溫內(nèi)標溶解峰有部分重疊。要解決這個問題, 需要溶解溫度更高的高溫內(nèi)標, 或者重新設計引物以期得到溶解溫度更低的目的片段。

本研究采用高分辨率溶解曲線(HRM)技術(shù), 并探索了小片段法分型技術(shù), 通過該方法可以有效避免在同一個目標產(chǎn)物中存在2個以上SNP位點的可能性, 減少了內(nèi)含子的影響, 從而提高分型效率, 大幅度降低了SNP標記開發(fā)的成本。本研究對45對SNP位點進行引物設計、驗證、基因分型、多態(tài)性分析最終獲得21個SNP標記可用于大菱鲆的遺傳和育種研究, 成功率達到46.7%, 遠遠高于非標記探針法(劉慶明等, 2012; 吳瑩瑩等, 2013)。

對獲得的21個SNP標記, 在群體中進行遺傳多態(tài)性驗證, 多態(tài)信息(PIC)含量分析顯示所有位點均具有多態(tài)性, 19個為中等多態(tài)。觀測雜合度的分布范圍為0.256到1.000, 期望雜合度的平均值為0.451,由于SNP標記為雙等位形式, 每個位點所攜帶的多態(tài)信息較少, 因此略小于大菱鲆的其它分子標記(Houet al, 2011; Veraet al, 2013)。另外有兩個偏離了Hardy-Weinberg平衡, 說明樣本群體可能有過遷徙漂變等。

利用EST數(shù)據(jù)庫開發(fā)SNP標記, 有一個顯著的優(yōu)點, 即標記位點來自編碼序列(Coding Sequences,CDS), 與功能基因直接相關(guān), 為進一步的功能基因研究提供依據(jù)。本研究獲得3個非同義cSNP (nonsynonymous cSNP), 即堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變, 從而影響了蛋白質(zhì)的功能(劉越等, 2008)。另外, 有7個位于基因的UTL區(qū),可能與基因的表達調(diào)控相關(guān)(Veraet al, 2011, 2013),后續(xù)基因功能表達途徑等跟進研究中。

總之, 對于大菱鲆這種沒有基因組數(shù)據(jù)的非模式生物, 應用高通量轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果, 對比EST序列, 使用小片段HRM技術(shù), 可以實現(xiàn)高效率大規(guī)模SNP標記的開發(fā), 而且開發(fā)位點與功能基因表達途徑直接相關(guān), 為進一步的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、經(jīng)濟性狀的QTL定位以及分子標記輔助育種提供更多的標記基礎。

致謝 中國科學院海洋研究所張國范研究員課題組在實驗儀器方面提供了幫助, 謹致謝忱。

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