丁 燏 李 杰 閆秀英 簡紀常① 吳灶和

(1. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 湛江 524025;2. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 廣州 510000)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)出血病是草魚的主要病害之一, 廣泛流行于我國魚類主產(chǎn)區(qū)域。它是我國第一例魚類病毒性疾病, 與其相關(guān)的研究也最為深入, 歷史最為悠久。該病的病原為草魚呼腸孤病毒(GCRV), 是水生呼腸孤病毒屬的C亞型, 且是該屬中毒力最強的病毒株型, 因此具有較高的感染率、流行率、致死率、發(fā)病季節(jié)多等特點(Rangelet al,1999; 遲妍妍等, 2011; Tianet al, 2013)。除了感染草魚外, 還能感染鰱、稀有鯽、青魚、麥穗魚等魚類。GCRV基因組編碼產(chǎn)物計12種, 其中結(jié)構(gòu)蛋白7種(VP1—VP7), 非結(jié)構(gòu)蛋白5種; 結(jié)構(gòu)蛋白中除了VP2與VP4之外, 其它均是病毒雙層衣殼的蛋白組分(Ivanovicet al, 2007; Caiet al, 2011)。而VP6是該病毒粒子內(nèi)層衣殼的成分, 能夠聯(lián)系內(nèi)外兩層衣殼, 在病毒核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及病毒裝配過程中起著較重要的作用, 與哺乳動物呼腸孤病毒中δ2蛋白的功能相似(肖波, 2010)。VP6由基因S8編碼, 含有氨基酸殘基412個, 大小為44.6 kDa左右。目前國內(nèi)大多數(shù)學(xué)者僅關(guān)注該蛋白的免疫原性、重組表達、疫苗研制等,對其相互作用蛋白的研究還未引起足夠的重視(孟思妤等, 2010; 郭帥等, 2010; 周勇等, 2011), 在一定程度上, 阻礙了該病毒的致病機制、預(yù)防性疫苗等研究工作的深入開展。

基因的作用最終是靠其翻譯表達的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的, 而不同蛋白之間的相互作用對其功能的發(fā)揮具有重要的意義, 因此了解蛋白質(zhì)之間的作用是掌握基因及其蛋白功能的一種重要途徑, 已成為各領(lǐng)域研究的熱點問題。常用的蛋白質(zhì)研究方法包括噬菌體表面展示技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)、GST標(biāo)記的pull-down技術(shù)、免疫共沉淀法、質(zhì)譜鑒定、病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)、基于生物信息學(xué)的分析方法等。其中酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)可以直接在體內(nèi)或胞內(nèi)分析蛋白質(zhì)相互作用, 到目前為止該技術(shù)平臺已廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域以檢測蛋白與蛋白之間的相互作用(Fieldet al, 1989)。對病毒而言, 其相互作用蛋白很有可能是其在宿主細胞上相應(yīng)的受體,而病毒受體是病毒侵染宿主細胞的決定因素之一(Marret al, 2013), 病毒受體的鑒定及其與病毒蛋白的相互作用過程與機制的闡明對病毒感染機制分析具有重要作用。GCRV相互作用的蛋白的研究極少,通過相互作用蛋白的篩選與鑒定是研究其致病機理的一種重要途徑, 本研究采用GCRV 096株的VP6蛋白作為誘餌蛋白, 通過酵母雙雜交技術(shù)篩選與其相互作用的蛋白, 為進一步確定GCRV在侵染宿主過程中VP6的地位打下良好基礎(chǔ), 為進一步闡明GCRV的致病機理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

GCRV 096株、草魚腎臟組織細胞系(CIK), 由本實驗室保存。

質(zhì)粒pGEX-KG購自北京鼎國生物公司, 克隆質(zhì)粒pGBKT7 DNA-BD、pGADT7 AD等和對照質(zhì)粒pGBKT7-53、pGADT7-T等, 以及酵母菌株(Y2Hgold和Y187)均購自Clontech公司, E.coli DH5α由本實驗室保存。

dNTP 、ExTaq酶、T4DNA連接酶、DNA Marker等試劑, 及MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒, 限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM(TransGen公司); QIA quick PCR Purification Kit (QIAGEN公司);UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒與酵母質(zhì)粒小量抽提試劑盒, 實驗中所用的引物(上海生工生物工程有限公司); 質(zhì)粒提取試劑盒(U-gene公司)。

MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System、Yeastmaker Yeast Transformation System 2、Make Your Own “Mate & PlateTM” Library system試劑盒、酵母菌培養(yǎng)所用各種培養(yǎng)基及Advantage 2 Polymerase Mix均購自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 利用軟件Primer Premier_5.0設(shè)計引物以擴增GCRV096 VP6基因, 其序列為: F:5′-CGCGGATCCATGGCACAGCGTCAGTT-3′ (BamH I)和R:5′-ACGCGT CGACTTAGACGAACATCACC-3′(SaII)。

1.2.2 GCRV VP6誘餌載體的構(gòu)建 用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒提取GCRV總RNA, 再以此為模板合成cDNA的第一條鏈(采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒), 然后對VP6基因用PCR法進行擴增。PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)參照李杰等(2013)的方法。同樣按照李杰等(2013)的方法完成PCR產(chǎn)物的回收、產(chǎn)物和誘餌載體的連接、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、誘餌重組質(zhì)粒的鑒定等。

pGBKT7-VP6的自激活作用檢測與毒性檢測參照YeastmakerTMYeast Transformation System 2操作手冊與李杰等(2013)的方法進行。

1.2.3 VP6相互作用蛋白的篩選 相互作用蛋白的篩選鑒定參照李杰等(2013)的方法進行, 包括誘餌菌的篩選和純化、誘餌菌與文庫菌的體外融合、接合子的顯微觀察、克隆數(shù)的統(tǒng)計計算、結(jié)合效率的確定、陽性克隆的鑒定與測序分析等過程。其中CIK cDNA文庫(>2.0×107cfu/mL)由本課題組前期工作中所構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 pGBKT7-VP6誘餌質(zhì)粒

將VP6基因PCR產(chǎn)物與克隆質(zhì)粒pGBKT7分別進行雙酶切, 然后用T4連接酶連接構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP6, 經(jīng)雙酶切后電泳分析與菌落PCR分析鑒定, 相應(yīng)大小的PCR產(chǎn)物克隆成功(圖1), 且序列測定結(jié)果完全吻合。其中圖1a為菌落PCR的結(jié)果,說明其基因已存在于細菌的質(zhì)粒之中; 圖1b為雙酶切分析結(jié)果, 與預(yù)期的片段大小、插入位點相符?？梢? 所需的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP6構(gòu)建成功, 為VP6相互作用蛋白的篩選提供了可靠的質(zhì)粒。

圖1 VP6基因菌落PCR檢測與pGBKY7-VP6雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Results of colony PCR analysis of VP6 gene and AGE analysis of pGBKT7-VP6 digested with BamH I and Sal I

2.2 pGBKT7-VP6自激活作用檢測和毒性檢測

在SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/Kan培養(yǎng)基上, 含有pGBKT7-VP6的轉(zhuǎn)化菌生長良好, 但在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上未見其生長, 排除了誘餌蛋白的自激活特性。含有pGBKT7-VP6的轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌在SD/-Trp平板培養(yǎng)基上生長一切正常, 且在液體培養(yǎng)基(SD/-Trp/Kan)中振蕩培養(yǎng)后, OD600大于0.8, 可見誘餌蛋白并無毒性。該結(jié)果保證了進一步進行相互作用蛋白篩選試驗的可行性。

2.3 VP6相互作用蛋白的篩選

酵母CIK文庫菌與VP6釣餌菌相互配合, 在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)已形成了明顯的三葉草型結(jié)構(gòu)(圖2),示2個大球形的親代單倍體細胞與1個正在出芽小球形的二倍體細胞。說明形成了有效的接合子, 可以進行下一步的實驗, 即將其接種于不同培養(yǎng)基以確定篩選克隆數(shù)。篩選克隆數(shù)(cfu/mL)的獲得是經(jīng)各培養(yǎng)基中平板菌落數(shù)的統(tǒng)計來完成的; VP6試驗組在SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu等三種不同選擇培養(yǎng)基中的篩選克隆數(shù)依次為5.16×107、3.31×106、1×105cfu/mL,而陽性對照組在三種培養(yǎng)基中的篩選克隆數(shù)依次為7.84×107、6.63×106、3.2×105cfu/mL (表1)。經(jīng)公式: 融合效率 = 二倍體克隆數(shù)(或培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu中的克隆數(shù))/另兩種培養(yǎng)基中克隆數(shù)相比較小的值, 可以計算出VP6、對照組的融合效率分別為3.02%、4.83%,介于2%—5%之間, 完全滿足進一步試驗的基本要求。經(jīng)高篩選培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA反復(fù)對融合產(chǎn)物(即SD/-Trp/-Leu/ X-α-Gal/AbA平板上的藍色克隆)進行多次篩選確定, 通過共轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold等方法驗證它們之間的相互作用, 最后共獲得4株可能的陽性克隆(呈藍色、圓形的單菌落)(圖3)。

圖2 酵母融合子的形態(tài)Fig.2 Form of the fused yeasts

表1 篩選克隆數(shù)結(jié)果(cfu/mL)Tab.1 Number of screened clones on the selective medium(cfu/mL)

圖3 融合酵母的篩選結(jié)果Fig.3 Screening result of yeast zygote on the medium ofSD/-Trp/-Leu/ -Ade/-His/X-α-Gal/AbA

對獲得的4株待定陽性克隆文庫質(zhì)粒插入片段分別送至上海生工生物工程有限公司進行測序, 經(jīng)序列分析與堿基校正后, 發(fā)現(xiàn)它們分別屬于兩條不同的基因序列, 其有效序列長度分別為470bp和807bp。利用GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對分析所得序列的結(jié)果表明, 一條序列對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列與3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)呈高度同源, 其同源性為99%, 這種蛋白極可能就是3-磷酸甘油醛脫氫酶; 而另一條蛋白質(zhì)序列暫時并沒找到其相應(yīng)的同源性蛋白, 可能是一種未知蛋白。

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)是一種篩選和鑒定相互作用蛋白的有效手段, 不同于噬菌體展示技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)、基于生物信息學(xué)的蛋白分析技術(shù)等蛋白質(zhì)研究方法, 它集分子克隆技術(shù)、克隆文庫技術(shù)、蛋白質(zhì)研究技術(shù)與方法于一體, 對實驗者的實際操作能力與分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論的要求較高。通過熟練操作, 經(jīng)它篩選得到的蛋白, 一般而言與該蛋白功能的發(fā)揮密切相關(guān), 它們往往通過在胞內(nèi)的相互作用相互調(diào)節(jié), 共同參與某一復(fù)雜的生理病理過程。因此, 該技術(shù)是蛋白質(zhì)功能研究的有效手段之一, 有助于人們理解基因通過蛋白作用的分子機制。對病毒而言, 篩選的相互作用蛋白可能是其受體蛋白或其部分功能域, 也可能是在病毒增殖程中除了結(jié)構(gòu)蛋白之外其它相關(guān)的蛋白質(zhì), 因此在一定程度上, 篩選、鑒定其相互作用蛋白的難度明顯增加了(Fieldet al,1989)。本研究中在項目組已建立CIK cDNA文庫的基礎(chǔ)上, 充分利用酵母二倍體細胞來進行CIK cDNA文庫篩選的方法, 有效地克服了誘餌質(zhì)粒與文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌效率低等技術(shù)瓶頸問題(Fieldet al,1989); 在高效選擇培養(yǎng)基上反復(fù)篩選得到的陽性結(jié)果, 對含有多種cDNA插入片段的融合菌株進行了有效的淘汰, 保證了克隆的均質(zhì)性、有效性(Fieldet al,1989)。本文的結(jié)果也表明在GCRV相互作用蛋白的篩選中酵母雙雜交技術(shù)的高效性與可行性, 該技術(shù)在GCRV相互作用蛋白方面具有較好的應(yīng)用價值與借鑒意義, 為呼腸孤病毒屬中其它各病毒的功能研究提供了新的途徑與方法。

在草魚呼腸孤病毒粒子雙層衣殼中, VP6蛋白是一種典型的夾合蛋白, 具有聯(lián)系GCRV病毒粒子的內(nèi)外衣殼、穩(wěn)定內(nèi)層衣殼骨架分子VP3的作用, 還可能與病毒粒子表面的突起物也同樣存在一定的相互作用(Chenget al, 2008)。已有研究表明VP6在GCRV基因的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制, 及病毒粒子的裝配中有著重要的地位(方勤, 2005), 還發(fā)現(xiàn)VP6蛋白對dsRNA有一定的結(jié)合能力, 但對其相互作用蛋白尚未進行深究。本研究中, 經(jīng)酵母雙雜交技術(shù)獲得VP6的兩種相互作用蛋白, 并通過共轉(zhuǎn)化試驗進一步驗證了它們之間的相互作用。在得到的兩種相互作用蛋白質(zhì)中, 其中一種與GAPDH的同源性高達99%, 可見其為GAPDH的可能性較大, 這是在GCRV與宿主相互作用過程中新發(fā)現(xiàn)的一種相互作用蛋白。GAPDH是糖酵解反應(yīng)中一個重要的代謝酶, 此外它還會參與轉(zhuǎn)錄激活、細胞凋亡的啟動等非代謝生理過程(方勤, 2005; Tarzeet al, 2007; Marret al, 2013; Zinsseret al, 2014)。作為VP6的一種相互作用蛋白, GAPDH在GCRV侵染過程中極可能參與了宿主的代謝調(diào)控, 或參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞凋亡的啟動調(diào)節(jié)等過程。但其具體的機制還有待后續(xù)研究深入的闡明, 此外這種相互作用與VP6作為夾合蛋白間的聯(lián)系, 以及這種相互作用與病毒表面突起物間作用的關(guān)聯(lián)性都值得作更深入的探討。而另一種相互作用蛋白尚屬未知蛋白, 加強對其鑒定及其功能研究可能會有更多的發(fā)現(xiàn), 極可能是對GCRV致病機理研究的一個突破。盡管對未知蛋白的研究困難重重, 在后續(xù)研究中一定要重視對它的研究, 以獲取更多的病毒致病機制的相關(guān)信息?？傊?本研究為進一步探討VP6的生物學(xué)功能以及GCRV的侵染機制指明了一定的方向, 該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、相互作用的分子機制及其調(diào)節(jié)機理等研究工作需要更加深入進行。

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