韓龍江 劉清華 紀利芹 溫海深① 黃 雯 張國范 李 軍①

(1. 中國科學院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國海洋大學水產(chǎn)學院 青島 266003; 3. 中國科學院大學 北京 100049)

自Ploges(1949)發(fā)現(xiàn)甘油在細胞低溫保存中有抗凍作用后, 生物細胞和組織的低溫冷凍保存研究迅速展開, 形成了一門新興學科—低溫生物學(cryobiology)。低溫生物學主要是研究在超低溫(-196°C)條件下生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化等生命現(xiàn)象的變化規(guī)律以及細胞、組織、器官乃至整個生物體活性保存的一門邊緣學科, 其在貝類配子和胚胎冷凍保存中應(yīng)用較為廣泛。有關(guān)海產(chǎn)貝類精子的低溫冷凍保存, 自20世紀70年代初就有報道, 目前在牡蠣、鮑魚等經(jīng)濟貝類上已有陸續(xù)開展, 其中在一些海產(chǎn)貝類的精子保存中取得了比較好的效果, 如Smith等(2001)研究了長牡蠣(Crassostrea gigas)的精子、卵和胚胎的低溫冷凍保存。Yang等(2012)在弗吉尼亞牡蠣(Crassostrea virginica)精子冷凍中發(fā)現(xiàn), 以無鈣Hank’s液作為稀釋液時, 10%的DMSO(二甲基亞砜)和PG(丙二醇)對精子冷凍保存效果最好。Adams等(2004)發(fā)現(xiàn)添加有0.45mol/L海藻糖的DMSO對太平洋牡蠣精液冷凍效果較好。從20世紀90年代開始,我國學者對重要海水養(yǎng)殖貝類, 如太平洋牡蠣(Crassostrea gigas) (李赟等, 2002)、香港牡蠣(Crassostreahongkongensis) (丁兆坤等, 2013)、櫛孔扇貝(Chlamys Farreri) (李純等, 2000)、九孔鮑(Haliotis diversicolor)(蔡明夷等, 2008)等進行了精子超低溫保存研究, 先后建立了10多種海洋貝類的精子冷凍保存技術(shù), 將冷凍精子技術(shù)進行了推廣和應(yīng)用, 對凍精生理活性、結(jié)構(gòu)及功能、遺傳穩(wěn)定性等方面進行了初步探討(李赟等, 2002)。過去20多年貝類精子超低溫保存研究工作的積累, 為今后太平洋牡蠣胚胎冷凍保存技術(shù)的建立和應(yīng)用以及低溫損傷機理的系統(tǒng)研究奠定了良好的科研基礎(chǔ)(張巖等, 2004)。貝類胚胎的保存特別是對于牡蠣早期幼蟲的超低溫保存技術(shù)的研究已有二十多年的歷史, 如Renard(1991)、Chao等(1994,1997)率先開展了對牡蠣胚胎的冷凍保存研究。隨后Gwo(1995)、Smith等(2001)、Paniagua等(2001)、Choi等(2003)等陸續(xù)開展了超低溫保存牡蠣幼蟲的相關(guān)研究, 并取得了較好的效果。

貝類配子、胚胎是海水養(yǎng)殖生產(chǎn)、優(yōu)良品種培育、及海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ), 隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展, 貝類種質(zhì)保護嚴重滯后的負面效應(yīng)越來越嚴重。忽視貝類種質(zhì)保護及品種選育工作會造成貝類種質(zhì)退化、生長速度減緩、對病害和環(huán)境脅迫的防御能力降低, 從而導致巨大的經(jīng)濟損失, 因此優(yōu)良貝類種質(zhì)保存已成為我國海水養(yǎng)殖業(yè)中亟待攻克的重要問題。開展貝類種質(zhì)的超低溫冷凍保存技術(shù)的研究、建立健全我國貝類種質(zhì)庫對于維持我國貝類種質(zhì)資源的穩(wěn)定、保護貝類遺傳多樣性、開展貝類遺傳改良和生物技術(shù)育種都具有重要的意義(孫振興等, 2005; 于海濤, 2004)。本實驗測定了不同濃度抗凍保護劑對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用及其冷凍保存的影響, 采用程序降溫儀來嚴格控制降溫速率;借助計算機輔助分析系統(tǒng)采集圖像視頻, 測定了不同抗凍保護劑在三種濃度下對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性并篩選出了一種太平洋牡蠣擔輪幼蟲的冷凍保存方法, 結(jié)果可靠穩(wěn)定, 對貝類種質(zhì)保存具有重要的借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 太平洋牡蠣擔輪幼蟲的采集

實驗所用的太平洋牡蠣于性成熟季節(jié)(2013年7月)購自青島嶗東海珍品良種培育有限公司, 殼高9.0—11.2cm, 殼寬5.5—6.0cm, 數(shù)量120只。暫養(yǎng)于中國科學院海洋研究所海洋貝類增養(yǎng)殖與生物技術(shù)實驗室100L水族箱內(nèi), 暫養(yǎng)期間水溫16—18°C, 每天換水一次。實驗時選擇性腺飽滿的牡蠣, 解剖后取精液與卵子, 按精卵比80∶1混合于20°C過濾海水(混合前卵子在過濾海水中活化30min, 精液在過濾海水中活化5min), 2h后取受精卵(100個以上)統(tǒng)計受精率, 然后轉(zhuǎn)移進50L塑料桶繼續(xù)培養(yǎng), 混合14h后統(tǒng)計孵化率。顯微鏡觀察大約14h后太平洋牡蠣胚胎進入擔輪幼蟲期, 開始實驗。

1.2 實驗方法

將發(fā)育到擔輪期的太平洋牡蠣幼蟲用200目的篩絹過濾濃縮, 裝入50mL的離心管中備用, 選取6種不同的抗凍保護劑PG(丙二醇)、DMSO(二甲基亞砜)、EG(乙二醇)、GLY(甘油)、MeOH(甲醇)、DMA(二甲基乙酰胺)與混有濃縮過太平洋牡蠣擔輪幼蟲的天然海水配成三個不同的濃度(5%、10%、15%), 置于4°C冰箱預(yù)冷20min后檢測太平洋牡蠣擔輪幼蟲活力作為抗凍保護劑毒性實驗指標; 將不同濃度抗凍保護劑中的太平洋牡蠣擔輪幼蟲吸入0.25mL的麥管中(法國IMV卡蘇公司), 封口粉封口后置于4°C冰箱中平衡20min, 待抗凍保護劑充分滲入擔輪幼蟲體內(nèi)后立即放入程序降溫儀中(型號Kryo-360-1.7), 采用分步降溫程序降溫: -1°C/min的降溫速率從0°C降至-15°C, 平衡5min后再以-3°C/min的降溫速率降至-40°C, 平衡2min, 以-15°C/min降至-80°C后以-20°C/min降至-180°C后直接投入液氮中保存。每一實驗組設(shè)三個平行, 實驗重復三次。

1.3 太平洋牡蠣擔輪幼蟲活力測定

抗凍保護劑毒性實驗中太平洋牡蠣擔輪幼蟲活力的測定: 用移液槍吸取100μL的海水于干凈載玻片上, 吸取5μL擔輪幼蟲加入其中, 混勻, 顯微鏡檢測活力, 采用計算機輔助精子分析(computer-assisted sperm analysis, CASA)系統(tǒng)隨機取三個視野采集太平洋牡蠣擔輪幼蟲運動狀態(tài)的視頻文件, 統(tǒng)計運動率。

超低溫保存實驗中太平洋牡蠣擔輪幼蟲活力的測定: 太平洋牡蠣擔輪幼蟲在液氮中保存2周后取出,將存有太平洋牡蠣擔輪幼蟲的麥管直接放入28°C水浴中解凍5—10s, 觀察到麥管內(nèi)液體呈透明狀后立即取出, 用剪刀剪開兩端待里面的液體完全流到載玻片上, 置于顯微鏡下觀察, 采用CASA系統(tǒng)隨機取三個視野采集太平洋牡蠣擔輪幼蟲運動狀態(tài)的視頻文件, 統(tǒng)計運動率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計所得的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)并采用Duncan氏進行多重范圍比較分析,P<0.05表示顯著差異, 所有結(jié)果均以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度及種類的抗凍保護劑對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用

不同濃度及種類的抗凍保護劑對太平洋牡蠣擔輪幼蟲毒性作用見圖1。當抗凍保護劑濃度為5%(v/v)時, GLY、DMSO、PG和EG四組抗凍保護劑中擔輪幼蟲的運動率均在93%以上(94.50%±1.32%、93.17%±0.76%、93.00%±1.00%), 且差異不顯著(P>0.05), 但均顯著高于DMA組89.50%±2.50%(P>0.05), 說明這四種抗凍保護劑對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性較小; MeOH組運動率最低, 僅為83.50%±1.50%, 顯著低于其他抗凍保護劑種類(P<0.05), 毒性作用最強。當抗凍保護劑濃度10%(v/v)時, GLY、DMSO、EG和MeOH運動率分別達到89.67%±2.52%、80.33%±5.51%、86.5%±0.50%、80.00%±2.00%, 各組之間差異不顯著(P>0.05), 說明10%濃度下GLY、DMSO、EG和MeOH對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性較小; 其次為PG組, 運動率達到68.33%±16.04%, 顯著高于DMA組33.17%±5.62%,(P<0.05), 但與DMSO、MeOH組差異不顯著。當抗凍保護劑濃度15%(v/v)時, GLY對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性較小, 運動率達到77.00%±2.00%, 與DMSO組73.67%±1.53%差異不顯著(P>0.05), EG組次之, 運動率達到76.67%±3.51%, 與PG組32.13%±2.60%、MeOH組27.93%±2.32%差異不顯著(P>0.05),而DMA組在該濃度下, 沒有擔輪幼蟲存活。

圖1 抗凍保護劑濃度及種類對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用Fig.1 The effect of different antifreeze protectants and concentration on trochophore larvae of Crassostrea gigas

由圖1可以看出, 同一種抗凍保護劑隨著其濃度上升, 對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性逐漸增大。六種不同的抗凍保護劑在5%(v/v)濃度時, 對擔輪幼蟲的毒性作用最小, 與10%、15%(v/v)濃度差異顯著(P<0.05)。GLY、EG、DMA、MeOH在10%濃度下的擔輪幼蟲運動率與其在15%濃度下差異顯著(P<0.05), 而DMSO、PG在這兩種濃度條件下差異不顯著(P>0.05)。

2.2 抗凍保護劑濃度及種類對太平洋牡蠣擔輪幼蟲超低溫保存的影響

不同的抗凍保護劑濃度及種類對太平洋牡蠣擔輪幼蟲超低溫保存的影響見圖2。當抗凍保護劑濃度為5%時, GLY、DMSO、PG、EG、DMA、MeOH組解凍后擔輪幼蟲的運動率分別達到59.67%±4.51%、32.33%±4.16%、13.33%±4.51%、24.33%±2.52%、3.67%±2.08%、0%, 且各組間差異顯著(P<0.05)。當抗凍保護劑濃度為10%時, DMSO組擔輪幼蟲解凍后的運動率達到最高值73.00%±2.00%, 顯著高于與其他抗凍保護劑中的擔輪幼蟲的運動率(P<0.05); GLY組次之, 解凍后擔輪幼蟲運動率達到56.00%±5.29%,顯著高于PG、EG組解凍后擔輪幼蟲運動率(P<0.05);PG組解凍后擔輪幼蟲運動率21.33%±4.51%與EG組解凍后擔輪幼蟲運動率25.33%±3.51%差異不顯著(P>0.05)。當抗凍保護劑濃度為15%時, GLY、DMSO、PG、EG組解凍后擔輪幼蟲的運動率分別達到62.33%±2.52%、12.23%±1.17%、9.3%±1.67%、25.17%±1.76%, 且各組間差異顯著(P<0.05); DMA、MeOH組解凍后沒有擔輪幼蟲存活。

圖2 抗凍保護劑濃度及種類對太平洋牡蠣擔輪幼蟲冷凍保存的影響Fig.2 The effect of different antifreeze protectants and concentration on trochophore larvae cryopreservation of Crassostrea gigas

由圖2可以看出, 當抗凍保護劑為GLY時, 5%、10%、15%濃度下?lián)営紫x解凍后運動率較高, 分別為59.67%±4.51%、56.00%±5.29%、62.33%±2.52%, 各濃度間差異不顯著(P>0.05), 當抗凍保護劑為DMSO、PG、EG時, 隨著抗凍保護劑濃度的上升, 對太平洋牡蠣擔輪幼蟲冷凍解凍后的運動率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。其中DMSO組三種不同濃度條件下?lián)営紫x解凍后的運動率差異顯著(P<0.05), 10%濃度下解凍后運動率達到最大值73.00%±2.00%, 顯著高于其5%濃度下32.33%±4.16%、10%濃度下12.23%±1.17%的解凍后運動率(P<0.05)。PG組在10%濃度下解凍后擔輪幼蟲運動率達到最大值21.33%±4.51%, 顯著高于其5%濃度下和10%濃度下?lián)営紫x解凍后運動率(P<0.05), 其5%濃度下運動率32.33%±4.16%和15%濃度下運動率12.23%±1.17%差異不顯著(P>0.05)。EG組在5%、10%、15%濃度下?lián)営紫x解凍后運動率差異不顯著(P>0.05), 分別為24.33%±2.52%、25.33%±3.51%、25.17%±1.76%。總之, 在不同抗凍保護劑及不同濃度下, 10%DMSO作為抗凍保護劑對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的保護作用最好, GLY次之。

2.3 太平洋牡蠣擔輪幼蟲超低溫保存方法的篩選

不同抗凍保護劑在其最優(yōu)濃度下對太平洋牡蠣擔輪幼蟲解凍后運動率的影響見圖3。DMSO在10%濃度下解凍后擔輪幼蟲的運動率達到最大值73.00%±2.00%, 顯著高于其他各抗凍保護劑最優(yōu)濃度下?lián)営紫x解凍后的運動率(P<0.05); 15%GLY組次之, 解凍后運動率達到62.33%±2.52%, 顯著高于10%PG、10%EG、5%DMA組解凍后擔輪幼蟲運動率(P<0.05); 10%PG、10%EG組解凍后擔輪幼蟲運動率分別達到21.33%±4.51%、25.33%±3.51%, 差異不顯著(P>0.05); 5%DMA組解凍后擔輪幼蟲運動率為3.67%±2.08%, 顯著低于其他實驗組(P<0.05)。

圖3 抗凍保護劑種類濃度對太平洋牡蠣精液保存效果的影響Fig.3 The effect of different antifreeze protectants and concentration on trochophore larvae cryopreservation of Crassostrea gigas

3 討論

3.1 抗凍保護劑種類和濃度對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用

抗凍保護劑多為滲透性的小分子物質(zhì), 主要通過滲入細胞內(nèi)部, 發(fā)生水合作用, 使細胞內(nèi)溶液的黏性增加, 從而保護細胞不受冷凍損傷。不同的抗凍保護劑由于其種類、濃度、分子大小、滲透能力、水活性及胞內(nèi)作用機理等各不相同, 對細胞冷凍保存效果亦有差異。隨著抗凍液濃度的增加, 滲入細胞內(nèi)的抗凍保護劑隨之增多, 由于抗凍液本身具有毒性, 濃度太高會在降溫前殺死細胞, 而濃度過低又起不到對細胞的保護作用, 所以冷凍保護劑應(yīng)該選擇無毒性或者毒性低、易滲透進細胞膜、并能很好地與細胞液或與水分子結(jié)合的物質(zhì)(Smithet al, 2001)。貝類配子和胚胎保存中常用的抗凍保護劑有GLY、DMSO、PG、EG、MeOH、MDA等, 雖然抗凍保護劑是牡蠣幼蟲冷凍過程中必不可少的, 但其毒性可能會導致幼蟲在預(yù)處理和解凍后死亡。例如, Chao等(1994)在驗證DMSO、EG、PG對牡蠣胚胎的毒性時發(fā)現(xiàn), 早期胚胎更容易受高濃度(4—5mol/L)抗凍保護劑的影響, 添加海藻糖或葡萄糖能夠顯著降低抗凍保護劑對牡蠣幼蟲的毒性; Nascimento等(2005)發(fā)現(xiàn),DMSO、MeOH對牡蠣幼蟲在平衡10—30min時的毒性無顯著差異, 而PG對牡蠣幼蟲平衡時間越長, 毒性作用越大。本實驗采用不同濃度的不同抗凍保護劑,對太平洋牡蠣擔輪幼蟲進行抗凍保護劑毒性實驗證明, 不同抗凍保護劑對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用不同。在相同平衡時間(20min)條件下, 太平洋牡蠣擔輪幼蟲毒性實驗說明: 隨著抗凍保護劑濃度的升高, 其對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性呈現(xiàn)逐漸增大趨勢; 在較低的5%濃度下, GLY、DMSO、PG、EG對太平洋牡蠣的毒性作用最小; 在10%濃度下,GLY、DMSO、EG、MeOH對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用較小; 而在15%較高濃度下, GLY、DMSO對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用最小。綜合分析可知, GLY、DMSO在太平洋牡蠣擔輪幼蟲冷凍保存中的效果最好, 這是由于GLY具有良好吸水性并能自由通過細胞膜, 有利于保持細胞水分、穩(wěn)定滲透壓,在海水中添加一定量的GLY會使海水的黏性增強、熱傳導加快、可調(diào)節(jié)細胞脫水并保護蛋白結(jié)構(gòu), 而且在高濃度下可以誘發(fā)膜融合。DMSO作為抗凍保護劑,具有滲透速度快、分布均勻、毒性低、且可以通過抑制過氧化氫酶的活性達到降低冷凍損傷的效果。而PG的抗凍保護作用是通過降低水相的極性從而改變細胞膜和水相之間的疏水性分子的分區(qū), 可能會導致脫磷脂雙分子層破壞從而降低抗凍效果。MeOH、DMA對細胞膜具有高度滲透性, 因此其毒性較大,高濃度下其冷凍效果較差。綜上所述, GLY、DMSO在不同濃度下的抗凍效果整體高于其他抗凍保護劑,但在較高濃度下使用時其對配子、細胞的毒性作用也可能會超過其抗凍保護作用。因此, 在慢速降溫冷凍保存太平洋牡蠣擔輪幼蟲時, 抗凍保護劑的濃度一般不應(yīng)大于15%。

3.2 太平洋牡蠣擔輪幼蟲的超低溫保存

滲透性抗凍保護劑通過滲透進入細胞內(nèi)部, 增加細胞質(zhì)的粘滯度從而降低冰點達到對細胞的保護作用?？箖霰Ｗo劑由于其種類和濃度不同, 對細胞的保護亦有所差異: 例如Renard等(1991)發(fā)現(xiàn)無抗凍保護劑冷凍保存牡蠣胚胎, 冷凍保存效果差; 當用0.5mol/L MeOH+0.5mol/L蔗糖作為抗凍保護劑, 有近一半的牡蠣胚胎存活。胚胎發(fā)育的不同時期, 對冷凍效果有顯著影響(王鵬飛等, 2008)。Gwo等(1995)發(fā)現(xiàn), 太平洋牡蠣擔輪幼蟲期較2-8細胞期及原腸胚期冷凍保存效果好, 當抗凍保護劑為10%PG時, 太平洋牡蠣胚胎的冷凍保存效果最好。Chao等(1997)發(fā)現(xiàn), 采用慢速降溫法冷凍保存牡蠣、文蛤的胚胎和初孵幼蟲, 當抗凍保護劑為2mol/L DMSO+0.06mol/L海藻糖時, 可以獲得較高的成活率。Paniagua等(2001)發(fā)現(xiàn), 在-2.5°C/min的慢速降溫速率下冷凍保存美國東部牡蠣(Crassostrea virginica)擔輪幼蟲, 10%、15%濃度的PG有較好的保存效果。Choi等(2003)發(fā)現(xiàn), 采用0.2mol/L的葡萄糖或蔗糖, 以-1°C/min的慢速降溫速率冷凍保存D形幼蟲, 保存效果最好。在了解凍存過程中細胞滲透壓的特性、細胞內(nèi)冰晶形成的特點、以及胚胎對抗凍保護劑毒性耐受等理論的基礎(chǔ)上,本研究設(shè)計了太平洋牡蠣擔輪幼蟲超低溫冷凍保存實驗并在上述實驗基礎(chǔ)上優(yōu)化了傳統(tǒng)的牡蠣胚胎兩步冷凍保存冷凍方法。結(jié)果表明: 凍存的太平洋牡蠣擔輪幼蟲的運動率隨著抗凍保護劑濃度的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 低濃度的抗凍保護劑由于其滲透保護作用差, 解凍后擔輪幼蟲的運動率低; 隨著抗凍保護劑濃度的升高, 擔輪幼蟲的運動率有增大趨勢; 但在較高濃度下, 抗凍保護劑毒性隨之增大,擔輪幼蟲的運動率降低。由于抗凍保護劑對太平洋牡蠣擔輪幼蟲冷凍保存的作用具有兩面性, 需要篩選出一個適宜濃度, 既能起到良好的抗凍保護作用, 又不會導致幼蟲細胞的損傷(Brocket al, 2001)。結(jié)果顯示, 濃度為10%的DMSO對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的冷凍保護作用最好。太平洋牡蠣在胚胎后期擔輪幼蟲階段(18°C水溫條件下, 受精后12h)以10%(v/v)DMSO作為抗凍保護劑, 采用分步降溫程序降溫(-1°C/min的降溫速率從0°C降至-15°C, 平衡5min后再以-3°C/min的降溫速率降至-40°C, 平衡2min,以-15°C/min降至-80°C后以-20°C/min降至-180°C)后直接投入液氮中保存, 然后將胚胎置于28°C水浴解凍后放入海水中, 計算機精子輔助分析(CASA)測得平均運動率達73.00%±2.00%, 運動率較高, 證明10%DMSO作為冷凍保護劑其毒性低、易滲透進細胞膜、并能很好地與細胞液結(jié)合保護胚胎不受損傷。改進后的慢速分步降溫法, 既能使牡蠣幼蟲細胞較快地度過結(jié)晶危險區(qū)(0—-40°C), 又不會使幼蟲細胞造成較大損害。本實驗中抗凍保護劑及慢速分步降溫方法的篩選, 為進一步提高牡蠣胚胎凍存的質(zhì)量提供了理論依據(jù)。目前貝類精子冷凍保存技術(shù)研究開展的較多, 并達到了可應(yīng)用的效果, 但是有關(guān)貝類擔輪幼蟲的冷凍保存技術(shù)研究在國內(nèi)還較為少見。該研究在貝類遺傳育種和生物技術(shù)等方面有一定的應(yīng)用前景, 具有較高的參考價值。

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