苗國(guó)英 亓海剛 李 莉 闕華勇① 張國(guó)范 胡曉麗

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 3. 中國(guó)海洋大學(xué) 青島 266003)

櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是我國(guó)重要的養(yǎng)殖貝類(lèi), 自然分布于我國(guó)北方黃渤沿海以及朝鮮和日本沿海(王如才等, 1993)。貝類(lèi)的大規(guī)模人工繁育以及養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐表明, 優(yōu)良種質(zhì)是決定貝類(lèi)產(chǎn)業(yè)能否健康可持續(xù)發(fā)展的首要因素, 選育抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)性狀優(yōu)良的品系, 是貝類(lèi)育種的重要目標(biāo)(張國(guó)范,2006)。開(kāi)展櫛孔扇貝功能基因研究, 有助于從分子水平上研究重要生命現(xiàn)象的基本規(guī)律, 推動(dòng)櫛孔扇貝基礎(chǔ)研究并為良種選育提供參考。

凋亡(apoptosis)是細(xì)胞在特定應(yīng)激條件下或者特定發(fā)育階段下發(fā)生的可調(diào)控的死亡現(xiàn)象, 又稱(chēng)細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)。凋亡本質(zhì)上是一種具有自我保護(hù)和調(diào)節(jié)性質(zhì)的細(xì)胞死亡事件,涉及一系列相關(guān)基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等作用, 是由基因控制的基本生物學(xué)過(guò)程之一(張曉暉等, 2002)。

Bax Inhibitor-1 (BI-1)基因是一種細(xì)胞凋亡調(diào)控因子, 存在于所有脊椎動(dòng)物中, 該基因主要定位于大鼠的7號(hào)染色體、小鼠的15號(hào)染色體、豬的5號(hào)染色體和人的12q12-q13 (Walteret al, 1994, 1995; Kimet al, 2003)。該基因首先是在1994年由Walter等人在小鼠的睪丸基因庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的, 并命名為T(mén)EGT(testis enhanced gene transcript) (Walteret al, 1995),其后Xu等(1998)在酵母中克隆出了能抑制Bax作用的基因, 命名為Bax Inhibitor-1, 即BI-1。BI-1蛋白是一個(gè)大小為25—27kDa的跨膜蛋白, 一般含有6—7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(Bolducet al, 2003; Kawai-Yamadaet al, 2004), 主要定位在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核外膜, 包含多個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn), 但缺乏O-糖基化位點(diǎn)及N-糖基化位點(diǎn)(Xuet al, 1998; Kawai-Yamadaet al,2001; Bolducet al, 2003)。BI-l基因主要通過(guò)參與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑發(fā)揮對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)功能(Kawaiet al, 1999; Tsujimotoet al, 2003; Chaeet al,2004)。

BI-1基因作為一種重要的凋亡調(diào)控因子, 在一些物種中已有了深入的研究(Hückelhovenet al, 2001;Bolducet al, 2002; Coupoet al, 2004; Watanabeet al,2009), 但是在貝類(lèi)中的分子類(lèi)型和作用還沒(méi)有被揭示。因此, 本研究通過(guò)RACE技術(shù)克隆了櫛孔扇貝(Chlamys farreri)中的BI-1基因全長(zhǎng)cDNA序列, 并進(jìn)一步采用熒光定量PCR技術(shù)揭示了該基因在櫛孔扇貝不同組織中的表達(dá)情況和在不同應(yīng)激條件下的表達(dá)變化特點(diǎn)。本研究旨在為開(kāi)展櫛孔扇貝BI-1基因的功能以及櫛孔扇貝凋亡相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用櫛孔扇貝(殼長(zhǎng)50mm±5mm)均來(lái)自青島膠南山東頭村扇貝養(yǎng)殖場(chǎng), 扇貝取回后清除表面污物和附著生物, 于18°C海水中充氣暫養(yǎng), 每日更換過(guò)濾海水, 并投喂三角褐指藻、金藻和螺旋藻粉混合餌料, 一周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 總RNA提取和cDNA的合成

取健康的櫛孔扇貝, 抽取其血液, 按照Trizol法提取總RNA。總RNA的完整度用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。取1μg總RNA, 參照立陶宛Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit使用說(shuō)明, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板, 置于-20°C的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CfBI-1基因cDNA片段的克隆

在GenBank上找到人、非洲爪蟾、果蠅等物種的BI-1蛋白序列, 并將這些序列用tBLASTn程序與櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列進(jìn)行比對(duì), 得到了與這些物種BI-1相近的基因片段, 根據(jù)期望值、相似度、得分等參數(shù)將基因片段篩選, 從而獲得CfBI-1基因的候選序列片段。根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物F1和R1 (表1)。以櫛孔扇貝的cDNA為模板, F1和R1為引物, 進(jìn)行CfBI-1基因片段的擴(kuò)增與測(cè)序驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系為25μL, 反應(yīng)條件如下: 94°C預(yù)變性3min; 94°C變性30s、56°C退火30s和72°C延伸1min,35個(gè)循環(huán); 72°C延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段大小后, 產(chǎn)物使用DNA膠回收試劑盒(上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司)回收目的片段產(chǎn)物?；厥盏哪康钠芜B接到PMD19-T載體(TaKaRa), 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)公司), 涂板, 37°C過(guò)夜培養(yǎng), 挑取抗氨芐青霉素的陽(yáng)性克隆, 菌落PCR驗(yàn)證目的片段符合預(yù)期大小后, 送上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。

1.4 CfBI-1基因全長(zhǎng)cDNA的獲得

采用巢式PCR和RACE方法擴(kuò)增基因的3′和5′末端。上述測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)BLASTx比對(duì)后驗(yàn)證為CfBI-1基因片段, 根據(jù)其分別設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE的引物3′F1、3′F2、5′R1、5′R2 (表1)。3′末端首輪PCR反應(yīng)體系為Premix LA Taq 12.5μL, 引物3′F1 1μL, Oligo(dT)-adapterprimer(dTAP) 2.5μL, 模板cDNA 1μL, 滅菌雙蒸水8μL; 反應(yīng)程序?yàn)? 94°C預(yù)變性5min; 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 1min 30s, 35個(gè)循環(huán); 72°C延伸10min。第二輪PCR引物為3′F2和AP(表1), PCR模板為首輪擴(kuò)增產(chǎn)物, 退火溫度為56°C,其他條件同首輪。5′末端擴(kuò)增時(shí), 首先使用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA3′末端加上poly C尾, 以加尾的cDNA為PCR模板; 首輪PCR反應(yīng)體系為Premix LA Taq 12.5μL, 引物5′R1和Oligo(dG)-adapterprimer(dGAP)(表1)各1μL, 模板1μL, 滅菌雙蒸水9.5μL; 反應(yīng)程序: 94°C預(yù)變性5min; 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 1min 30s, 35個(gè)循環(huán); 72°C延伸10min。次輪PCR引物為5′R2和AP, PCR模板為首輪擴(kuò)增產(chǎn)物, 退火溫度為58°C, 其他條件同首輪。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)、回收純化、克隆測(cè)序等操作同上述cDNA片段克隆。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 CfBI-1基因的序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

用Bioedit軟件對(duì)上述所獲測(cè)序序列進(jìn)行全長(zhǎng)拼接; ORF Finder程序(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框, 并獲得編碼的氨基酸序列; 用SMART程序(http: //smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè); 從GenBank下載小鼠、人、斑馬魚(yú)、紫貽貝等物種的BI-1基因的蛋白序列, 用ClustalX程序進(jìn)行蛋白多序列比對(duì)后, 用MEGA5.0程序中的鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

1.6 干露刺激

將60只暫養(yǎng)一周的櫛孔扇貝放于干燥的玻璃板上, 室溫溫度控制在20°C, 分別在0、2、4、6、8、12、24h隨機(jī)取6只扇貝, 取血淋巴, 500g, 4°C, 離心10min, 棄上清, 留血淋巴用于RNA制備。

1.7 脂多糖(LPS)刺激

將100只暫養(yǎng)一周的櫛孔扇貝隨機(jī)分為兩組, 每組約50只, 為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組, 分別養(yǎng)殖在兩個(gè)水池中。實(shí)驗(yàn)組的扇貝每只注射100μL LPS (0.5mg/mL),對(duì)照組的扇貝每只注射100μL滅菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)。分別在注射0、3、6、12、24、48、72h從各組隨機(jī)取6只扇貝, 取血淋巴, 500g, 4°C, 離心10min,棄上清, 留血淋巴用于RNA制備。

1.8 急性病毒性壞死癥病毒(Acute Viral Necrobiotic Disease Virus, AVNV)刺激

將急性病毒性壞死癥病毒所感染的組織(由黃海水產(chǎn)研究所王崇明老師提供)稱(chēng)重, 每克組織加9mL的PBS緩沖液, 冰浴研磨勻漿, 4°C, 4000×g離心5min, 將上清液移到新的離心管中, 將沉淀再進(jìn)行一次研磨, 8000×g離心5min, 將兩次的上清液合并到一個(gè)管中, 13000×g離心10min, 澄清的組織勻漿在無(wú)菌的條件下, 用2、0.8、0.22μm的濾膜過(guò)濾, 將所得到的濾液-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

將120只櫛孔扇貝隨機(jī)分為兩組, 每組約60只,為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組的扇貝每只注射100μL的病毒液, 對(duì)照組的扇貝每只注射100μL的滅菌的PBS。分別于注射后0、3、6、12、24、48、72h從各組隨機(jī)取6只扇貝, 取血淋巴, 500×g, 4°C, 離心10min, 棄上清, 留血淋巴用于RNA制備。

1.9 CfBI-1基因的表達(dá)分析

參照Trizol(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)提取櫛孔扇貝各組織(血淋巴、鰓、外套膜、閉殼肌、性腺、消化腺)及干露、LPS、病毒刺激實(shí)驗(yàn)樣品的總RNA, 用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)試劑盒合成一鏈cDNA用于熒光定量表達(dá)分析。根據(jù)櫛孔扇貝BI-1基因和內(nèi)參基因β-actin (GenBank序列號(hào)為AAP88387), 分別設(shè)計(jì)一對(duì)熒光定量的引物CfBI-1F′和CfBI-1R′, β-actinF′和β-actinR′ (表1)。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為20μL: 2×SYBR? Premix Ex TaqTM10uL cDNA模板2μL, 熒光定量引物各0.4μL, 50×ROX Reference Dye II 0.4μL, DEPC水6.8μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性2min; 95°C 15s, 60°C 25s, 68°C 20s, 40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算CfBI-1基因的表達(dá)量, 并采用SPSS 18.0軟件和SAS 9.1軟件分別進(jìn)行one-way ANOVA分析和Duncan檢驗(yàn), 以P<0.05作為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CfBI-1基因的全長(zhǎng)cDNA序列分析

根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物克隆得到CfBI-1基因的部分片段, 然后根據(jù)該片段設(shè)計(jì)RACE引物進(jìn)行3′和5′端的擴(kuò)增, 得到3′和5′末端的序列, 最后拼接得到一條完整的cDNA序列。其全長(zhǎng)為957bp (Genbank注冊(cè)號(hào)為KF913642), 其開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為711bp, 5′非編碼區(qū)(5′-UTR)為48bp, 3′-UTR為195bp,3′-UTR區(qū)含有多腺苷酸化加尾信號(hào)aataa (圖1)。CfBI-1基因預(yù)測(cè)編碼一個(gè)含有237個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì), 分子量為27kDa, 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CfBI-1蛋白含有六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.2 CfBI-1基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將CfBI-1蛋白序列與其他物種的同源蛋白在ClustalX中進(jìn)行多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn), 櫛孔扇貝BI-1基因與小鼠(Mus musculus)、紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)、人(Homo sapiens)、斑馬魚(yú)(Danio rerio)及果蠅(Drosophila melanogaster)的BI-1氨基酸同源性分別為48.95%、63.56%、49.37%、49.79%和36.29% (圖2)。使用MEGA軟件構(gòu)建BI-1氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示, 櫛孔扇貝BI-1基因與紫貽貝聚為一支, 之后又與豬蛔蟲(chóng)(Ascaris suum)和斑馬魚(yú)等聚類(lèi)(圖3)。該基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與傳統(tǒng)的物種進(jìn)化地位基本一致。

2.3 CfBI-1基因的表達(dá)分析

2.3.1 CfBI-1基因在各組織的表達(dá)分析 通過(guò)Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)CfBI-1基因在櫛孔扇貝不同組織中的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示, CfBI-1在所檢測(cè)的鰓、外套膜、閉殼肌、性腺、消化腺和血淋巴六個(gè)組織中均有表達(dá), 且在閉殼肌中表達(dá)量最高, 而在血淋巴中表達(dá)量最低(圖4)。

圖1 CfBI-1基因cDNA全長(zhǎng)及預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.1 CfBI-1 full-length cDNA and deduced amino acid sequence

2.3.2 CfBI-1基因在干露刺激下的表達(dá)分析Real-time PCR檢測(cè)了櫛孔扇貝在干露刺激后不同時(shí)間點(diǎn)血淋巴中的BI-1基因的表達(dá)變化(圖5)。結(jié)果表明: 在干露刺激初期(0—2h), BI-1基因的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化; 在干露刺激后4h, BI-1基因的表達(dá)水平迅速升高, 達(dá)到0h的約3.09倍(P<0.05); 在干露刺激后6h, BI-1基因的表達(dá)水平達(dá)到最高, 約為0h的25.50倍(P<0.05), 在刺激后期(8—24h), BI-1基因的表達(dá)水平略有下降, 但與0h仍有顯著性差異(P<0.05)。

2.3.3 CfBI-1基因在LPS刺激下的表達(dá)分析Real-time PCR檢測(cè)了櫛孔扇貝在LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)血淋巴中的BI-1基因的表達(dá)變化(圖6)。結(jié)果表明, 在LPS刺激的過(guò)程中, 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的表達(dá)均沒(méi)有明顯升高, 并且兩組之間沒(méi)有明顯差異。

2.3.4 CfBI-1基因在急性病毒性壞死癥病毒刺激下的表達(dá)分析 Real-time PCR檢測(cè)了櫛孔扇貝在急性病毒性壞死癥病毒刺激后不同時(shí)間點(diǎn)血淋巴中的BI-1基因的表達(dá)變化(圖7)。結(jié)果表明: 在病毒刺激以后, 實(shí)驗(yàn)組的BI-1基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì), 在刺激后24h, 實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量為對(duì)照組的1.82倍(P<0.05), 在病毒刺激后48h實(shí)驗(yàn)組達(dá)到最高值, 約為對(duì)照組的1.75倍(P<0.05)。

圖2 不同物種BI-1氨基酸序列多重比對(duì)分析Fig.2 Multiple alignment of the amino acid sequence of BI-1 among different species

圖3 CfBI-1基因的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 NJ phylogenetic tree of the CfBI-1 gene sequences

3 討論

圖4 CfBI-1基因在櫛孔扇貝不同組織中的表達(dá)Fig.4 Expression levels of CfBI-1 in different tissues of Chlamys farreri

圖5 CfBI-1基因在干露刺激后的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of CfBI-1 under air exposure stimulation

圖6 CfBI-1基因在LPS刺激后的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of CfBI-1 under lipopolysaccharide(LPS) stimulation

圖7 CfBI-1基因在急性病毒性壞死癥病毒刺激后的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of CfBI-1 under acute viral necrobiotic disease virus (AVNV) stimulation

目前, 在水生生物中BI-1基因的研究還比較少,尤其是在貝類(lèi)中的特點(diǎn)和功能仍有待研究和揭示。本研究首次通過(guò)RACE技術(shù)獲得了櫛孔扇貝BI-1基因的cDNA序列, 并獲得可能的編碼蛋白序列。同源分析和分子進(jìn)化聚類(lèi)分析結(jié)果顯示, CfBI-1蛋白序列與其他一些物種BI-1序列具有很高的相似性, 表明該基因在進(jìn)化上和功能上的高度保守性。BI-1蛋白在哺乳動(dòng)物和植物中主要定位在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核外膜,蛋白包含多個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn), 但缺乏O-糖基化位點(diǎn)及N-糖基化位點(diǎn)(Xuet al, 1998; Kawai-Yamadaet al, 2001; Bolducet al, 2003), 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)CfBI-1蛋白含有六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域, 表明CfBI-1蛋白在櫛孔扇貝中的細(xì)胞定位可能與哺乳動(dòng)物相同。

BI-1基因不僅在人體心臟、胎盤(pán)、腦、肝、肺、骨胳肌等組織中廣泛表達(dá)(Adamset al, 1995; Xuet al,1998), 且在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá), 這與其對(duì)凋亡的抑制作用緊密相關(guān)(Villalvaet al, 2002;Grzmilet al, 2003)。本研究發(fā)現(xiàn)CfBI-1基因在櫛孔扇貝的鰓、外套膜、閉殼肌、性腺、消化腺和血淋巴六個(gè)組織中均有表達(dá), 表明CfBI-1對(duì)櫛孔扇貝的正常生命活動(dòng)起到一定作用, 且表達(dá)無(wú)明顯的組織特異性; 在閉殼肌中表達(dá)量顯著高于其他組織, 表明在閉殼肌中較高濃度的BI-1蛋白抑制細(xì)胞凋亡水平對(duì)維持閉殼肌正常生理功能可能有重要作用。

為進(jìn)一步探究CfBI-1基因在櫛孔扇貝中的功能,本研究分別檢測(cè)了干露、LPS和急性病毒性壞死癥病毒刺激櫛孔扇貝后CfBI-1基因的表達(dá)變化。在干露和病毒刺激以后, 在不同時(shí)間點(diǎn), 表達(dá)水平發(fā)生了明顯的升高, 而在LPS刺激以后沒(méi)有明顯變化, 說(shuō)明不同的刺激源引起的細(xì)胞應(yīng)激類(lèi)型、細(xì)胞凋亡程度和凋亡信號(hào)通路可能有所不同。干露作為一種物理刺激,主要導(dǎo)致扇貝處于脫水低氧的脅迫狀態(tài), 在干露刺激后4—6h CfBI-1表達(dá)即顯著上調(diào), 上調(diào)幅度較大,能夠維持至刺激后24h, 說(shuō)明CfBI-1基因參與了細(xì)胞干露應(yīng)激的響應(yīng)過(guò)程, 干露可能會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)變化并啟動(dòng)凋亡程序。病毒刺激后24、48h CfBI-1表達(dá)顯著高于對(duì)照, 表明CfBI-1基因參與了病毒介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。Taura綜合癥病毒感染后的南美白蝦中包含BI-1結(jié)構(gòu)域的基因表達(dá)量也顯著上調(diào)(Zenget al, 2013), 與我們的研究結(jié)果類(lèi)似。但是病毒刺激后CfBI-1上調(diào)幅度較小, 72h后表達(dá)量開(kāi)始回落, 推測(cè)病毒感染后免疫反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡程度可能低于干露刺激。而在LPS刺激后, 在0—72h內(nèi)均未觀察到CfBI-1表達(dá)變化, 表明CfBI-1對(duì)LPS刺激無(wú)明顯響應(yīng)過(guò)程。綜上, 我們認(rèn)為CfBI-1基因參與了干露刺激和急性病毒性壞死癥病毒感染應(yīng)激過(guò)程,在這些刺激所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過(guò)程中可能發(fā)揮重要凋亡調(diào)節(jié)功能。

致謝 感謝中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所王崇明老師提供扇貝急性病毒性壞死癥病毒病料組織。

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