周立斌 白 茹 馬細(xì)蘭 王樹齊 張海發(fā)

(1. 惠州學(xué)院生命科學(xué)系 生物技術(shù)研究所 惠州 516007; 2. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510631;3. 汕頭大學(xué) 廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室 汕頭 515063; 4. 廣東省海洋漁業(yè)試驗中心 惠州 516081)

一氧化氮(nitric oxide, 簡稱NO)是一種氣體信號分子, 許多研究表明, NO對魚類的非特異性免疫有著重要的作用, 通過格蘭氏陽性菌(Renibacterium salmoninarum)處理虹鱒后, 發(fā)現(xiàn)血清中一氧化氮含量升高, 并且魚體血清中一氧化氮含量隨細(xì)菌毒性增強(qiáng)而增高(Campos-Perezet al, 2000)。用一種熱滅活乳酸菌的(Lactococcus lactis)能顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO (Villamilet al, 2002)。水產(chǎn)動物體內(nèi)的NO在病毒免疫方面也有一定的作用, 病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)能導(dǎo)致大菱鲆體內(nèi)的NO含量增加(Tafallaet al, 1999)。NO的生成通過一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, 簡稱NOS)進(jìn)行, 通過催化L-精氨酸, 在體內(nèi)合成NO, 從而在魚體的免疫中起到作用。一氧化氮合酶(NOS)參與魚類的多種生理活動并與免疫和神經(jīng)傳遞有關(guān), 有研究表明病毒性出血性敗血癥病毒促使虹鱒體內(nèi)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶含量增加的上調(diào)(Tafallaet al, 2005)。

美國紅魚(Sciaenops ocellatusLinnaeus), 屬鱸形目Perciformes、石首魚科Scuaebudae、擬石首魚屬Sciaenops, 是一種重要的養(yǎng)殖魚類。有關(guān)美國紅魚生長和免疫的研究有一些報道(周立斌等, 2009, 2013),主要是研究維生素和礦物質(zhì)對美國紅魚生長和免疫的影響, 但有關(guān)美國紅魚的一氧化氮免疫調(diào)控的研究相對較少(Zhouet al, 2009; 周立斌等, 2012)。本實驗研究在配合飼料中添加不同劑量的維生素C對美國紅魚組織中的NO含量、NOS活力以及nNOS基因mRNA的表達(dá)的影響, 探討維生素C與美國紅魚組織中NO、NOS以及nNOS基因的免疫關(guān)系, 對美國紅魚飼料飼料配方設(shè)計和魚病防治提供基礎(chǔ)資料和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚與試驗設(shè)計

試驗于廣東省海洋漁業(yè)試驗中心進(jìn)行, 試驗魚和試驗設(shè)計參考周立斌等(2013)方法, 美國紅魚分6組, 各組維生素C實際含量為0、49.3、98.9、198.7、398.6、1987.4 mg/kg, 分別用C0、C49.3、C98.9、C197.5、C396.4和C1989.8來表示。

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)管理參考周立斌等(2013)方法。試驗共進(jìn)行8周, 將美國紅魚解剖后取出出頭腎、脾臟、肝臟、腸、腦、胸腺組織, 存放于–80°C低溫冰箱備用。

1.3 試劑

總RNA提取試劑Trizol Reagent試劑盒購自Invitrogen公司。 ReVerTra Ace-a-TMKit、Real-time PCR Master Mix試劑盒購自TOYOBO公司Ex-TaqPolymerase Kit購自TaKaRa公司。引物委托上海英俊生物工程公司合成。100bp DNA Ladder為天為時代公司產(chǎn)品; 其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 美國紅魚組織nNOS基因表達(dá)分析

選取頭腎、脾臟、肝臟、腸、腦、胸腺組織進(jìn)行檢測。用Trizol提取各組織的總RNA, 通過DnaseⅠ處理后。采用ReVerTra Ace-a-TMKit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)已測序的美國紅魚nNOS基因cDNA序列和18S基因序列, 應(yīng)用Prime Primer 5.0引物設(shè)計軟件在美國紅魚nNOS基因3’端設(shè)計適用于Real-time PCR的引物(表1)。引物委托上海英俊生物工程公司合成。

Real-time PCR反應(yīng)體系采用20μL體系: 10μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 1μL RT產(chǎn)物,0.4μL特異性產(chǎn)物。PCR反應(yīng)程序為: 95°C預(yù)變性60s; 隨后95°C變性15s, 57°C退火15s, 72°C延伸30s,進(jìn)行40個循環(huán)。

通過ABI PRISM 7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems)測定, 達(dá)到熒光閾值(CT)的18S反應(yīng)循環(huán)數(shù)。通過質(zhì)粒濃度和所對應(yīng)CT值建立β-action、nNOS基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后通過各樣本達(dá)到CT值所需的循環(huán)數(shù), 和相應(yīng)的內(nèi)參基因達(dá)到CT值所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)做比對, 從而得出樣本的相對濃度,結(jié)果采用相對濃度表示, 即表示為目的基因濃度/內(nèi)參基因濃度(nNOS/β-action×100)。

表1 Real-time PCR檢測美國紅魚體內(nèi)nNOS基因所用引物Tab.1 Nucleotide sequences of the primers used for Real-time PCR

1.5 NO和NOS測定

NO測定采用硝酸還原酶法, NOS測定采用化學(xué)比色法, 試劑均購于南京建成生物工程研究所。各項指標(biāo)的測定均在722紫外光柵分光光度計上進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計

實驗所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE),采用SPSS11.0軟件統(tǒng)計包中的單因素方差分析和Duncan’s法檢驗, 當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料維生素C對美國紅魚組織NO含量的影響

經(jīng)過8周飼養(yǎng)試驗, 各試驗組美國紅魚各組織NO含量見表2。從表2可以看出, 頭腎、肝、腸、胸腺NO含量隨著飼料維生素C含量增加有顯著增加,飼料中維生素C最高含量的C1989.8組頭腎、肝、腸和胸腺中NO含量與其它試驗組NO含量相比有顯著增加, 達(dá)到最高水平; 脾中各組NO含量無顯著性差異;腦中NO含量對照組C0組與其它各組相比有顯著性差異, 其它各組之間腦中NO含量無顯著性差異。

表2 不同水平飼料維生素C處理對美國紅魚組織NO(μmol/g prot)的影響Tab.2 Effect of dietary vitamin C in different level on NO in tissues of red drum

2.2 飼料維生素C對美國紅魚組織NOS活力的影響

經(jīng)過8周飼養(yǎng)試驗, 各試驗組美國紅魚各組織NOS活力見表3。從表3可以看出, 頭腎、肝、胸腺NOS活力隨著飼料維生素C含量增加有顯著增加, 飼料中維生素C最高含量的C1989.8組頭腎、肝和胸腺中NO含量與其它試驗組NO含量相比有顯著增加, 達(dá)到最高水平; 脾和腸中各組NOS活力無顯著性差異; 腦中NOS活力C396.4組與其它各組相比有顯著性差異,其它各組腦中NOS活力沒有顯著性的差異。

2.3 飼料維生素C對美國紅魚組織nNOS基因mRNA表達(dá)的影響

經(jīng)過8周飼養(yǎng)試驗, 各試驗組美國紅魚各組織nNOS基因mRNA表達(dá)的結(jié)果見表4。從表4可以看出, 腦中各組nNOS基因mRNA的表達(dá)含量無顯著性差異; 頭腎、脾、肝、腸和胸腺的各組nNOS基因mRNA的表達(dá)含量有顯著性差異, 變化趨勢不明顯,在飼料維生素C含量達(dá)到最高水平1989.8mg/kg時,各組織內(nèi)的nNOS基因mRNA的表達(dá)量最高。

表3 不同水平飼料維生素C處理對美國紅魚NOS活力(U/mg prot)的影響Tab.3 Effect of dietary vitamin C in different level on NOS activity in tissues of red drum

表4 不同水平飼料維生素C處理對美國紅魚組織nNOS基因mRNA表達(dá)(1×10-8 nNOS/18S)的影響Tab.4 Effect of dietary vitamin C in different level on nNOS mRNA expression in tissues of red drum

3 討論

大量的實驗證據(jù)表明, NO 參與心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和腫瘤等多種生理活動的調(diào)節(jié)(Moncadaet al, 1991)。有關(guān)哺乳動物的研究中, NO在舒張血管的反應(yīng)中具有重要作用,可以維持正常血管的張力。NOS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中分布非常廣泛, 通過免疫組化技術(shù), 已在大鼠小腦、上下丘、海馬齒狀回、垂體后葉、下丘腦視上核、室旁核等處發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物(Saxenaet al, 2001)。NO在CNS的信號傳遞中起神經(jīng)遞質(zhì)的作用。NO在免疫系統(tǒng)中有重要的功能, 包括抗菌, 抗腫瘤, 抗炎癥, 促進(jìn)細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子增殖, 促進(jìn)T細(xì)胞活化等各方面的功能(Kolbet al, 1998;Kronckeet al, 1998; Weinberg, 1998)。

神經(jīng)元型NOS (neuronal NOS, nNOS) 為細(xì)胞內(nèi)鈣離子依賴型, 在正常生理狀態(tài)下即可表達(dá), 產(chǎn)生少量NO發(fā)揮生理效應(yīng)。nNOS在哺乳動物中的許多組織中都有分布, 而在魚類中, 虹鱒魚仔魚頭腎中的nNOS細(xì)胞數(shù)量較多, 隨著魚體長大, nNOS細(xì)胞出現(xiàn)在一些神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)纖維中(Campos-Perezet al,2000), 虹鱒成魚腎和胃腸道中NOS細(xì)胞數(shù)目也較多(Joneset al, 2007)。而NOS合酶的基因在海膽、果蠅、蚊、魚、雞、鼠、牛和人中都進(jìn)行了研究。人類nNOS基因是三個亞型基因中最大的, 長度大于24kb, 含29個外顯子(Chartrainet al, 1994)。目前在多種魚中已有NOS基因研究的報道, 包括虹鱒、金魚、大西洋鮭和溝鯰等(Bellet al, 1997; Lainget al, 1999;Ebbessonet al, 2005)。

維生素C是魚類生長和生理活動必需的營養(yǎng)物質(zhì), 有研究表明它在魚類的免疫中有著重要的作用。維生素C在體內(nèi)參與氧化還原反應(yīng), 作為脯氨酸羥化酶的輔酶直接影響膠原蛋白的合成。鲇魚飼料中缺乏維生素C會導(dǎo)致生長變慢, 脊柱變形, 出血, 鰭壞死等嚴(yán)重癥狀(Limet al, 1978)。維生素C還具有防止低價鐵的氧化, 促進(jìn)腸道對鐵的吸收, 增強(qiáng)水生動物的抗病力等生理功能(趙文, 1995)。研究表明, 配合餌料中添加維生素C可以增強(qiáng)中國對蝦的抗低氧能力, 同時降低中國對蝦的發(fā)病率(王安利等, 1996)。金頭鯛(Sparus aurataL.)頭腎巨噬細(xì)胞與含維生素C的培養(yǎng)液孵育能提高其細(xì)胞殺傷活性, 體內(nèi)實驗也表明, 飼料中添加維生素C能提高其血清溶菌酶活力(Cuestaet al, 2008)。本研究中, 飼料中最高含量的維生素C的組頭腎、肝、腸和胸腺中NO含量與其它試驗組NO含量相比有顯著增加, 表明隨著飼料中維生素C水平增加, 頭腎、肝、腸和胸腺中NO含量也隨著增加; 脾中各組NO含量無顯著性差異, 表明飼料中維生素C含量對脾組織中NO含量影響不大; 另外各試驗組腦中NO含量與對照組相比有顯著增加, 表明飼料中添加維生素C能顯著影響美國紅魚腦中NO含量。Montero等(1999)的研究也表明, 金頭鯛(Sparus aurataL.)攝食維生素C含量為250mg/kg的飼料時,耐密集和抗病力較強(qiáng); 而攝食含500—300mg維生素C的飼料時, 頭腎白細(xì)胞的吞噬活性、呼吸暴發(fā)活力較強(qiáng)(Muleroet al, 1998; Ortunoet al, 2001); 維生素C對美國紅魚組織中NOS活力的影響的結(jié)果類似于組織中NO含量的變化。本研究中, 頭腎、肝、胸腺NOS活力隨著飼料維生素C含量增加有顯著增加, 與組織中NO含量的變化相類似; 腦中NOS活力C396.4組與其它各組相比有顯著性差異, 表明飼料中適當(dāng)?shù)木S生素C可以提高腦中NOS活力, 維生素C含量過高可能影響腦中NOS活力。另外本研究中, 脾和腸中各組NOS活力無顯著性差異, 表明維生素C對美國紅魚脾和腸組織中NOS活力影響不大。

對于NOS基因表達(dá)與免疫的研究, 大多集中在誘導(dǎo)型NOS(iNOS)基因的誘導(dǎo)表達(dá), 有關(guān)nNOS基因誘導(dǎo)表達(dá)研究在魚類開展的還很少, 通過本次實驗,可以推測美國紅魚體內(nèi)的nNOS的表達(dá)像iNOS一樣,也是可以被誘導(dǎo)表達(dá)的。與iNOS表達(dá)誘導(dǎo)不同的是,nNOS基因在正常的生理狀態(tài)下少量的表達(dá), 產(chǎn)生少量的NO維持機(jī)體的生理活動。在本研究中, 高劑量的維生素C對美國紅魚nNOS基因mRNA的表達(dá)起到明顯的促進(jìn)作用, 除在脾臟外, 其它組織內(nèi)的nNOS基因mRNA的表達(dá)均隨著維生素C的濃度的增長有所增高, 并且維生素C含量在1987.4mg/kg時對多數(shù)組織nNOS基因表達(dá)的促進(jìn)作用最為顯著, 這與包膜維生素C對胡子鯰血清SOD活力的結(jié)果類似(李桂峰等, 2004), 隨著飼喂時間的增長和維生素C水平的增加, 其SOD活力就越高, 以血清SOD為非特異性免疫指標(biāo), 大口黑鱸飼料中維生素C最適添加量為2000 mg/kg。還有報道, 當(dāng)維生素C濃度為3g/kg添加飼料投喂金頭鯛(Sparus aurataL.), 發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)頭腎巨噬細(xì)胞吞噬能力和呼吸鏈暴發(fā)活性增強(qiáng)(Ortunoet al, 2001), 通過本次研究可以推測維生素C不僅可以增強(qiáng)機(jī)體溶菌酶、SOD以及巨噬細(xì)胞吞噬能力, 還能夠誘導(dǎo)體內(nèi)nNOS的表達(dá), 從而進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。更重要的是, 通過實驗發(fā)現(xiàn)維生素C對胸腺和頭腎內(nèi)nNOS基因mRNA基因表達(dá)促進(jìn)作用量明顯高于其它組織內(nèi)nNOS基因的表達(dá), 這又進(jìn)一步證明維生素C可以在機(jī)體免疫方面起到重要的作用。綜上所述, 飼料中添加適當(dāng)維生素C對美國紅魚組織中的NO含量、NOS活力和nNOSmRNA基因表達(dá)有顯著影響, 表明飼料中適當(dāng)?shù)木S生素C對美國紅魚的免疫有促進(jìn)作用。

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