王 偉 吳旭干 樓 寶 徐 蕾 劉智俊 成永旭①

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué) 上海高校知識服務(wù)平臺水產(chǎn)動物遺傳育種中心 上海 201306; 3. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所 舟山 316100)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我國一種重要的經(jīng)濟(jì)蟹類, 在海洋捕撈和海水養(yǎng)殖中都占有重要地位(謝忠明等, 2002)。盡管2012年我國三疣梭子蟹的養(yǎng)殖產(chǎn)量已經(jīng)高達(dá)9.96萬t (農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局,2013), 但是三疣梭子蟹育苗和養(yǎng)殖過程中的蛻皮綜合征(molting death syndrome, MDS)一直是困擾該產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要問題(Takeuchiet al, 1999a, b; Wuet al, 2010a, b; 路允良等, 2012)。MDS是指蟹類不能順利完成蛻皮, 在蛻皮過程中或蛻皮不久便大量死亡的一種綜合癥狀, 這給經(jīng)濟(jì)蟹類養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Suprayudiet al, 2004), 其形成原因非常復(fù)雜, 初步研究結(jié)果表明MDS可能與餌料營養(yǎng)及環(huán)境因子有密切關(guān)系(Danet al, 2011; 路允良等,2012)。深入了解MDS的形成機(jī)制, 首先必須研究三疣梭子蟹蛻皮的生理機(jī)制, 從而為三疣梭子蟹養(yǎng)殖過程中MDS的控制提供理論參考和實(shí)踐依據(jù)。

甲殼動物的蛻皮過程受包括蛻皮激素、眼柄神經(jīng)多肽類和甲基法尼酯等多種激素的聯(lián)合調(diào)控, 它們有著不同的生理功能和調(diào)控路徑(Riddifordet al,2003)。蛻皮激素在蛻皮過程中扮演著十分重要的角色, 其含量在蛻皮過程中呈周期性變動, 蛻皮前含量最高, 蛻皮間期含量最低(Mykles, 2011; Techaet al,2013)。蛻皮激素對甲殼動物蛻皮過程的生理調(diào)控是主要通過與蛻皮激素受體(EcR)和類維甲酸X受體(RXR)的二聚體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。蛻皮激素與此二聚體的結(jié)合體可直接與細(xì)胞核上的激素應(yīng)答原件結(jié)合,調(diào)節(jié)下游基因E74及E75等的轉(zhuǎn)錄, 從而調(diào)控甲殼動物的蛻皮過程(Riddifordet al, 2003; Kimet al, 2005;Techaet al, 2013)。RXR是核受體超家族的一員, 具有核受體家族的典型特征, 在結(jié)構(gòu)上分為A、B、C、D、E、F六區(qū), 組成四個功能結(jié)構(gòu)域(A/B域、C域、D域和E/F域)。目前有關(guān)甲殼動物的RXR研究主要集中在RXR的基因克隆及其表達(dá)模式分析, 功能研究較少(Wuet al, 2004; Kimet al, 2005; Priyaet al,2009)。先前的研究結(jié)果表明, 不同甲殼動物的RXR基因序列及結(jié)構(gòu)存在較大的差異(Duricaet al, 1996;Wuet al, 2004; Kimet al, 2005), 且RXR在不同甲殼動物蛻皮過程中的表達(dá)模式也有所不同(Asazumaet al, 2007; 王文青等, 2010; 王瑤等, 2013)。通過研究RXR基因在甲殼動物不同組織及不同蛻皮階段的表達(dá)情況, 可以初步了解RXR的表達(dá)部位、調(diào)控位點(diǎn)及其與蛻皮過程的關(guān)系, 從而為深入研究RXR的基因功能奠定基礎(chǔ)。迄今為止有關(guān)三疣梭子蟹RXR基因克隆和表達(dá)模式的研究報(bào)道極少, 僅見NCBI中登錄的一條三疣梭子蟹RXR基因cDNA序列。因此, 本研究在通過三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組文庫獲得RXR部分cDNA序列(contig698)的基礎(chǔ)上, 進(jìn)一步通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和cDNA 末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù),克隆得到了三疣梭子蟹RXR2基因cDNA全長, 并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析, 進(jìn)一步通過熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)研究了該基因在三疣梭子蟹不同組織及不同蛻皮階段的表達(dá)情況, 結(jié)果可以為深入研究三疣梭子蟹RXR的基因功能和闡明蟹類蛻皮的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)資料, 同時豐富甲殼動物發(fā)育生物學(xué)的研究內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料與采樣

三疣梭子蟹幼蟹于2011年8月購自浙江舟山宏福水產(chǎn)養(yǎng)殖場, 甲殼寬為7—9cm, 初始體重50—80g,挑選肢體健全、活力較好、處于蛻皮間期的雌體60只, 活體運(yùn)輸?shù)窖芯渴? 在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)一周, 暫養(yǎng)水族箱體積為150 L(長×寬×高 = 75cm×53cm×47cm), 箱底部放置無毒PVC管(直徑15cm,長15cm)作為隱蔽物, 每箱放8—10只幼蟹, 暫養(yǎng)期間每日下午19:00按照蟹體重的5%—10%投喂章魚,次日上午10:00清理殘餌和糞便。

實(shí)驗(yàn)用蟹暫養(yǎng)一周后, 挑選32只肢體健全、活力較好、處于蛻皮間期(C期)或蛻皮前期(D期)的個體用于實(shí)驗(yàn)。由于三疣梭子蟹極易自相殘殺導(dǎo)致成活率偏低, 因此正式實(shí)驗(yàn)期間每只幼蟹均單獨(dú)飼養(yǎng)于小型循環(huán)水族箱(水體體積40L, 長×寬×高 = 53cm×18cm×45cm)中。實(shí)驗(yàn)期間自然光照, 水體鹽度為24,水溫24—26°C, pH 7.0—9.0, 溶氧＞5mg/L; 氨氮＜0.5mg/L,亞硝酸鹽＜0.15mg/L。投喂和日常管理與暫養(yǎng)期間基本一致。根據(jù)沈潔等(2011)形態(tài)學(xué)方法將三疣梭子蟹蛻皮周期分為蛻皮期(E期)、蛻皮后期(AB期), 蛻皮間期(C期)和蛻皮前期(D期), 每日檢查每只蟹所處的蛻皮階段, 并記錄。對到達(dá)特定蛻皮時期的三疣梭子蟹進(jìn)行解剖, 采集該蛻皮時期三疣梭子蟹肌肉、肝胰腺、心臟、胃、腸、鰓、Y器官、大顎器、眼柄、胸神經(jīng)節(jié)、三角膜組織用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。每個蛻皮期分別采集5—8只個體, 所有組織樣品液氮速凍后保存于–80°C冰箱用于總RNA的提取。由于D期可以分為D0、D1、D2、D3和D4五個不同的亞期(沈潔等,2011), 考慮到D期每個亞期持續(xù)時間較短, 本實(shí)驗(yàn)中D期樣品均來自較為典型的D2亞期。

1.2 RNA提取和cDNA全長的克隆

取凍存的三疣梭子蟹Y器官, 采用總RNA提取試劑盒(TaKaRa, Cat.D9108A)進(jìn)行總RNA的提取, 分別采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)法檢測RNA的完整性和純度。使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Cat.634923)進(jìn)行第一鏈cDNA合成。各取1μg總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板, 分別用于5’和3’端RACE擴(kuò)增。進(jìn)而采用 Advantage 2 PCR Kit (Clontech, Cat.639207)進(jìn)行RACE擴(kuò)增, 所用引物根據(jù)三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組文庫(NCBI登陸號:SRA051608)篩選到RXR基因核心序列(序列拼接號:contig698)設(shè)計(jì)而成, 5’-RACE和3’-RACE引物分別命名為PtRXR5-R1、PtRXR5-R2、PtRXR3-F1和PtRXR3-F2, 具體序列見表1。

所得PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后采用DNA回收試劑盒(TaKaRa, Cat.9763)進(jìn)行回收純化, 取1μL回收產(chǎn)物與pMD19-T載體(TaKaRa, Cat.D104A)連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞(天根,Cat.CB104-01)中, 在37°C、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)1—2h, 涂布接種后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選, 隨機(jī)挑選10個陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

表1 實(shí)驗(yàn)用PCR引物及序列Tab.1 Primers and their sequences used in the experiment

1.3 序列分析

利用DNAStar軟件中的SeqMan程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行載體序列的去除和目的序列的拼接, 獲得PtRXR全長cDNA; 采用Blast程序分析PtRXR基因與其它動物RXR基因的同源性和一致性; 采用ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預(yù)測其開放閱讀框(ORF)和編碼氨基酸。使用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測PtRXR編碼氨基酸的物理參數(shù), 分別用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM 2.0程序(http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測其信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。最后采用ClustalX(http://www.clustal.org/)和MEGA 5.0軟件(http://www.Megaso ftware.net/)進(jìn)行多序列比對和NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)

采用總RNA提取試劑盒(TaKaRa, Cat.D9108A)對各采樣組織進(jìn)行總RNA的提取, 各取100ng總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板, 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,Cat.D2639A)進(jìn)行第一鏈cDNA合成。根據(jù)三疣梭子蟹RXR cDNA全長序列, 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量PCR用特異性引物PtRXR F1/R1及PtRXR F2/R2(表1)。以三疣梭子蟹18S-F/R(表1)為引物對內(nèi)參基因18S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增(Yanget al, 2005)。

按照TaKaRa定量PCR試劑盒(TaKaRa, Cat.DRR 420A)說明, 將模板cDNA梯度稀釋后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增。當(dāng)無非特異性擴(kuò)增出現(xiàn), 目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率在95%—105%, 標(biāo)準(zhǔn)曲線R2大于0.99時,確定qRT-PCR反應(yīng)體系與條件, 最終采用PtRXR F1/R1作為RXR定量PCR擴(kuò)增引物。qRT-PCR的反應(yīng)體系見表2, 反應(yīng)條件為: 95°C預(yù)變性30s; 95°C變性3s, 60°C退火30s, 共進(jìn)行40個循環(huán)。qRT-PCR反應(yīng)體系與條件確定后, 以C期三疣梭子蟹肌肉、肝胰腺、心臟、胃、腸、鰓、Y器官、大顎器、眼柄、胸神經(jīng)節(jié)和三角膜11種組織樣品的cDNA作為模板,研究PtRXR在各組織中表達(dá)情況。根據(jù)PtRXR在各組織中的表達(dá)情況, 對Y器官、大顎器、眼柄、胸神經(jīng)節(jié)、肝胰腺、鰓和肌肉中不同蛻皮階段PtRXR基因的表達(dá)變化進(jìn)行研究。每個樣品重復(fù)4次, 每個蛻皮階段重復(fù)5個體。

表2 PtRXR與18S rRNA基因熒光定量PCR反應(yīng)體系中各試劑添加量(μL)Tab.2 The volume (μL) of each reagent added to the PCR mixture used for qRT-PCR of PtRXR and 18S rRNA

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用18S rRNA作為內(nèi)參基因, 計(jì)算△Ct, 通過公式△△Ct =△Ct樣品－△Ct對照計(jì)算△△Ct, 2–ΔΔCt法計(jì)算PtRXR-mRNA的相對表達(dá)水平。采用SPSS 17.0軟件對qRT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用Levene’s法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn), 當(dāng)不滿足齊性方差時對數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或平方根處理, 采用ANOVA對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析, 采用Tukey’s法進(jìn)行多重比較, 當(dāng)P＜0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 PtRXR cDNA全長克隆與序列分析

根據(jù)三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組文庫(NCBI登陸號: SRA 051608)中RXR的cDNA片段(序列拼接號: contig698),設(shè)計(jì)多條特異性引物進(jìn)行RACE擴(kuò)增, 直到3’和5’端分別出現(xiàn)poly A和起始密碼子及非編碼區(qū), 將所得序列進(jìn)行拼接和驗(yàn)證, 確定本研究中三疣梭子蟹RXR基因cDNA序列全長為1718bp, 命名為PtRXR2,GenBank登錄序列號為KF914662。序列分析結(jié)果表明, 該基因包括5’非編碼區(qū)(5’-UTR)141bp、3’-UTR 209bp和開放閱讀框(ORF)1368bp, 編碼455個氨基酸。ORF編碼氨基酸的預(yù)測分子式為C2176H3479N605O671S28,分子量為49.75kDa, 理論等點(diǎn)6.79。進(jìn)一步分析表明該蛋白不存在信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū), 因此推測該蛋白不屬于分泌蛋白。整體上, PtRXR2和NCBI上已經(jīng)登錄的PtRXR(AGV08303)存在較大差異, 兩者不僅5’-UTR的長度不同, 且PtRXR在ORF中存在168bp和60bp的核苷酸缺失, 其它多處存在共15個核苷酸的序列差異。

PtRXR2的氨基酸序列從N端到C端具有4個典型功能結(jié)構(gòu)域: A/B域(轉(zhuǎn)錄激活域)、C域(DNA結(jié)合域, DBD)、D域(鉸鏈域)、E/F域(含有配體結(jié)合域,LBD)。C域具有P-box和D-box, D域中存在T-box (圖1)。不同甲殼動物RXR的氨基酸比對結(jié)果表明, 三疣梭子蟹PtRXR2、招潮蟹(Uca pugilator)UpRXR、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)LvRXR和美洲鰲蝦(Homarus americanus)HaRXR1 在氨基端(25個氨基酸)序列相對保守, 而這些氨基酸序列在PtRXR、HaRXR2、黑背陸地蟹(Gecarcinus lateralis)GlRXRa、褐蝦(Crangon crangon) CcRXR1和中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)EsRXRb的A/B域中缺失(圖2中實(shí)線方框標(biāo)出); 5種蝦蟹類RXR的C域高度保守, 均含有保守的P-box與D-box, DBD中含有兩個C2C2型鋅指結(jié)構(gòu)和兩個α螺旋; D域具有保守的T-box, 但PtRXR2、PtRXR、UpRXR、LvRXR和HaRXR1等的T-box中存在六個氨基酸殘基缺失(圖2中實(shí)線方框標(biāo)出); E/F域的E區(qū)較為保守, 5種蝦蟹類在該區(qū)均含有氨基酸序列完全一致的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AF-2); F區(qū)較短且保守性最低, 但PtRXR和PtRXR2的F區(qū)推斷氨基酸序列完全一致(圖2)。

圖1 PtRXR2基因cDNA全長及預(yù)測的氨基酸序列Fig.1 Full cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of PtRXR2

整體上, PtRXR2和PtRXR一致性最高, 兩者差異主要在于PtRXR的A/B域中存在兩段氨基酸序列的缺失(圖2中上劃線標(biāo)示), 對應(yīng)于PtRXR ORF中缺失的核苷酸序列; PtRXR2與藍(lán)蟹(Callinectes sapidus)兩種RXR亞型的一致性最高, 分別為99%和98%; 與濱蟹(Carcinus maenas)RXRⅠ序列的一致性為97%;與黑背地蟹三種RXR亞型的一致性分別為87%、86%和86%; PtRXR2與蝦類RXR的氨基酸序列比對結(jié)果顯示, PtRXR2與褐蝦RXR 三種亞型的氨基酸序列一致性較高, 在84%—85%之間; 與凡納濱對蝦、中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)和日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)RXR氨基酸序列一致性相對較低, 分別為76%、75%和74%。

圖2 三疣梭子蟹與其它甲殼動物的RXR氨基酸序列比對Fig.2 Comparison of amino acid sequences of RXR between P. trituberculatus and other crustacean species

基于20種節(jié)肢動物(甲殼動物和昆蟲)的RXR/USP氨基酸序列, 采用MEGA(version 5.0)軟件鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果顯示昆蟲綱中國蜜蜂(Apis cerana)、沙蟋(Gryllus firmus)和太平洋折翅蠊(Diploptera punctata)聚為一支, 它們與甲殼動物親緣關(guān)系更近, 與甲殼動物RXR聚為一大支,其余聚為另外一支。甲殼動物中蝦蟹類的RXR, 在進(jìn)化上更為接近, 飛馬哲水蚤(Calanus finmarchicus)在甲殼綱為獨(dú)立一支。三疣梭子蟹、普通濱蟹與濱蟹的RXR親緣關(guān)系最近, 它們聚為一支(圖3)。

圖3 RXR氨基酸序列的NJ進(jìn)化樹Fig.3 The neighbor-joining phylogenetic tree for RXRs

2.2 PtRXR2在蛻皮間期不同組織中的表達(dá)情況

定量PCR結(jié)果表明, PtRXR2在三疣梭子蟹C期的肌肉、肝胰腺、心臟、胃、腸、鰓、Y器官、大顎器、眼柄、胸神經(jīng)節(jié)和三角膜中均有表達(dá), 且各組織中的PtRXR2-mRNA表達(dá)水平差異顯著(P＜0.05, 圖4)。Y器官中的PtRXR2-mRNA表達(dá)水平最高, 其余依次為鰓＞大顎器＞眼柄＞三角膜＞胃＞胸神經(jīng)節(jié)＞心臟＞腸＞肌肉＞肝胰腺, 其中肝胰腺中的PtRXR2-mRNA表達(dá)水平僅為Y器官的10.92%。

2.3 PtRXR2在不同蛻皮階段的表達(dá)情況

根據(jù)PtRXR2在不同組織中的表達(dá)情況, 采用Y器官、眼柄、胸神經(jīng)節(jié)、大顎器、肌肉、肝胰腺和鰓7個主要組織, 研究PtRXR2-mRNA在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明, PtRXR2-mRNA在7種組織中的表達(dá)水平均在不同蛻皮階段變化顯著(P＜0.05), 但不同組織呈現(xiàn)不同的變化模式(圖5)。Y器官中PtRXR2-mRNA的表達(dá)水平在E期最低, 蛻皮后AB期顯著升高, 其相對表達(dá)量是C期的5倍以上, C期和D期的表達(dá)水平顯著下降, 但仍顯著高于E期; 在整個蛻皮周期中, 眼柄、胸神經(jīng)節(jié)和肝胰腺中PtRXR2-mRNA表達(dá)變化模式基本一致, 為E期表達(dá)量較低, AB期顯著升高, C期顯著降低, D期顯著升高; 與上述三個組織的PtRXR2-mRNA變化趨勢相反,大顎器中PtRXR2-mRNA在AB期的表達(dá)水平最低,其余三個階段相對表達(dá)量無顯著差異; 鰓中PtRXR2-mRNA在C期表達(dá)量最高, D期最低, E期和AB期表達(dá)量處于兩者之間, 且各期間的相對表達(dá)量差異顯著(P＜0.05); 在整個蛻皮周期中, 肌肉中PtRXR2-mRNA表達(dá)水平相對較低, 各期相對表達(dá)量依次為AB期＞C期＞E期＞D期(圖5)。

圖4 蛻皮間期三疣梭子蟹各組織中PtRXR2-mRNA的表達(dá)差異分析Fig.4 Analysis of expression difference of PtRXR2-mRNA in various tissues of P. trituberculatus at intermolt stage

圖5 不同蛻皮階段三疣梭子蟹七種組織中的PtRXR2-mRNA表達(dá)差異分析Fig.5 Analysis of expression difference of PtRXR2-mRNA in seven tissues of P. trituberculatus at different molting stages

3 討論

3.1 PtRXR2序列結(jié)構(gòu)分析

本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序和RACE技術(shù), 獲得PtRXR2基因的cDNA全長序列, 該基因與NCBI已登錄的PtRXR基因在5’-非編碼區(qū)和ORF中存在多處核苷酸和預(yù)測氨基酸序列差異, 且PtRXR在A/B域存在兩段氨基酸序列的缺失, 長度分別為56和20個氨基酸(圖2中上劃線標(biāo)示), 對應(yīng)于PtRXR ORF序列中缺失的長度分別為168bp、60bp的兩段核苷酸序列。因此, 初步推斷PtRXR2和PtRXR為三疣梭子蟹RXR的兩個不同基因, 而非選擇性剪切造成的不同轉(zhuǎn)錄本或亞型, 將此基因暫命名為PtRXR2。整體上,不同甲殼動物的RXR較為保守, 已知蝦蟹類的RXR與PtRXR2氨基酸序列一致性高達(dá)70%以上, 特別是C、D功能結(jié)構(gòu)域和E區(qū)保守性較高。常見甲殼動物RXR的C域均含有高度保守的P-box和D-box典型結(jié)構(gòu), 其中P-box與RXR作用元件的DNA結(jié)合有關(guān),D-box與同型二聚體的形成有關(guān), 從而保證RXR作用元件及二聚體的形成和調(diào)控作用的發(fā)揮(Devarakondaet al, 2003; Asazumaet al, 2007); D域也存在DNA識別的T-box(Kimet al, 2005; Priyaet al, 2009), 但是部分種類的RXR或不同轉(zhuǎn)錄本存在6個氨基酸缺失,有趣的是在T-box中存在這6個氨基酸的物種在A/B域N端都存在25個氨基酸殘基缺失, 造成這種差異的原因可能與進(jìn)化或RNA的選擇性剪切有關(guān)(王文青等, 2010); E/F域含有保守的配體結(jié)合域(LBD), 所有物種均具有一個保守的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AF-2, 見圖2)(Wanget al, 2000)。然而, 不同蝦蟹類RXR的A/B域和E/F域的F區(qū)通常存在一定的差異。A/B域?yàn)檗D(zhuǎn)錄激活域, 不同物種的RXR在該序列上差異較大,同一物種的不同RXR亞型也有所不同(Huet al, 2003;Kimet al, 2005; Techaet al, 2013), 這暗示不同RXR基因及同一RXR基因的不同亞型生理作用可能有所不同, 這種功能差別可能是通過不同信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控實(shí)現(xiàn)的(王文青等, 2010; Dawsonet al, 2012)。盡管RXR的F區(qū)較短, 但不同物種間F區(qū)的差別較大, 其氨基酸序列存在較大變化或缺失, 同一物種的不同RXR基因F區(qū)氨基酸序列及長度基本一致(圖2),但是同一RXR基因亞型可能會通過選擇性剪切形成不同的轉(zhuǎn)錄本, 造成F區(qū)氨基酸長度不同甚至缺失(Kimet al, 2005; Techaet al, 2013)。迄今為止, 有關(guān)RXR的F區(qū)生物學(xué)功能研究極少, 推測認(rèn)為該區(qū)域可以調(diào)節(jié)配體與LBD的結(jié)合力、二聚體的形成及參與調(diào)節(jié)其它調(diào)控因子間的交互作用(Wuet al, 2004),如在哺乳動物中, F區(qū)的部分氨基酸序列與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)(Dawsonet al, 2012)。

3.2 PtRXR2的生理功能及其與蛻皮的關(guān)系

絕大部分動物體內(nèi)都存在RXR/USP(昆蟲中的超氣門蛋白, 類似于甲殼動物的RXR)基因, 該基因家族在細(xì)胞動物生長發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增殖分化、新陳代謝和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡穩(wěn)定等過程中起著非常重要的調(diào)控作用(Mangelsdorfet al, 1990; Kimet al,2005; Dawsonet al, 2012)。有關(guān)大鼠的研究結(jié)果表明,鼠類存在三種不同的RXR基因, 分別命名為RXRα、RXRβ和RXRγ, 這三種RXR蛋白的DBD和LBD極為保守, 但其A/B域的氨基酸序列差異較大, 推測它們可能參與了不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程, 起著不同的生理作用(Mangelsdorfet al, 1992)。進(jìn)一步的研究表明,RXRα在肝臟等代謝器官中表達(dá)水平較高, 主要參與脂類和維生素A的代謝調(diào)控, 這是因?yàn)镽XRα的DNA反應(yīng)元件是細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBPII)和載脂蛋白(apoAI)基因啟動子的一部分, 而CRBPII和apoAI主要參與維生素A和脂類的運(yùn)輸和代謝; RXR β與老鼠的神經(jīng)鞘質(zhì)損傷和睪丸生理功能有關(guān), 但該基因的表達(dá)部位較多(Huanget al, 2011); RXRγ主要在神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉和上皮組織中表達(dá), 主要調(diào)控細(xì)胞的增殖分化和神經(jīng)信號傳導(dǎo)等(K?niget al, 2012)。

迄今為止, 有關(guān)甲殼動物的RXR基因功能研究較少?，F(xiàn)有研究表明, 甲殼動物的RXR基因與蛻皮調(diào)控有關(guān), 如中國明對蝦和中華絨螯蟹Y器官中的RXR-mRNA在蛻皮后表達(dá)水平逐步升高, 在蛻皮前達(dá)到最大值(Priyaet al, 2009; 王瑤等, 2013)。而甲殼動物和昆蟲體內(nèi)的RXR/USP具體如何參與蛻皮調(diào)控則非常復(fù)雜, 如: 對中國明對蝦中RXR的RNAi實(shí)驗(yàn)表明, RXR正向調(diào)控中國明對蝦幾丁質(zhì)酶的基因表達(dá)(Priyaet al, 2009)。甲殼動物蛻皮前通常需要高含量的幾丁質(zhì)酶水解舊殼中的甲殼素以便舊殼裂開, 從而有利于蛻皮的進(jìn)行(沈潔等, 2011); 昆蟲體內(nèi)20-羥基蛻皮酮(20-E)-EcR-USP復(fù)合體可以調(diào)控Br-C、E74、E75和E93等20-E初級應(yīng)答基因的表達(dá), 這些基因觸發(fā)次級應(yīng)答基因表達(dá)后最終會引起昆蟲變態(tài)和蛻皮過程中的細(xì)胞自噬和凋亡(Liuet al, 2009; 李康等,2011)。值得注意的是, 同一甲殼動物的一種RXR基因可以通過選擇性剪切得到不同的轉(zhuǎn)錄本及蛋白,從而發(fā)揮不同的調(diào)控作用(Kimet al, 2005; Techaet al,2013)。

本研究結(jié)果表明, PtRXR2在三疣梭子蟹蛻皮間期的11個組織中都有表達(dá), 且在內(nèi)分泌器官(Y器官和大顎器)、神經(jīng)系統(tǒng)(眼柄和胸神經(jīng))、上皮組織發(fā)達(dá)的三角膜、腸道和胃, 以及肌肉組織中表達(dá)水平相對較高, 在肝胰腺中的表達(dá)水平最低(圖4), 這與哺乳動物的RXRγ在不同組織中的表達(dá)特性基本一致(Mangelsdorfet al, 1992; Huanget al, 2011)。此外, 根據(jù)PtRXR2與哺乳動物的RXR氨基酸序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn), PtRXR2也是與RXRγ一致性最高。因此, 作者推測PtRXR2可能類似于哺乳動物RXRγ型。先前研究表明, 甲殼動物的RXR均在Y器官中表達(dá)水平較高, 這是因?yàn)閅器官主要分泌蛻皮酮調(diào)節(jié)蛻皮過程。就不同甲殼動物種類而言, RXR在其它器官中的表達(dá)水平不盡一致。RXR在中華絨螯蟹、日本囊對蝦和中國明對蝦的肝胰腺中表達(dá)水平僅次于Y器官(Asazumaet al, 2007; Priyaet al, 2009; 王瑤等, 2013),但本研究PtRXR2在肝胰腺中的表達(dá)水平最低。造成這種差異的原因可能是由于不同蝦蟹中發(fā)現(xiàn)的RXR基因種類或轉(zhuǎn)錄本有所不同, 它們具有不同的生理功能, 因而在不同組織中的表達(dá)模式存在差異。如RXRα主要調(diào)節(jié)哺乳動物的脂類和維生素A代謝,因此在肝胰腺等代謝器官中表達(dá)水平較高, 而RXRγ則調(diào)控細(xì)胞的增殖分化和神經(jīng)信號傳導(dǎo)等, 故在神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉和上皮組織中表達(dá)較高(Mangelsdorfet al, 1992; K?niget al, 2012)。本研究結(jié)果表明, PtRXR2在三疣梭子蟹的Y器官、眼柄和胸神經(jīng)節(jié)中均是AB期表達(dá)水平最高, 但是蛻皮過程中的E期最低, 這可能是因?yàn)樯鲜鰞?nèi)分泌器官和神經(jīng)組織的細(xì)胞增殖主要發(fā)生在AB期(Changet al, 2011), 而PtRXR2可能在此階段參與這些細(xì)胞增殖過程; 肌肉中的PtRXR2表達(dá)水平在AB期和C期較高, E期和D期最低, 與肌肉的生長和營養(yǎng)物質(zhì)積累主要發(fā)生這兩個階段相對應(yīng)(沈潔等, 2011); 肝胰腺中的PtRXR2在AB期最高, 暗示肝胰腺中的上皮細(xì)胞增殖和分化主要發(fā)生在此階段, 肝胰腺中C期表達(dá)水平最低, 也暗示PtRXR2主要作用不是參與肝胰腺中的脂類營養(yǎng)代謝過程; 而蛻皮周期中, PtRXR2-mRNA在鰓和大顎器中的變化原因不詳。盡管本研究克隆了PtRXR2的cDNA全長, 根據(jù)其生物學(xué)信息學(xué)分析及其在蛻皮過程中表達(dá)分析結(jié)果, 推測該基因可能類似于哺乳動物的RXRγ型, 但由于缺乏相關(guān)的功能驗(yàn)證, 故PtRXR2在三疣梭子蟹蛻皮過程中的準(zhǔn)確生理功能、調(diào)控機(jī)制及其基因分類有待進(jìn)一步深入研究。

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