陳永偉 欒 鑫 段繼周 池振明

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 青島 266003; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 青島 266071)

316L不銹鋼具有較強(qiáng)的耐腐蝕性和良好的機(jī)械加工性, 常應(yīng)用于海洋設(shè)施中的關(guān)鍵部件。在天然海水環(huán)境中, 不銹鋼表面會(huì)形成一層由微生物及其代謝產(chǎn)物所組成的生物膜, 該生物膜可能包含多種腐蝕微生物, 如鐵氧化菌, 硫酸鹽還原菌和錳氧化菌等(Newmanet al, 1986; Xuet al, 2008), 從而會(huì)對(duì)不銹鋼產(chǎn)生微生物腐蝕, 導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Beechet al,1999)。

已有許多研究發(fā)現(xiàn), 316L不銹鋼在淡水和天然海水中都有開(kāi)路電位變正現(xiàn)象, 即開(kāi)路電位正向移動(dòng)現(xiàn)象(Motodaet al, 1990; Dickinsonet al, 1996), 但是在滅菌海水以及某些單一菌株或混合菌株菌液中卻出現(xiàn)開(kāi)路電位負(fù)向移動(dòng)的現(xiàn)象(Xuet al, 2007,2008)。目前比較普遍的觀點(diǎn)是, 上述開(kāi)路電位變正現(xiàn)象是由微生物在不銹鋼表面的生長(zhǎng)繁殖造成的, 但具體是哪種微生物, 其機(jī)理是什么尚不清楚。因此,研究天然海水中的316L不銹鋼表面的微生物菌落結(jié)構(gòu)具有重要意義, 可為進(jìn)一步研究微生物腐蝕機(jī)理和尋找腐蝕微生物提供參考依據(jù)。

有研究表明, 在一般情況下, 生物膜的形成與發(fā)展會(huì)在14—20天內(nèi)達(dá)到成熟階段(黃宗國(guó), 2008)。Jones等(2007)對(duì)暴露于天然海水中的316L不銹鋼表面所形成生物膜的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究, 表明主要的細(xì)菌群體在2—20天內(nèi)的相對(duì)豐度基本沒(méi)有發(fā)生變化。有關(guān)學(xué)者對(duì)飲用水系統(tǒng)中不銹鋼表面生物膜進(jìn)行了研究, 結(jié)果表明, 不銹鋼表面細(xì)菌種類明顯多于PVC材料, 不銹鋼的腐蝕導(dǎo)致不銹鋼表面粗糙度增加, 有利于生物膜的再生。因此, 他們認(rèn)為導(dǎo)致這種現(xiàn)象發(fā)生的原因之一是不銹鋼腐蝕造成的(Linet al, 2013)。然而, 國(guó)內(nèi)缺乏對(duì)海水中316L不銹鋼表面生物膜的細(xì)菌多樣性方面的研究。為了了解青島近海316L不銹鋼表面微生物膜的細(xì)菌群落組成, 本實(shí)驗(yàn)選擇夏季在青島海域?qū)嵑Ｈ?16L不銹鋼來(lái)分析研究其表面生物膜中細(xì)菌的多樣性。

1 材料與方法

1.1 掛片與取樣

本實(shí)驗(yàn)所選用的316L不銹鋼材料購(gòu)自山東信陽(yáng)晟鑫科技有限公司。按照國(guó)標(biāo)《金屬材料在表面海水中常規(guī)暴露腐蝕試驗(yàn)方法》(GB5776-1986)進(jìn)行處理,然后用SiC水磨砂紙將試樣逐級(jí)打磨至2000#, 放入無(wú)水乙醇中超聲清洗10 min, 最后放入干燥器內(nèi), 備用。處理好的試樣在青島中港實(shí)驗(yàn)站(119°58’E,35°52’N)開(kāi)展實(shí)海全浸掛片實(shí)驗(yàn)。取樣時(shí)將不銹鋼片放入滅過(guò)菌的50mL離心管中, 然后放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室, –20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生物膜表面觀察與分析

1.2.1 掃面電子顯微鏡觀察(SEM) 為了觀察不銹鋼表面附著微生物隨時(shí)間的變化規(guī)律, 分別在第1、3、5、7、10和15天取回不銹鋼片, 先用滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗不銹鋼表面, 然后試片用5%戊二醛(用滅菌PBS稀釋)固定2h。后用50%、75%、90%和100%的乙醇梯度脫水各 30min, 真空臨界點(diǎn)干燥, 噴金后進(jìn)行掃描電鏡觀察(KYKY-2800掃描電子顯微鏡, 北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司)。

為了觀察不銹鋼全浸15天以后的腐蝕形貌變化,分別用掃描電鏡觀察不銹鋼片第0天的初始形貌和15天后去除表面腐蝕產(chǎn)物后的表面形貌。

1.2.2 X射線能譜分析(EDS) 對(duì)SEM觀察后的第15天的不銹鋼片不做任何處理, 直接進(jìn)行EDS分析, 來(lái)研究不銹鋼表面組成元素的變化。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察 用4’,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)溶液對(duì)全浸15天的不銹鋼進(jìn)行染色以觀察其表面細(xì)菌附著情況。DAPI是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料, 其穿過(guò)生物膜后與雙鏈DNA結(jié)合, 在紫外線(365nm)照射下會(huì)顯示藍(lán)色熒光。將15天取回的不銹鋼片先用滅菌PBS溶液沖洗掉其表面, 后用0.01mg/mL的DAPI染色30min, 然后熒光觀察其表面附著微生物的數(shù)量。

1.3 PCR-RFLP技術(shù)表面附著微生物多樣性分析

1.3.1 總DNA的提取以及16S rRNA基因的擴(kuò)增利用Power Soil DNA Isolation Kit (Mobio, USA)試劑盒來(lái)提取不銹鋼表面微生物的總DNA, 從–20°C冰箱中取出全浸15天的不銹鋼片,用數(shù)片滅菌紗布擦拭其表面后, 將擦拭后的紗布放入試劑盒中的Power Bread Tubes中, 然后按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA提取。以總DNA為模板, 采用細(xì)菌16S rRNA基因保守引物Bac8F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和Bac1492R:5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50μL反應(yīng)體系為: DNA模板2μL, 正反引物(2mmol/L)各5μL, 10×Buffer 5μL, dNTP (2.5mmol/L) 4μL, dH2O補(bǔ)充至50μL。反應(yīng)條件為: 94°C預(yù)變性5 min; 94°C變性30s, 55°C退火30 s, 72°C延伸90 s, 進(jìn)行30個(gè)循環(huán); 最后72°C延伸10 min。

1.3.2 16S rRNA基因文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(華舜W5211, 上海)純化回收PCR產(chǎn)物, 將純化的16S rRNA基因連接到載體pMD19-T(Takara, 大連)上, 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E. coliDH5α中,涂布在含有x-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上, 于37°C培養(yǎng)約12h, 選擇具有氨芐抗性的白色轉(zhuǎn)化子96株進(jìn)行劃線培養(yǎng)。然后用水煮法快速提取細(xì)胞中的基因組DNA, 采用T載體通用引物RV-M:5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′和M13-D:5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACG-3′ (Danget al,2008)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。再先后用MspI (NEB R0106, 北京)與HhaI (NEB R0139, 北京)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。根據(jù)酶切所得的RFLP帶型對(duì)克隆子進(jìn)行初步劃分, 相同帶型歸為同一個(gè)RFLP帶型, 每個(gè)帶型挑選出一株代表性菌株送測(cè)序(上海鼎安生物技術(shù)有限公司)。

1.3.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 測(cè)得的序列用DOTUR軟件進(jìn)行處理, 相似性在97%以上的被歸為同一個(gè)操作分類單元(OTU)。將所得結(jié)果分別與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 確定最相似的核酸序列,用Clustal X軟件比齊, 然后用MEGA4.0程序通過(guò)鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以覆蓋率C來(lái)評(píng)價(jià)所構(gòu)建的16S rRNA基因文庫(kù)對(duì)環(huán)境微生物多樣性的體現(xiàn), 公式為:C=[1–(n/N)]×100%, 其中n指文庫(kù)中只包含一個(gè)克隆的OTU 數(shù),N指文庫(kù)的克隆總數(shù)。并計(jì)算其香濃-威納(Shannon-Wiener)指數(shù)(H)、辛普森(Simpson)指數(shù)(D)和均勻度(J)等多樣性指數(shù)(欒鑫等, 2013)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不銹鋼表面觀察分析結(jié)果

2.1.1 掃描電鏡觀察 經(jīng)過(guò)掃面電鏡的觀察, 得到全浸海水1、3、5、7、10、15天的SEM照片(圖1), 結(jié)果顯示: 不銹鋼片在海水中浸泡1天后就發(fā)現(xiàn)其表面出現(xiàn)細(xì)菌附著及圓形附著物形成; 在第3天表面的微生物明顯增多, 且有細(xì)菌胞外絮狀物形成; 在第5天附著的微生物和絮狀物繼續(xù)增多, 但第7天和第5天比較變化不太明顯; 到了第15天絮狀物厚度進(jìn)一步增加, 形成比較明顯的微生物群落。

圖1 實(shí)海全浸1、3、5、7、10、15天的不銹鋼掛片SEM觀察結(jié)果(放大2500倍)Fig.1 SEM image of the surface of 316L stainless steel immersed in the seawater for 1d, 3d, 5d, 7d, 10d, and 15d

2.1.2 熒光顯微鏡分析結(jié)果 為了觀察實(shí)海全浸15天的316L不銹鋼表面微生物附著情況, 對(duì)其進(jìn)行了熒光顯微鏡觀察, 結(jié)果如圖2所示。在不銹鋼表面發(fā)現(xiàn)有大量的藍(lán)點(diǎn)(圖2a), 部分位置藍(lán)點(diǎn)極度聚集形成一片藍(lán)色光區(qū)(圖2b)。微生物已在不銹鋼表面形成較均勻的微生物膜。

圖2 實(shí)海全浸15天的不銹鋼鋼片表面附著微生物的熒光照片F(xiàn)ig.2 Fluorescence image of 316L stainless steel immersed in the sea for 15 days

2.1.3 X射線能譜分析結(jié)果 為了進(jìn)一步分析不銹鋼表面形成的生物膜, 分別對(duì)全浸海水之前和全浸海水之后的316L不銹鋼片進(jìn)行了X射線能譜分析(EDS), 結(jié)果如圖3所示。將全浸海水前、后EDS結(jié)果進(jìn)行對(duì)比, 結(jié)果如表1所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 構(gòu)成生物體的基本元素C、O元素含量明顯增高, 并且發(fā)現(xiàn)了不銹鋼中不存在的P元素。另外, 在生物膜中未發(fā)現(xiàn)不銹鋼中存在的Mn元素和Mo元素。

圖3 全浸海水前后的316L不銹鋼的局部能譜分析圖譜Fig.3 EDS graph of local area of 316L stainless steel before and after seawater immersion

2.2 細(xì)菌多樣性分析結(jié)果

從篩選的96個(gè)克隆子中獲得的RFLP帶型為47個(gè), 經(jīng)測(cè)序所得序列經(jīng)3% cut off 后得到的OTU數(shù)為24, 其樣品覆蓋率C為88.2%, 香濃-威納指數(shù)H為3.81, 辛普森指數(shù)D為0.90, 均勻度J為0.83, 三個(gè)多樣性指數(shù)都比較高, 說(shuō)明不銹鋼表面具有豐富的細(xì)菌多樣性。進(jìn)一步分析細(xì)菌16S rRNA基因文庫(kù)的Rarefaction稀釋度曲線(圖4)也表明當(dāng)克隆數(shù)在漸近于93時(shí), 稀釋度曲線逐漸接近平臺(tái)期, 說(shuō)明本研究建立的16S rRNA基因文庫(kù)基本能夠反映全浸不銹鋼中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

表1 316L不銹鋼基體與表面生物膜成分EDS分析結(jié)果Tab.1 Result of EDS analysis of 316L stainless steel with biofilm

圖4 細(xì)菌16S rRNA克隆文庫(kù)稀釋度曲線分析Fig.4 Rarefaction curves of the bacteria 16S rRNA clones libraries

各門克隆數(shù)占總克隆數(shù)的比例, 如圖5所示。在不銹鋼表面占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的是α-變形菌, 占到總克隆數(shù)的72.3%, 其中占據(jù)到絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的單株菌是序列HSY.CS.25所代表的紅細(xì)菌科的一種暫時(shí)不可分離菌, 占到整個(gè)基因文庫(kù)的20.4%。同時(shí)在不銹鋼表面還有2.1%的γ-變形菌, 18.1%的ε-變形菌以及7.4%的擬桿菌。在整個(gè)文庫(kù)中所占比例超過(guò)10%的菌種還包括:Thalassobacter、Loktanellamaricol以及序列HSY.CS.1和38所代表的暫時(shí)不可分離菌, 其中前三者所占比例為10.8%, HSY.CS.38所占比例為14.0%。根據(jù)所得的24個(gè)OTU, 構(gòu)建不銹鋼表面附著微生物的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖6)。分析發(fā)現(xiàn)α-變形菌(Alphaproteobacteria)占到18個(gè)OTU數(shù), γ-變形菌(Gammaproteobacteria)占到了1個(gè), 擬桿菌門(Bacteroidetes)占到了2個(gè), ε-變形菌(Epsilonproteobacteria)占3個(gè)。

圖5 316L不銹鋼表面附著微生物中各分支菌占總菌數(shù)的比例Fig.5 Composition of clone library of the 316L stainless steel

經(jīng)過(guò)比對(duì), α-變形菌中已知序列有7個(gè), 分別為Thalassobius gelatinovorus,Pseudoruegeria aquimaris,Thalassobacter,Phaeobacter arcticus,Litoreibacterjanthinus,Loktanella maricola,Hoeflea alexandrii。其中前6者屬于紅桿菌目(Rhodobacterale)且均屬于紅桿菌科(Rhodobacteraceae)。僅有的一種γ-變形菌為Thiomicrospira crunogena。ε-變形菌中已知序列僅一種為Sulfurospirillum arcachonense。擬桿菌已知序列有兩種, 均屬于黃桿菌科(Flavobacteriaceae), 分別為Polaribacter、Dokdonia donghaensis。

3 討論

3.1 不銹鋼表面生物膜的形成

SEM分析結(jié)果表明, 隨著掛片時(shí)間的延長(zhǎng), 全浸于海水中的不銹鋼片表面細(xì)菌數(shù)量逐漸增加, 并且細(xì)菌胞外產(chǎn)物越來(lái)越厚, 與第1天相比, 全浸15天以后, 不銹鋼表面細(xì)菌大量聚集在一起, 并且有大量的細(xì)菌胞外物質(zhì)分布在細(xì)菌聚集區(qū)周圍。另外, 不銹鋼全浸15天以后, 經(jīng)DAPI染色, 在熒光顯微鏡下出現(xiàn)了大量藍(lán)點(diǎn)(圖2a), 說(shuō)明不銹鋼表面有大量細(xì)菌附著, 片狀藍(lán)色區(qū)域(圖2b)的形成, 是由于大量細(xì)菌聚集在一處造成的。EDS分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)成生物體的基本元素C元素和O元素含量明顯增加, 同時(shí)還有不銹鋼基體中不存在的P元素存在, 進(jìn)一步說(shuō)明在不銹鋼表面存在大量微生物及其代謝產(chǎn)物。因此, 經(jīng)過(guò)15天實(shí)海全浸掛片, 316L不銹鋼表面已經(jīng)形成了較為豐富的由微生物及其代謝產(chǎn)物組成的生物膜。另外,根據(jù)不銹鋼SEM照片觀察, 作者發(fā)現(xiàn)在不銹鋼表面存在著不同形狀的細(xì)菌, 因此對(duì)316L不銹鋼表面生物膜進(jìn)行了進(jìn)一步的細(xì)菌多樣性分析。

3.2 細(xì)菌多樣性分析

根據(jù)結(jié)果, 作者發(fā)現(xiàn), 不銹鋼表面具有豐富的細(xì)菌多樣性, 其中α-變形菌門中的紅桿菌目為優(yōu)勢(shì)菌群。Thalassobius gelatinovorus是一種需氧的能動(dòng)棒狀菌,具有氧化酶和過(guò)氧化酶活性(Muramatsuet al, 2007)。Phaeobacter arcticus是生長(zhǎng)在2%—9%濃度NaCl條件下的一種需氧的能動(dòng)桿狀菌, 具有過(guò)氧化氫酶和細(xì)胞色素酶活性(Zhanget al, 2008)。Loktanella maricola是一種附著在不銹鋼表面的需要低濃度NaCl才能生長(zhǎng)的非能動(dòng)桿狀菌(Yoonet al, 2007)。Litoreibacter janthinus和Pseudoruegeria aquimaris都是能在8% NaCl濃度下生長(zhǎng)的異養(yǎng)非能動(dòng)性桿狀需氧菌(Yoonet al, 2007; Lyudmilaet al, 2011)。

圖6 不銹鋼表面細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.6 Phylogenetic tree of the bacteria on surface of the stainless steel

在實(shí)海全浸初期不銹鋼316L表面還附著有一種重要的可以加速腐蝕的細(xì)菌Sulfurospirillum arcachonense, 這是一種微需氧的具有能動(dòng)性的硫酸鹽還原菌, 是一種典型的金屬腐蝕菌, 在無(wú)氧條件下可以利用醋酸鹽生成氫和甲酸, 具有氧化酶, 過(guò)氧化酶和脲酶活性, 可以以元素硫作為電子受體, 生成 H2S(Finsteret al, 1997)。Thiomicrospira是不銹鋼表面存在的一種化能自養(yǎng)細(xì)菌, 它是一種能動(dòng)的桿狀菌, 能降解含硫化合物, 如硫化物、硫代硫酸鹽以及元素硫,作為能量來(lái)源。它可以利用不銹鋼中的硫元素, 加速不銹鋼的腐蝕(Wirsenet al, 1998)。

Dokdoniasp.是廣泛存在于海洋中的一種沒(méi)有能動(dòng)性的微嗜鹽的需氧異養(yǎng)菌, 屬于黃桿菌科, 它會(huì)附著在各種基質(zhì)的表面進(jìn)行生長(zhǎng)(Lauraet al, 2007)。Hoeflea alexandrii也是存在于不銹鋼表面的一種好氧非共生菌, 可以依靠單極鞭毛運(yùn)動(dòng)到達(dá)附著基質(zhì)表面,具有過(guò)氧化酶活性, 不能利用硝酸鹽, 但可以消耗生物膜內(nèi)其他微生物代謝產(chǎn)生的硝酸, 生成吲哚, 可以起到延緩不銹鋼腐蝕的作用(Luc?aet al, 2006)。

通過(guò)對(duì)已知細(xì)菌的分析發(fā)現(xiàn), 不銹鋼表面的細(xì)菌幾乎都是革蘭氏陰性菌, 其中60%以上的細(xì)菌具有能動(dòng)性。作者對(duì)全浸海水15天不銹鋼表面細(xì)菌的種類研究發(fā)現(xiàn), 不銹鋼表面附著有大量的好氧細(xì)菌,其中包括一種抑制腐蝕的Hoeflea alexandrii菌, 這些細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)初步形成了一層生物膜,從而改變了界面的電化學(xué)性質(zhì), 起到抑制腐蝕的作用; 然而隨著生物膜厚度的增加, 氧氣的傳遞受到阻礙, 因此到達(dá)不銹鋼介質(zhì)表面的氧氣減少, 結(jié)果導(dǎo)致了厭氧細(xì)菌, 如Sulfurospirillu marcachonense的出現(xiàn),這些厭氧菌是重要的腐蝕性細(xì)菌, 從而會(huì)加速不銹鋼的腐蝕, 這可能是開(kāi)路電位發(fā)生正移的一個(gè)重要原因。不銹鋼在天然海水中的耐腐蝕性先變大后變小,這與劉彬等(2012)研究結(jié)果相符。

4 結(jié)論

全浸15天的316L不銹鋼表面形成了豐富的由細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物組成的生物膜, 并且根據(jù)SEM照片對(duì)附著細(xì)菌的形狀進(jìn)行初步觀察, 可以發(fā)現(xiàn)316L不銹鋼表面附著的細(xì)菌種類較多。全浸15天的316L不銹鋼表面生物膜具有豐富的細(xì)菌多樣性, 優(yōu)勢(shì)菌群為紅桿菌目, 并且還發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)鋼鐵有腐蝕作用的硫酸鹽還原菌存在。

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