王 稷 李 曄 瞿 洋 沈靈靈 孫 靜 全晶晶

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211)

近年來, 隨著沿海工業(yè)的高速發(fā)展, 周邊城鎮(zhèn)生活污水和工業(yè)廢水排放入海的增加, 致使灘涂貝類養(yǎng)殖環(huán)境受到不同程度的重金屬污染。重金屬鎘(Cd)是廣泛分布于環(huán)境的污染物, 通常沉積在河流、灘涂和近岸水體中, 極易被水生生物吸收和蓄積, 并通過食物鏈傳遞至高等生物體內(nèi)。Cd對人體健康危害嚴(yán)重, 尤其損害腎臟、肝臟、心血管系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)(Korte, 1983; Junget al, 2005; Chenet al, 2012; Nairet al, 2012)。

泥蚶(Tegillarca granosa), 俗稱花蚶、血蚶、銀蚶、蚶子等, 富含血紅蛋白、?；撬岷吞鸩藟A等生物活性成分, 有補(bǔ)血、溫中、健胃的功效, 且肉味鮮美, 是沿海地區(qū)的傳統(tǒng)美食(Baoet al, 2010)。由于泥蚶屬于濾食性動物, 且營底棲生活, 使得它更加容易富集水體中的重金屬等污染物(Junget al, 2012)。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)寧波地區(qū)泥蚶中Cd含量超標(biāo), 其質(zhì)量指數(shù)為1.85,各地超標(biāo)率達(dá)100%(尤仲杰等, 2011)。若不解決泥蚶中Cd超標(biāo)問題, 將直接影響到泥蚶養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及泥蚶的食用安全性。因此如何減少Cd在貝類體內(nèi)殘留或有效脫除Cd已是當(dāng)務(wù)之急, 這對保障我國貝類水產(chǎn)品的質(zhì)量安全有重要意義。

目前貝類凈化的方法多數(shù)針對致病性微生物,對于重金屬污染還未見有效凈化處理技術(shù)(葉盛權(quán)等,2003)。微生物修復(fù)治理重金屬污染具有安全性、經(jīng)濟(jì)性和非破壞性的優(yōu)點(diǎn), 是重金屬污染治理的重要研究方向之一。目前, 國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)一些微生物如細(xì)菌、真菌和藻類等對重金屬Cd2+有很強(qiáng)的耐受性和富集能力, 研究的細(xì)菌多為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)(Chienet al, 2011; Weiet al, 2011)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.) (付瑾等, 2011)和皮氏羅爾斯通氏菌屬(Ralstoniasp.) (孫晶等, 2009; Nies, 2000)。其中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis), 革蘭氏陽性、兼性厭氧菌, 在生長代謝中能產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì), 可抑制腸道中的致病菌, 常用其制備益生菌, 用于調(diào)整腸道菌群失調(diào)(周鳴等, 2006; 何英, 2007)。在重金屬污染防治方面, 周鳴等(2006)采用地衣芽孢桿菌死菌體吸附水中的鉻(Cr6+), 最大吸附量為60.5mg/g。

通過活化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)的耐350mg/L Cd2+的地衣芽孢桿菌, 研究其對Cd2+脅迫下泥蚶存活率、組織中Cd殘留量、抗氧化酶系活性及免疫相關(guān)基因表達(dá)情況的影響, 進(jìn)而探討微生物菌劑對貝類Cd污染的防治和脫除的有效性及可行性, 并為提高水產(chǎn)食品食用安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 地衣芽胞桿菌 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)由寧波大學(xué)海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室篩選鑒定保存。

1.1.2 泥蚶 實(shí)驗(yàn)用泥蚶(Tegillarca granosa)采自溫州樂清, 平均體重為(8.50±0.23)g, 實(shí)驗(yàn)前洗刷干凈, 清除附著物。

1.1.3 試劑 實(shí)驗(yàn)用硝酸(HNO3)、氯化鎘(CdCl2?2H2O)為分析純, 購自寧波博奧生物工程有限公司);SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、BCA試劑盒購自南京建成生物工程研究所; M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒由生工生物工程(上海)有限公司提供; SYBR Premix Ex TaqTMⅡ?yàn)門aKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 泥蚶的處理 泥蚶在20°C、鹽度30的海水中充氣暫養(yǎng)一周, 每天投喂適量餌料, 隔天換水。實(shí)驗(yàn)時泥蚶被隨機(jī)分為14組, 每組20枚。根據(jù)Cd2+對泥蚶96h的半致死濃度(劉琴, 2008), 將Cd2+在實(shí)驗(yàn)水體終濃度設(shè)置為0.437、1.749和6.996mg/L; 每組地衣芽孢桿菌的投喂量分別為6.24×109、1.56×1010、4.50×1011CFU/L (水體中的終濃度)。不加Cd2+,也不投喂地衣芽孢桿菌的為空白組, 而不加Cd2+, 僅投喂4.50×1011CFU/L地衣芽孢桿菌的作為對照組。Cd2+和地衣芽胞桿菌在實(shí)驗(yàn)開始時加入, 此后每次換水時加入相應(yīng)的量。實(shí)驗(yàn)水體為1L, 每個實(shí)驗(yàn)組做2個平行, 實(shí)驗(yàn)周期為96h。

1.2.2 菌種培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)時將活化的地衣芽孢桿菌接種到普通LB液體培養(yǎng)基中, 搖床培養(yǎng)24h, 菌液經(jīng)5000r/min離心5min, 菌體沉淀用無菌水制備成3.01×1012CFU/L的菌懸液, 于4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 泥蚶死亡率的統(tǒng)計 每天觀察泥蚶的死亡情況, 96h后統(tǒng)計各組泥蚶的死亡率。

1.2.4 組織中Cd殘留量的測定 每組泥蚶隨機(jī)取5枚, 解剖內(nèi)臟團(tuán)并搗碎后, 進(jìn)行微波消解。每0.5g樣品加入5mL HNO3消解試劑。微波消解采用梯度升溫消解程序: 800W從室溫經(jīng)10min升至120°C, 保持5min, 然后從120°C再經(jīng)5min升至150°C, 保持5min,最后從150°C經(jīng)5min升至190°C, 保持15min。冷卻后, 消解液用5% HNO3定容至50 mL。ICP-AES測消解液中Cd含量。實(shí)驗(yàn)中所有器皿使用前均于5%HNO3中浸泡24 h。

1.2.5 泥蚶組織中抗氧化酶活力測定 冰上解剖泥蚶內(nèi)臟團(tuán), 冰凍生理鹽水沖洗干凈, 吸干水分后,準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量, 按質(zhì)量體積比1︰9加入預(yù)冷生理鹽水, 冰上勻漿, 勻漿液稀釋10倍后, 離心(3500r/min,4°C, 10min), 取上清液, 再次稀釋為1%和10%濃度,分別用于總蛋白濃度和SOD、GSH-Px酶活的測定。實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明。

1.2.6 免疫相關(guān)基因的表達(dá)分析

(1) 總RNA的提取 泥蚶內(nèi)臟組織, 在液氮中充分研磨, 加入Trizol提取總RNA, 具體步驟參照Trizol說明書。總RNA使用Nanodrop超微量分光光度計進(jìn)行定量分析, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)完整性。

(2) cDNA的合成 上述提取的總RNA, 根據(jù)M-MLV使用說明進(jìn)行第一鏈cDNA的合成, 產(chǎn)物于–20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

(3) Real-time PCR 根據(jù)NCBI上的序列信息,采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計并合成泥蚶的MT、Ferritin、sHSP基因的熒光定量PCR引物(表1), β-actin作為內(nèi)參。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為20μL: SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×), 10μL; PCR Forward Primer(10μmol/L), 1μL; PCR Reverse Primer (10μmol/L), 1μL;cDNA模板, 4μL; ddH2O, 4μL。反應(yīng)程序?yàn)?5°C 1min;95°C 10s; 60°C 15s; 75°C 15s, 30至40個循環(huán)。以actin為內(nèi)參, 對得到的各樣品Ct值進(jìn)行均一化處理, 以正常生長下的泥蚶的相關(guān)免疫基因的mRNA的表達(dá)量為基準(zhǔn), 應(yīng)用2–ΔΔCT法確定各個基因 mRNA的相對含量。

表1 用于Real-time PCR的引物序列Tab.1 Sequence of primers used for real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 地衣芽胞桿菌對泥蚶存活率和鎘殘留量的影響

不同濃度的Cd2+和地衣芽胞桿菌對泥蚶存活率和組織中的鎘殘留量的影響見表2。

Cd2+濃度為0 mg/L時, 4.50×1011CFU/L地衣芽孢桿菌作用下泥蚶的存活率與自然生長狀態(tài)下(即空白組)的存活率一樣, 均為100.0%, 表明地衣芽胞桿菌對泥蚶無負(fù)面影響。未加地衣芽孢桿菌時, 不同濃度Cd2+的加入對泥蚶存活率的影響具有顯著差異(P＜0.05), Cd2+濃度越高, 泥蚶存活率越低。隨著地衣芽胞桿菌投入量的增加, 一定濃度Cd2+脅迫下的泥蚶的存活率逐漸上升。以上數(shù)據(jù)表明地衣芽孢桿菌的加入對提高Cd2+脅迫下泥蚶的存活率具有顯著的效果。

在養(yǎng)殖水體中分別加入濃度為0.473、1.749和6.996 mg/L的Cd2+, 泥蚶組織中的Cd含量相應(yīng)地為0.690、1.030和4.470mg/kg (表2)。表明水體中的不同濃度的Cd2+在泥蚶體內(nèi)引起了不同程度的蓄積。當(dāng)加入地衣芽孢桿菌后, 泥蚶體內(nèi)的Cd殘留量發(fā)生顯著下降(P＜0.05)(表2)。數(shù)據(jù)證實(shí)地衣芽胞桿菌能夠在一定程度上清除泥蚶體內(nèi)的Cd殘留量。

表2 地衣芽胞桿菌對鎘脅迫下泥蚶的存活率和組織中鎘殘留量的影響Tab.2 Influences of B. licheniformis on the survival rates of T. granosa and the Cd concentration in T. granosa exposed to cadmium chloride

2.2 地衣芽胞桿菌對抗氧化酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)選擇0.437 mg/L Cd2+脅迫下的泥蚶進(jìn)一步研究不同濃度的地衣芽胞桿菌對抗氧化酶SOD和GSH-Px活性的影響, 結(jié)果見圖1。當(dāng)暴露于0.437 mg/L Cd2+的泥蚶被投喂不同量(6.24×109, 1.56×1010, 4.50×1011CFU/L)的地衣芽孢桿菌后, 泥蚶組織中SOD活性呈顯著升高趨勢, 且與加入的地衣芽胞桿菌的量呈正相關(guān)。地衣芽胞桿菌對GSH-Px活性的影響與對SOD的影響類似, 也表現(xiàn)為隨加入濃度增加而活性升高的趨勢。

2.3 地衣芽胞桿菌對泥蚶體內(nèi)免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

同樣, 選擇Cd2+濃度為0.473 mg/L的實(shí)驗(yàn)組泥蚶, 研究不同投喂量的地衣芽胞桿菌對組織中三類免疫相關(guān)基因MT、ferritin和sHSP的表達(dá)情況, 結(jié)果見圖2。隨著地衣芽胞桿菌投喂量的增加, 三類基因的表達(dá)量均呈顯著下降趨勢, 其中MT的表達(dá)量下降最為顯著, sHSP次之, ferritin表達(dá)量的變化最小。表明這三類基因在泥蚶體內(nèi)起著相似的免疫調(diào)節(jié)作用, 而地衣芽胞桿菌是通過調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá), 從而在一定程度上提高泥蚶耐受鎘脅迫的能力。

圖1 地衣芽孢桿菌對泥蚶組織中SOD和GSH-Px活性的影響Fig.1 Effects of B. licheniformis on the activities of SOD and GSH-Px in the visceral mass of T. granosa exposed to 0.473mg/L cadmium

圖2 地衣芽孢桿菌對泥蚶組織中免疫基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of B. licheniformis on the expression levels of MT,sHSP and ferritin in the visceral mass of T. granosa exposed to 0.437 mg/L cadmium

3 討論

泥蚶是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中極具經(jīng)濟(jì)價值的貝類,屬灘涂濾食性貝類, 經(jīng)過鰓不斷吸收溶解水體中的重金屬進(jìn)入體內(nèi)。此外, 也可通過體表與水體的滲透交換作用使重金屬進(jìn)入體內(nèi), 并在內(nèi)臟積累(張傳永等, 2008)。因此泥蚶的生活環(huán)境在很大程度上決定了泥蚶體內(nèi)Cd的含量。Cd在泥蚶體內(nèi)的累積能破壞泥蚶體內(nèi)的離子平衡, 改變細(xì)胞膜滲透性, 也可能抑制鈉離子-鉀離子(Na+/K+)主動運(yùn)輸過程, 從而降低ATP的有效性。此外, Cd能抑制泥蚶抗氧化酶系統(tǒng), 破壞內(nèi)臟器官酶系統(tǒng)的正常生理功能, 妨礙泥蚶正常代謝(李學(xué)鵬等, 2010), 致使泥蚶存活率下降。另一方面泥蚶體內(nèi)的Cd也容易通過食物鏈進(jìn)入人體內(nèi), 影響泥蚶的食用安全性。

很多微生物包括細(xì)菌、真菌、酵母以及藻類, 都具有不同程度的結(jié)合重金屬的能力(Dhankharet al,2011)。研究普遍認(rèn)為微生物的細(xì)胞壁是吸收或結(jié)合重金屬的主要結(jié)構(gòu)和場所(Pradhanet al, 2007; Fanget al, 2009)。

本實(shí)驗(yàn)將地衣芽胞桿菌投喂給鎘脅迫下的泥蚶,結(jié)果使泥蚶的存活率顯著上升(表2), 而體內(nèi)的Cd殘留量顯著下降(表2), 表明泥蚶對地衣芽胞桿菌的吸收能夠減少Cd在體內(nèi)的蓄積, 起到保護(hù)泥蚶的作用。此結(jié)果一方面是因?yàn)橥斗诺剿w中的地衣芽胞桿菌直接結(jié)合了水體中的Cd2+, 從而減少了泥蚶對Cd2+的吸收; 另一方面可能是進(jìn)入泥蚶體內(nèi)的地衣芽胞桿菌通過結(jié)合體內(nèi)的Cd, 加速了Cd的排泄。

益生菌已被廣泛地應(yīng)用在養(yǎng)殖業(yè)中, 對提高養(yǎng)殖動物的生長率、免疫力以及對病原菌的抵抗性具有重要作用。大量研究表明飼料中添加益生菌能夠有效調(diào)節(jié)動物的抗氧化系統(tǒng), 影響相關(guān)免疫基因的表達(dá)模式(Bruntet al, 2008; Tovar-Ramírezet al, 2010;Sliva-Aciareset al, 2013)。為此, 本實(shí)驗(yàn)分析了地衣芽胞桿菌作用下, 泥蚶的抗氧化酶活性和相關(guān)基因的表達(dá)變化情況, 以了解該菌株對泥蚶的保護(hù)機(jī)制。

有研究發(fā)現(xiàn), 在Cd2+脅迫下的動物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species, ROS), 進(jìn)而耗盡抗氧化酶(Shaikhet al, 1999; Bagchiet al, 2000;Szuster-Ciesielskaet al, 2000)。因此一般認(rèn)為能夠提高抗氧化酶活性或者減少重金屬吸收的物質(zhì)都能夠降低Cd2+的誘導(dǎo)毒性(Lacorteet al, 2013)。在本實(shí)驗(yàn)中, 作者發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的投喂量與泥蚶體內(nèi)的SOD和GSH-Px的活性呈正相關(guān)(圖1), 由此推斷, 地衣芽胞桿菌通過增加抗氧化酶活性來減少ROS對泥蚶的傷害作用, 從而降低Cd誘導(dǎo)的毒性。

同時, 研究還發(fā)現(xiàn)地衣芽胞桿菌的投喂導(dǎo)致了三類基因MT、sHSP和ferritin在mRNA水平上表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)(圖2)。MT是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬結(jié)合蛋白, 可調(diào)節(jié)生物細(xì)胞體內(nèi)非必需金屬元素的解毒過程; Ferritin是一種高度保守的鐵結(jié)合蛋白, 可對機(jī)體氧化損傷起保護(hù)作用; sHSP是HSP家族中的一員, 也能作用于細(xì)胞來抵抗各種應(yīng)激反應(yīng)。有研究報告, 當(dāng)泥蚶受到Cd2+脅迫時, MT、sHSP和ferritin往往是高表達(dá)的。在本實(shí)驗(yàn)中, 當(dāng)水體中加入地衣芽胞桿菌后, 進(jìn)入泥蚶體內(nèi)的Cd2+的量減少,可能是導(dǎo)致這三類基因表達(dá)下調(diào)的原因。事實(shí)上, 在很多情況下基因在mRNA水平上的表達(dá)和蛋白水平上的表達(dá)并不一致(Sekharet al, 2011), 因此, 要闡明地衣芽胞桿菌作用機(jī)制, 進(jìn)一步研究這些免疫基因在蛋白水平上的表達(dá)是必不可少的。

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