任毅鵬 高 晶 潘寶平 高 虹 閆春財

(天津師范大學生命科學學院 天津市動植物抗性重點實驗室 天津 300387)

青蛤(Cyclina sinensis)是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類, 廣泛分布于我國南北沿海灘涂及河口的泥砂質(zhì)區(qū)域。近年來, 隨著我國海產(chǎn)貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化, 青蛤的增養(yǎng)殖業(yè)受到了病害的嚴重困擾, 相繼出現(xiàn)了大面積死亡事件(孫國銘等,2004; 曹華, 2004)。因此, 亟待探索青蛤的免疫信號傳導通路及免疫抗病害機理。

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)早在(Nusslein-Volhardet al, 1980)研究果蠅胚胎發(fā)育時發(fā)現(xiàn)的一種蛋白, 屬于天然免疫過程中參與識別病原體相關(guān)的分子模式(PRRs), 是一種重要的模式識別受體(PAMPs)(Medzhitovet al, 2002; Janewayet al, 2002)。它可以識別多種僅表達在病原微生物上的高度保守結(jié)構(gòu)序列,其中包括細菌細胞壁成分, 鞭毛蛋白等。TLRs是一類跨膜蛋白, 胞外有參與病原體識別的一些富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeats, LRRs)。胞內(nèi)存在一段保守序列, 該序列被稱為TIR結(jié)構(gòu)域(Toll/Interleukin-1 homologous region) (Xuet al, 2000; Yamamotoet al,2005), 這段區(qū)域是高度保守的, 與果蠅(Drosophila melanogaster)同源, 可以激活已經(jīng)被轉(zhuǎn)染的細胞中的菌肽啟動子(Tausziget al, 2000), 并與髓樣分化因子88(Myd88)相互作用, 參與細胞內(nèi)的信號傳遞。

目前, 大部分的脊椎動物中TLRs已經(jīng)被克隆,并闡釋了其在先天免疫和獲得性免疫中的重要作用(Pasareet al, 2004)。其中, 在海洋無脊椎動物中鮮有報道, 如中華鱟(Tachypleus tridentatus) (Inamoriet al,2004)、夏威夷短尾魷魚(Euprymna scolopes) (Goodsonet al, 2005)和櫛孔扇貝(Chlamys farreri)等Toll基因的序列全長已被克隆, 從現(xiàn)有的文獻來看, 青蛤(Cyclina sinensis)的Toll基因的相關(guān)序列目前還沒有報道。本實驗的結(jié)果為探索青蛤抗病害機理和免疫反應機制提供重要的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

青蛤(Cyclina sinensis)樣品采于天津大港灘涂,暫養(yǎng)于通氣海水中, 海水密度1.02—1.04g/cm3, 水溫21—24°C, 投喂5‰小球藻, 選擇沒有損傷, 形態(tài)上無顯著差異的成體[平均殼寬(19.12±0.57)mm, 平均殼長(29.14±1.23)mm, 平均殼高(29.52±1.47)mm],一周后開始實驗。

將實驗室保存的鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus)菌種用2216E 培養(yǎng)基于28°C下培養(yǎng)24h, 用無菌海水重懸菌液, 將濃度調(diào)為OD600= 0.4。采用隨機分組方法, 每次試驗均設10個平行組。實驗組青蛤注射50μL/只的鰻弧菌菌液和藤黃微球菌菌液, 對照組注射等量的滅菌生理鹽水。注射前提取血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、鰓和性腺, 準確稱取組織質(zhì)量50mg; 注射后3h、6h、9h、12h、24h、48h、96h時提取血淋巴。以上組織迅速放入液氮冷凍備用。

1.2 方法

1.2.1 青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建 利用TRIZOL法,提取青蛤各個組織的總RNA, 采用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits方法進行分離純化。采用第二代MiSeq測序儀, pair end雙端模式完成青蛤轉(zhuǎn)錄組測序,利用De novoRNA-seq analysis技術(shù)綜合分析, 對相關(guān)基因進行功能注釋和代謝途徑的分析。

1.2.2 生物信息學分析 將獲得的青蛤基因類似序列的全長cDNA序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫作BLASTX分析, 使用開放閱讀框(open reading frame, ORF)在線分析, ProtParam工具在線預測序列的分子式、分子量和等電點, SignalP 3.0和SMART查找信號肽及結(jié)構(gòu)域, Clustal W對氨基酸序列進行多重比對和同源性分析, 利用MEGA4.1以鄰接法(NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。

1.2.3 青蛤TLR2基因在各組織內(nèi)的表達分析 利用TRIZOL法提取血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓的總RNA, 反轉(zhuǎn)成cDNA在–20°C保存?zhèn)溆?。以?actin基因為內(nèi)參基因, 實時定量引物分別為βactin-F: 5’ CACCACAACTGCCGAGAG 3’, β-actin-R: 5’CCGATAGTGATGACCTGACC 3’; TLR2-F: 5’ ACGG GATAATTTACTTGGA 3’, TLR2-R: 5’ GCGAGACTT TGTAGTGGGT 3; 反應在Rotor-Gene 6000實時定量PCR儀上進行, 擴增體系為20μL, 反應程序為: 95°C預變性30s, 94°C變性5s, 60°C退火30s, 72°C延伸30s,40個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用2–ΔΔCT法計算(Livaket al,2001), 使用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 鰻弧菌刺激后青蛤TLR2基因在血淋巴內(nèi)的時序性表達 參照1.2.3的方法提取鰻弧菌侵染后各時間點血淋巴總RNA, 并反轉(zhuǎn)成cDNA。以β-actin基因為內(nèi)參基因, 引物參照1.2.3。反應程序為: 95°C預變性30s, 95°C變性5s, 58°C退火30s, 72°C延伸30s,40個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用2–ΔΔCT法(Livaket al, 2001),使用SPSS軟件對同一時間點實驗與對照組, 實驗組和空白組的表達水平進行單因素方差分析。

1.2.5 藤黃微球菌刺激后青蛤TLR2基因在血淋巴內(nèi)的時序性表達 利用TRIZOL法提取藤黃微球菌侵染后各時間點血淋巴總RNA, 并反轉(zhuǎn)成cDNA。熒光定量PCR引物、反應體系、程序、數(shù)據(jù)分析和處理同1.2.4。

1.2.6 Poly I:C刺激下青蛤TLR2基因在血淋巴內(nèi)的時序性表達 利用TRIZOL法提取藤黃微球菌侵染后各時間點血淋巴總RNA, 并反轉(zhuǎn)成cDNA。熒光定量PCR引物、反應體系、程序、數(shù)據(jù)分析和處理同1.2.4。

2 結(jié)果

2.1 青蛤TLR2基因的結(jié)構(gòu)

用轉(zhuǎn)錄組所建的庫中, 有893個基因注釋到15個免疫相關(guān)的通路中。利用BLASTX在線比對后分析發(fā)現(xiàn)Toll樣受體家族基因類似序列。該序列與長牡蠣(Crassostrea gigas)Toll樣受體家族TLR2基因相似性最高, 一致性達到68%。將該序列其命名為青蛤TLR2, 在GenBank的注冊號為KJ841929。

青蛤TLR2基因cDNA開放閱讀框為2082bp, 編碼693個氨基酸(圖1), 其理論分子量為80.40kDa, 理論等電點pI=7.35, 分子式為C3641H5649N959O1026S35,氨基酸序列1—28位為信號肽序列。氨基酸組成中亮氨酸(Gly)最高, 占12.8%。利用SMART軟件預測的青蛤的TLR基因, 結(jié)果表明其有六個亮氨酸重復序列(leucine-rich repeats) (103—131, 158—180, 202—225,231—254, 255—278, 385—407), 還有一個LRRCT(LRR-C-terminal)結(jié)構(gòu)域(445—499), 單次跨膜區(qū)為503—525, 末端的TIR區(qū)(Toll/IL-1R homologous region)為554—693。

2.2 青蛤TLR基因的分子系統(tǒng)學分析

用MEGA4.1軟件以鄰接法(NJ)構(gòu)建了TLRs的系統(tǒng)樹, 如圖2, 采用bootstrap 1000個循環(huán)檢驗拓撲結(jié)構(gòu)的置信度。結(jié)果表明青蛤TLR2與長牡蠣(Crassostrea gigas)的進化距離最近, 稱為最近的一支。

2.3 青蛤TLR2基因在不同組織間的表達

以β-actin在各組織中的表達量為內(nèi)參對照, 利用實時熒光定量PCR分析了青蛤TLR2基因在青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、鰓和性腺等六個組織的表達情況, 結(jié)果顯示青蛤TLR2基因在青蛤的以上六個組織中普遍性表達(圖3), 但表達量存在明顯差異, 其中血淋巴中表達含量最高, 顯著高于其它組織(P＜0.05), 是表達量最低的肝臟的8倍, 外套膜表達次之。表明青蛤TLR2基因主要在血淋巴中表達。

圖1 青蛤TLR2基因cDNA序列的開放閱讀框及功能域分析Fig.1 The open reading frame of CsTLR2 gene and analysis on the structural domain

2.4 在鰻弧菌刺激下青蛤TLR2基因在血淋巴中的時序性表達

在鰻弧菌侵染青蛤后, 以β-actin 為內(nèi)參基因,利用實時熒光定量PCR分析了青蛤TLR2基因在血淋巴組織中的表達時序變化(圖4)。發(fā)現(xiàn)實驗組在感染后3h開始升高; 直到48h的時候達到了最大值, 并與對照組有極顯著性差異(P＜0.01), 約為對照組的6.8倍左右; 且與空白組有極顯著性差異(P＜0.01)。96h后其表達量開始下降, 恢復并接近至正常水平。

2.5 在藤黃微球菌刺激下青蛤TLR2基因在血淋巴中的時序性表達

在藤黃微球菌侵染青蛤后, 以β-actin為內(nèi)參基因, 利用實時熒光定量PCR分析了青蛤TLR2基因在血淋巴組織中的表達時序變化(圖5)。發(fā)現(xiàn)實驗組在感染后3h開始升高; 直到48h的時候達到了最大值,并與對照組有顯著性差異(P＜0.05), 約為對照組的8.5倍左右。在刺激96h后其表達量開始下降, 恢復并接近至正常水平。

2.6 在Poly I:C刺激下青蛤TLR2基因在血淋巴中的時序性表達

在Poly I:C侵染青蛤后, 以β-actin為內(nèi)參基因,利用實時熒光定量PCR分析了青蛤TLR2基因在血淋巴組織中的表達時序變化(圖6)。發(fā)現(xiàn)實驗組在感染后3h開始逐漸升高; 直到48h的時候達到了最大值, 并與對照組有極顯著性差異(P＜0.01), 約為對照組的18.3倍左右, 且與空白組有極顯著性差異(P＜0.01)。在刺激96h后其表達量開始下降, 恢復并接近至正常水平。

圖2 使用鄰接法(NJ)構(gòu)建的15個物種TLRs氨基酸序列系統(tǒng)樹Fig.2 The phylogenetic tree constructed by the amino acid sequences of TLRs of 15 species using neighbor-joining method

圖3 青蛤TLR2基因在青蛤不同組織間的表達情況Fig.3 Expression characterization of C. sinensis in organs revealed by real time PCR

圖4 青蛤血淋巴TLR2基因在鰻弧菌刺激不同時間相對表達量的變化Fig.4 The relative expression of CsTLR2 gene in hemolymph of C. sinensis infected by V. anguillarum in different periods

圖5 青蛤血淋巴TLR2基因在藤黃微球菌刺激不同時間相對表達量的變化Fig.5 The relative expression of CsTLR2 gene in hemolymph of C. sinensis infected by M. luteus in different periods

圖6 青蛤血淋巴TLR2基因在Poly I:C刺激不同時間相對表達量的變化Fig.6 The relative expression of CsTLR2 gene in hemolymph of C. sinensis infected by Poly I:C in different periods

3 討論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組建庫, 得到了青蛤TLR2基因的cDNA序列, 通過比對發(fā)現(xiàn)該基因與許多水生生物的TLR2基因親緣關(guān)系相近, 例如長牡蠣(Crassostrea gigas)和文昌魚(Branchiostoma floridae)等。在已經(jīng)報道的長牡蠣(Gueguenet al, 2003)、太平洋長牡蠣(De Lorgerilet al, 2011)、蝦夷扇貝(Houet al, 2011)、地中海貽貝(Venieret al, 2011)和夏威夷短尾魷魚(Goodsonet al, 2005)中都發(fā)現(xiàn)了TLR2基因片段, 這有利于了解軟體動物非特異性免疫應答中模式識別受體的作用機制。蛋白序列經(jīng)SMART結(jié)構(gòu)預測與分析, 發(fā)現(xiàn)其胞外段存在6個LRR結(jié)構(gòu)域, LRR結(jié)構(gòu)域參與病原識別、信號傳遞、細胞粘連和細胞發(fā)育等(Buchananet al, 1996; Kajava, 1998; Bellet al, 2003)。還發(fā)現(xiàn)了6個N-糖基化位點, 均位于Toll樣受體胞外區(qū)。幾乎所有的Toll樣受體都具有胞外N-糖基化位點, 其能影響受體表面的特性、結(jié)合和模式識別等有關(guān), 例如TLR2和TLR4都有相應結(jié)構(gòu)以便發(fā)揮功能(Ohnishiet al, 2003; Weberet al, 2004)。此外在胞外的TIR區(qū)域是TLRs與其下游蛋白激酶相互作用的關(guān)鍵部位, 與髓樣分化因子88(Myd88)相互作用, 參與細胞內(nèi)的信號傳遞。它們之間構(gòu)成一種網(wǎng)絡, 對于識別病毒、真菌、細菌等“非己”物質(zhì), 啟動并激活先天免疫系統(tǒng)等方面有著重要的作用(Akiraet al, 2001; Goldsteinet al, 2004)。

本實驗結(jié)果顯示, 青蛤TLR2基因的在各組織中的表達量基本表現(xiàn)為血淋巴＞鰓＞性腺＞外套膜＞閉殼?。靖闻K。而且在血淋巴中的表達量與其它組織有顯著性的差異(P＜0.05)。血淋巴可以直接吞噬和破壞微生物, 在抗感染中發(fā)揮作用。還可以產(chǎn)生和釋放抗菌性物質(zhì), 最后血淋巴還在炎癥中的包囊形成和損傷修復中發(fā)揮作用(孫虎山等, 2001; 劉志鴻等, 2003)。青蛤的先天性免疫主要依賴于血淋巴的循環(huán), 其在軟體動物的內(nèi)部防御中起到至關(guān)重要的作用(Pipeet al, 1997; Woottonet al, 2003)。青蛤TLR2基因的相對表達量在血淋巴中最高, 也再一次證明了其參與青蛤的先天性免疫反應。

無脊椎動物中存在識別和和結(jié)合細菌、真菌和病毒細胞成分的蛋白因子, 這些蛋白因子可以識別并結(jié)合微生物的脂多糖、葡萄糖等并且激發(fā)一系列的免疫反應。革蘭氏陰性菌表面的脂多糖結(jié)構(gòu)被稱為內(nèi)毒素, 是激發(fā)機體天然免疫的重要分子(Biswaset al,1999; Iwanaga, 2002); 革蘭氏陽性菌表面細胞壁的主要成分肽聚糖, 其是真核生物先天性免疫系統(tǒng)識別的靶標(Doyleet al, 1994); Poly I:C中文名稱為聚肌胞苷酸、聚肌苷酸-聚胞苷酸, 為雙鏈RNA(dsRNA)的類似物, 可以激活青蛤的非特異性免疫, 本實驗用鰻弧菌作為陰性菌的代表, 藤黃微球菌作為陽性菌的代表, 用Poly I:C模擬病毒的雙鏈來刺激青蛤。在等量的三種外源刺激物刺激青蛤3h后, TLR2基因在血淋巴中的表達量均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢, 直到48h表達量達到最大值。在鰻弧菌和Poly I:C的刺激下, 48h的相對表達量與對照組和空白組均有極顯著性差異(P＜0.01),在藤黃微球菌的刺激下, 48h的相對表達量也與對照組有顯著性差異(P＜0.05), 該結(jié)果與青蛤其它免疫相關(guān)因子如溶菌酶(潘寶平等, 2010)、磷酸酶(宋欣等,2010)的研究結(jié)果基本一致。實驗結(jié)果說明在外界刺激下青蛤TLR2基因的轉(zhuǎn)錄水平隨之升高, 其參與了青蛤的免疫應答反應, 對于革蘭氏陽性菌、陰性菌和病毒均有識別作用。在鰻弧菌和Poly I:C刺激下, 青蛤TLR2基因的表達量與對照組和實驗組均有顯著性差異(P＜0.01), 說明該基因與革蘭氏陽性菌相比對于病毒和革蘭氏陰性菌有更強的識別作用。本研究結(jié)果可為進一步深入研究貝類TLR2基因的作用機理奠定基礎, 并為貝類養(yǎng)殖中的病害防治提供技術(shù)支撐。

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