林曉玲 王 清 袁澤軼 于 倩 吳惠豐① 叢 明 李 斐 趙建民①

(1. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所 中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點實驗室 煙臺 264003;2. 國家海洋信息中心 天津 300171; 3. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)是一類富含半胱氨酸(Cys)的低分子量蛋白質(zhì), 常含有Cys-Cys、Cys-Xn-Cys等結(jié)構(gòu), 其Cys殘基中的巰基(SH)能夠螯合金屬離子, 通過降低其它功能蛋白關(guān)鍵靶位的金屬濃度, 減輕金屬的毒性作用(Amiard-Triquetet al,1998; Silvestreet al, 2005)。研究發(fā)現(xiàn), MT可被重金屬、氧化損傷和免疫刺激等多種環(huán)境因素誘導(dǎo)產(chǎn)生;且受到重金屬暴露時, 機(jī)體內(nèi)重金屬含量與MT表達(dá)水平之間存在著顯著相關(guān)性(Bebiannoet al, 1998;Moragaet al, 2002; Conget al, 2012)。早在1979年,Ridlington等(1979)在美洲牡蠣Crassostrea virginica中報道了軟體動物的首個MT序列, 此后陸續(xù)在貽貝Mytilus edulis(Lemoineet al, 2003)、巨牡蠣Crassostrea rhizophorae(Rebeloet al, 2003)、海灣扇貝Argopecten irradians(Wanget al, 2009)和文蛤Meretrix meretrix(Wanget al, 2010)等多種軟體動物體中發(fā)現(xiàn)了MT的存在。目前, MT已被聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署遴選為海洋環(huán)境監(jiān)測的生物標(biāo)志物之一(UNEP/RAMOGE)。

鎘(Cd)是一種有毒的非必需金屬元素, 具有易富集、難降解、半衰期長等特點。近年來, 隨著工礦企業(yè)排污量的增加, Cd已成為海洋環(huán)境重金屬污染的主要種類之一。例如, 渤海灣的大沽口、秦口河河口沉積物中Cd濃度達(dá)到1.01—1.82mg/kg, 造成了較高的生態(tài)風(fēng)險(Menget al, 2008)。研究表明, Cd不但能夠影響海洋生物的攝食、生長發(fā)育和繁殖等生理活動(曾艷藝等, 2010; 廖永巖等, 2007; Ringwoodet al,2004), 還可通過食物鏈的富集作用對人類健康構(gòu)成潛在威脅(Galayet al, 2001; Seebaughet al, 2005)。

雙殼貝類分布廣泛, 濾食的特性使其對環(huán)境污染物具有較強(qiáng)的富集能力, 常被用來指示海區(qū)的水質(zhì)狀況(Blascoet al, 1999; Jiet al, 2006; Parket al,2008)。菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum是一種廣泛分布于我國沿海區(qū)域的經(jīng)濟(jì)貝類, 已被列為我國“貽貝監(jiān)測計劃”的目標(biāo)監(jiān)測生物。在前期研究中, 我們發(fā)現(xiàn)不同殼色菲律賓蛤仔(白蛤、斑馬蛤、兩道紅)對Hg等重金屬暴露的代謝響應(yīng)途徑存在顯著差異(Liuet al, 2011a, b)。本研究以菲律賓蛤仔為實驗對象,克隆獲得了MT基因的全長cDNA序列, 并比較了Cd2+暴露對白蛤和斑馬蛤兩種殼色菲律賓蛤仔MT基因表達(dá)模式的影響, 研究結(jié)果可為探討菲律賓蛤仔MT的解毒作用及其重金屬污染指示功能提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及鎘暴露實驗設(shè)置

實驗所用菲律賓蛤仔購自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場, 選取殼長2.0—2.5cm的個體進(jìn)行暴露實驗。正式實驗前,分別選擇白蛤和斑馬蛤各60只, 在40L充氣過濾海水中(20±2)°C馴養(yǎng)5d。正式實驗和馴養(yǎng)期間, 每24h換水一次, 定時投喂小球藻和三角褐指藻, 濾食3h后換水。暴露實驗包括急性暴露和亞慢性暴露兩部分,每個實驗均設(shè)有暴露組和對照組, 各處理組均設(shè)置3個重復(fù)。根據(jù)前期實驗結(jié)果, 采用Cd2+暴露48h半致死濃度(白蛤11.854mg/L, 斑馬蛤10.597mg/L)的2%,即200μg/L Cd2+(CdCl2)作為48h急性暴露濃度。亞慢性暴露濃度的最高值通常設(shè)置為96h半致死濃度的5%—20%, 因此, 本研究采用80μg/L Cd2+暴露實驗動物30d (96h半致死濃度分別為白蛤1.362mg/L, 斑馬蛤0.633mg/L)。暴露結(jié)束后, 分別采集白蛤和斑馬蛤各6只, 解剖并采集消化腺和鰓組織, 置于-80°C超低溫冰箱中備用。

1.2 總RNA提取及cDNA制備

總RNA提取采用Trizol試劑(美國Invitrogen公司), 并按說明書操作。cDNA反轉(zhuǎn)錄按照M-MLV(美國Promega公司)操作手冊操作。制備獲得的cDNA置于-80°C超低溫冰箱中備用。

1.3 基因克隆

根據(jù)實驗室已有金屬硫蛋白EST序列, 設(shè)計基因特異性引物P1(5′-GCTCCGATTGCAGGTGTC-3′),與接頭引物oligo dT進(jìn)行3′末端擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件如下: 94°C預(yù)變性5min, 然后進(jìn)入35個循環(huán): 94°C變性30s, 59°C退火30s, 72°C延伸60s; 最后72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 采用凝膠回收試劑盒純化, 與pMD18-T載體連接, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coliTop10F′; 經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR檢測, 挑選5個陽性克隆送北京諾賽基因公司進(jìn)行測序, 所得結(jié)果與原始EST序列拼接后獲得全長序列。

1.4 生物信息學(xué)分析

采用BLAST在線程序進(jìn)行RpMT序列的同源性比對和相似性分析; 氨基酸序列的特征結(jié)構(gòu)分析采用Expasy網(wǎng)站在線軟件分析; 信號肽分析采用SignalP 4.1 Server在線分析; 多重比對采用ClustalX軟件。

1.5 基因表達(dá)分析

采用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司7500Fast實時熒光定量PCR儀, 檢測Cd2+暴露前后白蛤、斑馬蛤消化腺和鰓組織中金屬硫蛋白基因RpMT表達(dá)量的變化。針對RpMT的cDNA序列, 設(shè)計基因特異性引物MF(5′-GAAAGGTTGTACTCGGGAAGG-3′)和MR(5′-GGCGAATCTAGGCAAGTGG-3′); 同時, 選取β-actin作為內(nèi)參基因用于模板的校正, 設(shè)計引物信息如下:F1(5′-GTCCTGTCACTTTACGCTTCCG-3′)和R1(5′-AACAAGAAATGGAGACGGCTGC-3′)。反應(yīng)條件為:95°C 預(yù)變性10min, 然后進(jìn)入40個循環(huán): 95°C 變性5s, 55°C 退火15s, 72°C 延伸30s。每次PCR反應(yīng)結(jié)束, 通過溶解曲線分析確定PCR產(chǎn)物擴(kuò)增和檢測的特異性?；虻南鄬Ρ磉_(dá)水平用2?ΔΔCT法計算(Livaket al, 2001), 所得結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因子及單因子方差分析(ANOVA),P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

將擴(kuò)增獲得的PCR片段與已知EST序列拼接,獲得了菲律賓蛤仔RpMT的全長cDNA序列。經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn), RpMT序列在白蛤和斑馬蛤中不存在差異。將RpMT的全長cDNA序列提交GenBank注冊(KF214789), 其核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列如圖1所示。RpMT的全長cDNA包括570bp, 3′端具有多聚腺苷酸加尾信號AATAAA和polyA尾巴; 開放閱讀框(open reading frame, ORF)包括228bp, 編碼75個氨基酸。RpMT推導(dǎo)的氨基酸序列中含有21個Cys殘基, 占全部氨基酸總量的28%; 編碼蛋白預(yù)測分子量為7.35kDa, 理論等電點為7.75。經(jīng)SignalP 4.1軟件預(yù)測, RpMT編碼蛋白不存在信號肽, 為胞內(nèi)蛋白。

圖1 RpMT的cDNA全長及推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA and deduced amino acid of RpMT

2.2 同源性分析

經(jīng)BLAST比對分析, RpMT編碼蛋白與其它雙殼貝類的MT蛋白具有較高的相似性。例如, 與硬殼蛤(Mercenaria mercenaria) MT蛋白的相似性為82%,與麗文蛤(Meretrix lusoria)和長牡蠣(Crassostrea gigas) MT蛋白的相似度為70%, 與其它雙殼貝類也有較高的同源性。采用ClustalX軟件, 將菲律賓蛤仔RpMT氨基酸序列與其他雙殼貝類MT蛋白進(jìn)行多序列比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 雙殼貝類MT蛋白Cys殘基的分布呈高度保守性, Cys與鄰近氨基酸組成若干Cys-Xn-Cys結(jié)構(gòu), 具有典型的軟體動物MT保守序列CKCXXXCXCX(圖2)。

圖2 菲律賓蛤仔RpMT與雙殼貝類MT蛋白的多序列比對結(jié)果Fig.2 Multiple alignment of RpMT with metallothioneins from bivalves.

2.3 急性Cd2+暴露后RpMT基因的組織表達(dá)

以β-actin為內(nèi)參基因, 利用實時熒光定量PCR方法檢測了Cd2+(200μg/L)暴露48h后, 白蛤和斑馬蛤消化腺和鰓組織中RpMT基因的表達(dá)情況。本實驗樣本存在殼色與Cd2+暴露雙因子, 首先對RpMT基因表達(dá)量進(jìn)行了雙因子方差分析。結(jié)果表明: 消化腺組織RpMT基因表達(dá)量對急性Cd2+暴露存在顯著響應(yīng), 但殼色間無顯著差異, 且殼色與Cd2+暴露之間不存在相互作用; 而在鰓組織中, RpMT基因表達(dá)量對急性Cd2+暴露存在顯著響應(yīng), 且不同殼色間存在顯著差異,雙因子的交互作用對RpMT基因的表達(dá)也具有顯著影響(表1)。進(jìn)一步的單因子方差分析結(jié)果顯示, 急性Cd2+暴露導(dǎo)致兩種殼色菲律賓蛤仔RpMT基因表達(dá)量在消化腺和鰓組織中均顯著增加(P＜0.05); 其中,鰓組織中RpMT的表達(dá)量變化幅度較消化腺組織更為明顯。在白蛤中, 消化腺組織RpMT基因表達(dá)量在暴露后升高3.2倍, 而鰓組織中RpMT的表達(dá)量則為對照組的18.4倍; 對斑馬蛤而言, Cd2+暴露導(dǎo)致消化腺組織RpMT表達(dá)量達(dá)到對照組的6.5倍, 鰓組織中RpMT的表達(dá)量較對照組升高18.0倍(圖3)。

表1 消化腺和鰓組織RpMT基因表達(dá)量的雙因子方差分析Tab.1 Two-way analysis of variance (ANOVA) on the expression of RpMT gene in digestive gland and gills under cadmium exposure

2.4 亞慢性Cd2+暴露后RpMT基因的組織表達(dá)

80μg/L Cd2+暴露30d后, 白蛤與斑馬蛤消化腺和鰓組織中RpMT基因表達(dá)情況如圖4所示。雙因子方差分析結(jié)果表明: 在消化腺組織中, RpMT基因表達(dá)量對Cd2+暴露存在顯著響應(yīng), 兩種殼色蛤仔的RpMT基因表達(dá)也差異顯著, 但殼色與Cd2+暴露雙因子間不存在相互作用; 而在鰓組織中, RpMT基因的表達(dá)結(jié)果與急性Cd2+暴露的結(jié)果類似, 對Cd2+暴露存在顯著響應(yīng), 不同殼色間存在顯著差異, 且雙因子的交互作用對RpMT基因的表達(dá)也具有顯著影響(表1)。進(jìn)一步單因子方差分析結(jié)果顯示, 亞慢性Cd2+暴露可導(dǎo)致RpMT基因在兩種殼色菲律賓蛤仔消化腺和鰓組織中的表達(dá)量顯著增加(P＜0.05); 其中, 鰓組織RpMT表達(dá)量的變化幅度較消化腺組織更為明顯。在白蛤中, 消化腺組織RpMT基因的表達(dá)量較對照組升高3.8倍, 鰓組織中的表達(dá)量達(dá)到對照組的23.7倍;對斑馬蛤而言, 消化腺組織RpMT基因的表達(dá)水平較對照組增加4.2倍, 鰓組織中的表達(dá)量為對照組的6.7倍(圖4)。

圖3 200μg/L Cd2+暴露48h后RpMT基因在兩種殼色菲律賓蛤仔中的組織表達(dá)Fig.3 The relative expression of RpMT mRNA in two pedigrees of Ruditapes philippinarum exposed to 200μg/L Cd2+ for 48h

圖4 80μg/L Cd2+暴露30d后RpMT基因的組織表達(dá)Fig.4 The relative expression of RpMT mRNA in two pedigrees of Ruditapes philippinarum treated with 80μg/L Cd2+ for 30 days.

3 討論

MT是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬結(jié)合蛋白,參與機(jī)體的重金屬解毒、微量元素調(diào)節(jié)、自由基清除以及應(yīng)激反應(yīng)等生理過程(Vasaket al, 2000)。本研究通過RACE技術(shù), 克隆獲得了菲律賓蛤仔RpMT的全長cDNA序列; RpMT編碼蛋白富含半胱氨酸, 且Cys殘基分布高度保守。此外, RpMT編碼蛋白含有15個MT特有的Cys-Xn-Cy結(jié)構(gòu), 并且具有軟體動物MT蛋白的簽名序列CKCXXXCXCX。與其它雙殼貝類MT序列比較, RpMT具有軟體動物MT的基本特征。

在生物體遭受重金屬暴露后, MT被認(rèn)為是最先參與重金屬解毒和代謝的生物大分子(Amiard-Triquetet al, 1998)。已有研究發(fā)現(xiàn), MT基因的表達(dá)量與生物體內(nèi)重金屬濃度具有明顯的正相關(guān)性。例如, 隨Cd2+暴露濃度增大, 長牡蠣Crassostrea gigas消化腺和鰓組織中MT轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量顯著升高(Choiet al,2008)。然而, 有學(xué)者認(rèn)為, MT基因的表達(dá)量與生物體內(nèi)重金屬濃度之間存在倒“U”型關(guān)系(Butleret al,2001; Wuet al, 2006), 即在一定暴露濃度范圍內(nèi), MT基因的表達(dá)量隨暴露濃度的增大而升高, 而當(dāng)超過某一閾值時, 重金屬就會對生物體的細(xì)胞功能造成損害, MT基因的表達(dá)水平則隨重金屬濃度的增大而降低。例如, 當(dāng)Cd2+暴露劑量為100μg/kg魚體重時,瘤棘鲆Scophthalmus maximus肝臟中MT基因的表達(dá)量顯著升高, 但當(dāng)暴露劑量大于200μg/kg魚體重時,其表達(dá)量隨濃度的增大而逐漸降低(Georgeet al,1996)。本研究根據(jù)前期實驗獲得的急性毒性數(shù)據(jù), 分別選擇200μg/L和80μg/L Cd2+作為急性和亞慢性暴露濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 急性和亞慢性Cd2+暴露均可導(dǎo)致菲律賓蛤仔消化腺和鰓組織中RpMT基因表達(dá)量的顯著升高, 表明RpMT在降低Cd2+對機(jī)體的毒性損害過程中發(fā)揮了重要作用。類似的實驗結(jié)果在紫貽貝Mytilus galloprovincialis(Zoritaet al, 2007)、斑馬紋貽貝Dreissena polymorpha(Fariaet al, 2009)、麗文蛤Meretrix lusoria(Changet al, 2007)和海灣扇貝A.irradians(Wanget al, 2009)等雙殼貝類中亦有報道。

作為濾食性動物, 軟體動物的鰓組織被認(rèn)為在重金屬的吸收和儲存過程中發(fā)揮了重要作用(Smaoui-Damaket al, 2004)。在本研究中, Cd2+暴露導(dǎo)致兩種殼色蛤仔鰓組織RpMT基因表達(dá)量的增加幅度均顯著高于消化腺組織, 這可能與鰓組織對水相Cd2+暴露具有較強(qiáng)的富集能力有關(guān)(季向山等, 2006)。Bebianno等(1993, 1994)和Romeo等(1995)研究發(fā)現(xiàn),十字蛤Ruditapes decussata經(jīng)Cd2+暴露后, 鰓組織中MT含量也較其它組織增加更顯著; 而紫貽貝M.galloprovincialis和貽貝M. edulis經(jīng)Cd2+暴露后, 消化腺MT基因表達(dá)量或MT蛋白含量高于鰓組織(Rasporet al, 2004; Geffardet al, 2005)。造成上述差異的原因主要在于MT的表達(dá)量受到生物種類、暴露途徑(水相和食物相)及其它環(huán)境因素的影響。

研究發(fā)現(xiàn), 不同殼色菲律賓蛤仔的生長速率、存活率及免疫學(xué)指標(biāo)等方面存在差異(閆喜武等, 2005;丁鑒鋒等, 2012)。Liu等(2011a, b)研究了三種殼色菲律賓蛤仔(白蛤、斑馬蛤、兩道紅)對Hg暴露的代謝響應(yīng), 發(fā)現(xiàn)不同殼色蛤仔的響應(yīng)途徑存在顯著差異;其中, 白蛤的鰓組織和兩道紅的消化腺組織在指示重金屬污染方面具有更高的靈敏性。在本研究中, 選取白蛤和斑馬蛤兩種殼色菲律賓蛤仔為研究對象,比較了Cd2+暴露后RpMT基因表達(dá)量變化的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 急性和亞慢性Cd2+暴露后, 白蛤消化腺組織RpMT基因的上調(diào)幅度低于斑馬蛤, 而鰓組織RpMT基因的上調(diào)幅度則超過斑馬蛤。上述結(jié)果表明, 在指示水相Cd2+污染方面, 兩種殼色蛤仔不同組織的靈敏度存在差異, 其中以白蛤鰓組織的敏感度較高。

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