馮艷艷 李 ?、?張德寧 劉 萍 葛倩倩 呂建建 高保全

(1. 上海海洋大學(xué) 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

細(xì)胞色素CYP450 (cytochrome CYP450, CYP450)酶系是一類亞鐵血紅素蛋白的超家族酶系, 主要是參與多種內(nèi)源物質(zhì)(保幼激素及其類似物、蛻皮甾酮、脂肪酸和信息素等)和外源物質(zhì)(藥物、環(huán)境毒物等)(Danielson, 2002; Matthiaset al, 2008; 劉晨暉等,2010)的代謝。自1958年首個CYP450蛋白在大鼠肝微粒體中被發(fā)現(xiàn)以來(Jensenet al, 1958), CYP450酶系的研究已經(jīng)有五十多年的歷史(Estabrook, 1996)。20世紀(jì)80年代, 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用, Fujii-Kuriyama等(1982)克隆和測序了老鼠肝CYP450基因(Chenet al, 1982), 這標(biāo)志著 CYP450研究由生物化學(xué)、生物物理學(xué)特征的鑒定及酶學(xué)功能的研究轉(zhuǎn)變?yōu)榛虮磉_(dá)的調(diào)控機(jī)制和結(jié)構(gòu)與功能的對應(yīng)關(guān)系上(朱磊等, 2011)。生物體CYP450 酶系活性受到遺傳、機(jī)體狀態(tài)、營養(yǎng)、疾病等多種因素的影響, 尤其是許多藥物外源化合物可誘導(dǎo)或抑制CYP450酶的活性, 從而影響藥物的代謝(夏偉, 2000)。目前, 國內(nèi)外對水產(chǎn)品動物CYP450酶研究較少, 但隨著對CYP450酶分子水平的認(rèn)識和體外研究技術(shù)的進(jìn)步, 可以通過研究外源物質(zhì)對CYP450酶的誘導(dǎo)和抑制情況, 預(yù)測或評估水產(chǎn)動物體內(nèi)可能發(fā)生的藥物相互作用, 指導(dǎo)藥物的安全聯(lián)用(胡曉, 2010)。CYP450酶系在藥物代謝中起主要作用的有四個家族: CYPs1—4, 其中CYP1、CYP2和CYP3家族酶承擔(dān)著人體三分之二藥物的代謝(Guengerich, 2008; 樊慧蓉等, 2006), 而在甲殼動物中目前只發(fā)現(xiàn)了CYP2和CYP4家族基因。CYP2家族是目前已知的CYP450同工酶中最大、最復(fù)雜的家族(周園等, 2002), 它是CYP450中的重要成分, 主要參與許多低分子有機(jī)化合物及藥物在體內(nèi)的代謝。有關(guān)海洋甲殼類CYP2基因的研究報道十分有限, 現(xiàn)只在佛羅里達(dá)龍蝦Panulirus argus(Boyleet al, 1998)和岸蟹Carcinus maenas(Rewitzet al, 2003)中有報道, 三疣梭子蟹Portunus trituberculatus尚未見報道。本實驗主要克隆了三疣梭子蟹CYP2基因的cDNA全長序列, 并對序列進(jìn)行比較分析; 利用Real time RT-PCR方法分析該基因的組織表達(dá)情況及其在外源藥物(磺胺嘧啶)作用下表達(dá)量的變化, 以期為進(jìn)一步了解甲殼類動物CYP450的功能和作用機(jī)制, 探討CYP450與藥物之間的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物 實驗于2012年在山東省濰坊市昌邑海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司進(jìn)行。實驗所用材料為三疣梭子蟹“黃選1號”80日齡幼蟹, 體重(32.66±6.27)g。健康個體暫養(yǎng)于半徑3m 的室內(nèi)水泥養(yǎng)殖池中, 每池80只。水溫22—25°C, pH 7.8—8.4,鹽度25—27, 持續(xù)充氧, 每天換水1/3, 投喂藍(lán)蛤。暫養(yǎng)一周。

實驗試劑 Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司; TaKaRa TaqTM、PMD18-T 載體、Top 10感受態(tài)細(xì)胞、SMARTTMRACE Amplification Kit和Advantage 2 PCR Kit購自日本TaKaRa公司; 其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 總RNA的提取與第一鏈cDNA及3′、5′RACE cDNA的合成

取健康三疣梭子蟹個體的肝胰腺于液氮中研磨,Trizol法提取總RNA, 按照Invitrogen說明書進(jìn)行;并用紫外分光光度計與1%凝膠電泳檢測其質(zhì)量與完整性。核酸蛋白測定儀(Thermo, NANO DROP-2000)測定RNA濃度。用PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser產(chǎn)品去除基因組DNA后合成第一鏈cDNA; 按照SMARTTMRACE Amplification Kit試劑盒的使用說明, 合成用于3′和5′RACE擴(kuò)增的cDNA。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-40°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 三疣梭子蟹CYP2基因cDNA中間片段的克隆

從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中搜尋佛羅里達(dá)龍蝦P. argus、斑馬魚Danio rerio和虹鱒Oncorhynchus mykiss的CYP2基因, 利用ClustalX軟件對以上序列進(jìn)行同源性對比以確定其保守區(qū)域,并設(shè)計兼并引物CYP2-F1和CYP2-R1。以三疣梭子蟹肝胰腺cDNA為模板, 以CYP2-F1和CYP2-R1為引物, 擴(kuò)增三疣梭子蟹CYP2基因中間片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為100μL, 擴(kuò)增反應(yīng)條件為: 94°C 5min預(yù)變性, 94°C 30s變性, 52°C 30s退火, 72°C 1min延伸,30個循環(huán), 最后72°C 10min延伸, 4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段大小。用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)回收目的片段并進(jìn)行純化, 純化產(chǎn)物與pMD18-T載體(日本TaKaRa公司)連接, 并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP 10感受態(tài)細(xì)胞(日本TaKaRa公司)中, 涂平板、進(jìn)行藍(lán)白斑篩選, 陽性克隆經(jīng)菌落 PCR 鑒定后送上海生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.4 CYP2基因3′和5′末端擴(kuò)增

中間片段經(jīng)NCBI比對(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)后, 可證實所得三疣梭子蟹CYP2基因部分序列與其他物種的CYP2基因同源。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物: CYP2-RACE3′和CYP2- RACE5′。兩條引物用于RACE擴(kuò)增cDNA全長序列, 3′-RACE和5′-RACE PCR擴(kuò)增使用Advantage 2 PCR Kit試劑盒(日本TaKaRa公司), PCR產(chǎn)物的分離、純化和測序等方法同中間片段克隆。引物序列見表1。

表1 三疣梭子蟹CYP2基因全長克隆及定量RT-PCR表達(dá)所用引物Tab.1 Primers used for P. trituberculatus CYP2 gene cloning and mRNA expression analysis

1.5 CYP2基因的生物信息學(xué)分析

使用DNAStar軟件中的SeqMan程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行載體序列去除和序列拼接, 使用 EditSeq程序預(yù)測開放閱讀框(ORF)、翻譯氨基酸和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測。使用NCBI網(wǎng)站(http: ∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN和BLASTX軟件對CYP2基因進(jìn)行同源性分析。使用PredictProtein服務(wù)器進(jìn)行蛋白序列功能位點分析(PROSITE motif search)。使用Signal P3.0 (http: // www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測蛋白信號肽。使用 ClustalX軟件對三疣梭子蟹與其他物種的 CYP2基因氨基酸序列進(jìn)行多序列比對, 在此基礎(chǔ)上采用MEGA 4.0 軟件, 以鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 三疣梭子蟹本體表達(dá)及肌注磺胺嘧啶對CYP2基因表達(dá)的影響

1.6.1 實驗設(shè)計

給藥方法: 根據(jù)《新編漁藥手冊》的推薦劑量和預(yù)實驗結(jié)果, 把暫養(yǎng)了一周的三疣梭子蟹隨機(jī)分為4組, 每組50只個體, 分別為對照組(0.7%生理鹽, C)、磺胺嘧啶低劑量(15mg/kg, SD-L)、磺胺嘧啶中劑量(30mg/kg, SD-M)和磺胺嘧啶高劑量(60mg/kg,SD-H)。按照各處理組給藥劑量, 通過三疣梭子蟹第四步足與體壁關(guān)節(jié)膜處肌肉注射給藥(吳光紅等,2008), 注射前和注射后用酒精棉對注射部位進(jìn)行消毒處理。各處理組每天注射一次, 連續(xù)5天。

取樣方法: 于末次給藥24h后1、3、6、12、18、24、48、72h取樣, 每組取肝胰腺組織樣品, 每個時間點隨機(jī)取3只, 液氮保存。另取3只健康無注射藥物的三疣梭子蟹的肝胰腺、鰓、肌肉、血淋巴、眼柄和心臟進(jìn)行RNA提取, 以檢測三疣梭子蟹CYP2基因在不同組織中的表達(dá)水平。

1.6.2 CYP2基因mRNA Real Time RT-PCR定量檢測

將各組反轉(zhuǎn)錄好的三疣梭子蟹肝胰腺的cDNA用DEPC水稀釋3倍, 配制10μL體系反應(yīng)液。分別加入SYBR Premix Ex TaqTM II (2×) 5μL, PCR正反引物(10μmol/L)各0.4μL, ROX Reference Dye II 0.2μL,cDNA稀釋模板1μL, 滅菌水3μL。三疣梭子蟹CYP2基因熒光定量引物: CYP2熒光-F和CYP2熒光-R(見表1), 以三疣梭子蟹β-actin為內(nèi)參基因(見表1)。熒光定量PCR反應(yīng)條件: 95°C 30s, 95°C 5s, 60°C 34s,40個循環(huán)。不同時間點同一樣品的目的基因和內(nèi)參基因均在同一個96孔板上進(jìn)行, 每個樣品采取三個平行。實驗儀器為Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR熒光定量PCR儀, 采用2－ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(P＜0.05時表示差異顯著, 用*表示;P＜0.01時表示差異極顯著, 用**表示), 并進(jìn)行Duncan 氏多重比較(當(dāng)P＜0.05時差異顯著)。

2 結(jié)果

2.1 CYP2基因的全長cDNA序列分析

采用RACE方法擴(kuò)增獲得三疣梭子蟹CYP2基因cDNA全長為1660bp(GenBank登錄號: KF781516),包含1479bp的開放閱讀框(ORF)、93bp的5′非編碼區(qū)和88bp 的3′非編碼區(qū), 編碼一個由492個氨基酸組成的多肽, 預(yù)測理論等電點PI為6.348, 分子量大小為56.68kD。有一個終止子, 并含有一個多腺苷酸信號ATTAAA和一個poly(A)尾巴。起始密碼子ATG位于94—96位核苷酸。

用SignalP 3.0程序分析該基因的推導(dǎo)理論氨基酸發(fā)現(xiàn)CYP2的1—21氨基酸區(qū)域具有一個信號肽。利用PredictProtein服務(wù)器對三疣梭子蟹CYP2蛋白序列進(jìn)行功能位點分析, 發(fā)現(xiàn)該蛋白序列具有多個功能位點(圖1), 包括: 1個cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點: 118—121; 5個酪蛋白磷酸化位點:83—86, 97—100, 280—283, 337—340, 488—491; 7個N-肉蔻?；稽c: 24—29, 105—110, 129—134,153—158, 297—302, 333—338, 383—388; 5個蛋白激酶K磷酸化位點: 41—43, 121—123, 202—204, 282—284, 488—491; 1個酰胺化位點: 430—433; 1個CYP450家族特有的亞鐵血紅素結(jié)合區(qū): 428—437。

蛋白質(zhì)的磷酸化、酰基化和酰胺化都屬于化學(xué)修飾, 通過對這些位點的鑒定有助于進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)主要定位、可能的穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)以及功能作用的發(fā)現(xiàn)等, 具有非常重要的生物學(xué)意義。

2.2 CYP2基因多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用DNAMAN軟件對三疣梭子蟹CYP2氨基酸序列與其他物種的CYP2氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析, 結(jié)果如圖2。三疣梭子蟹CYP2基因與甲殼動物中的岸蟹C. maenas的同源性最高, 達(dá)到75%, 與佛羅里達(dá)龍蝦P. argus同源性為39%, 與脊椎動物底鳉Fundulus heteroclitus、黑點青鏘Oryzias melastigma、紅尾蝴蝶魚Chaetodon xanthurus、默氏蝴蝶魚Chaetodon mertensii、斑馬魚Danio rerio、食蟹猴Macaca fascicularis、褐家鼠Rattus norvegicus的同源性分別為36%、35%、36%、35%、33%、35%、32%。利用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析, 結(jié)果表明: 三疣梭子蟹CYP2基因與甲殼動物中的岸蟹C.maenas緊密聚為一支, 之后又與佛羅里達(dá)龍蝦P.argus聚為一支(圖3)。

2.3 CYP2基因在三疣梭子蟹各組織中的表達(dá)

利用Real Time RT-PCR檢測三疣梭子蟹在組織中的CYP2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量, 結(jié)果表明, CYP2基因在肝胰腺、鰓、心臟、肌肉、眼柄和血淋巴中都有表達(dá)。以血淋巴中表達(dá)量為基準(zhǔn), 在肝胰腺中表達(dá)量最高(P＜0.01), 其次是鰓(P＜0.01), 在血淋巴中表達(dá)最少(圖4)。

圖1 三疣梭子蟹CYP2基因cDNA的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of CYP2

2.4 不同劑量及作用時間的磺胺嘧啶對CYP2基因在肝胰腺中表達(dá)變化量的影響

利用Real Time RT-PCR檢測三疣梭子蟹在注射不同劑量的磺胺嘧啶在不同時間點肝胰腺中CYP2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的變化情況(圖5)。結(jié)果顯示, 連續(xù)注射磺胺嘧啶5d后, 各實驗組均有CYP2 mRNA的表達(dá), 三個劑量組較對照組均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。其中, 低劑量組在給藥后的1、12、18和24h表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.05), 且表達(dá)量逐漸降低趨于對照組; 中劑量組和高劑量組在各取樣點表達(dá)量均顯著高于對照組(P＜0.05)。對于同一測定時間, 磺胺嘧啶低中高劑量組的CYP2基因的表達(dá)量6h后呈現(xiàn)高劑量組＞中劑量組＞低劑量組。

3 討論

目前有關(guān)海洋無脊椎動物細(xì)胞色素CYP450的研究主要集中在基因克隆及功能分析方面, 但與脊椎動物相比, 有關(guān)海洋甲殼類CYP450基因的研究報道十分有限(張喆等, 2011)。1996年, James (1984)首次從甲殼動物佛羅里達(dá)龍蝦P. argus中克隆出了CYP2家族的CYP2L1 基因, 隨后, Boyle 等(1998)在P. argus肝胰腺中又克隆出多條 CYP2L 基因,預(yù)示海洋甲殼動物CYP2 基因具有多態(tài)性。2003 年,同樣屬于第二家族的 CYP330A1 序列在岸蟹C.maenas肝胰腺中被分離出來(Rewitzet al, 2003)。此外, 研究人員在岸蟹C. maenas(Rewitzet al, 2003)、中國對蝦Fenneropenaeus chinensis(張喆等, 2011)和利莫斯螯蝦Orconectes limosus(Dauphin-Villemantet al, 1999)等海洋甲殼動物中發(fā)現(xiàn)了CYP4基因, 并研究了其參與苯并芘、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴等環(huán)境污染物和水產(chǎn)藥物諾氟沙星等外源化合物和蛻皮激素等內(nèi)源性物質(zhì)的代謝(Snyder, 1998; 張喆等, 2011)。雖然CYP450包括很多家族, 各家族參與催化的底物種類和反應(yīng)類型之間具有差異性, 但是在結(jié)構(gòu)上仍然保留著一些共同的保守區(qū)域, 即CYP基因家族所特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血紅素結(jié)合區(qū)(FxxGxxxCxG) (冷欣夫等, 2001)。K螺旋保守區(qū)可能是與 CYP450 的電子供體相作用, 血紅素結(jié)合區(qū)中絕對保守的半胱氨酸與催化活性中心亞鐵血紅素中的鐵元素形成硫醇鹽離子鍵, 從而成為鐵的一個配體, 這正是蛋白能夠與氧結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu), 同時也是作用于底物的酶活性中心(Anzenbacher, 2001)。本研究首次克隆了三疣梭子蟹CYP2基因cDNA全序列,該基因的氨基酸序列含有CYP450蛋白保守區(qū)域, 此區(qū)域包括血紅素結(jié)合區(qū)(FxxGxxxCxG)、絕對保守的半胱氨酸(Cys)和位于K螺旋保守區(qū)中的序列(ExxR)。將三疣梭子蟹CYP2氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源比對分析發(fā)現(xiàn), 三疣梭子蟹與岸蟹C. maenas同源性為75%; 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹CYP2基因與與甲殼動物的親緣關(guān)系最近, 與岸蟹C. maenas緊密分為一支, 由此更證明了本實驗克隆的CYP2基因為三疣梭子蟹CYP2基因。

圖2 三疣梭子蟹CYP2氨基酸序列與其他動物CYP2的氨基酸序列比對Fig.2 Multiple alignment of CYP2 amino acid sequence with other CYP2 animals相同的氨基酸用暗色背景表示, 缺失的氨基酸用“.”表示

圖3 不同物種的CYP2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 CYP2 phylogenetic tree of different species

圖4 三疣梭子蟹CYP2基因在組織中表達(dá)量Fig.4 Distribution of CYP2 transcript in different tissues of P.trituberculatus

圖5 不同濃度磺胺嘧啶對三疣梭子蟹肝胰腺CYP2基因表達(dá)的影響Fig.5 Variation of CYP2 gene in P. trituberculatus hepatopancreas after sulfadiazine treatment at different time

通過Real Time RT-PCR方法對三疣梭子蟹CYP2本體表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn): CYP2基因在機(jī)體中分布廣泛, 在肝胰腺、鰓、肌肉、心臟、眼柄和血淋巴中均有表達(dá)。其表達(dá)強(qiáng)度最高為肝胰腺, 其次是鰓, 最后在肌肉、心臟、眼柄和血淋巴中表達(dá)量最少。之所以在肝胰腺中表達(dá)最多, 是因為肝胰腺是對外來物質(zhì)(包括藥物或有毒物質(zhì))進(jìn)行代謝反應(yīng)的主要部位。Gonzalez(1993)在研究CYP450的生物學(xué)功能時發(fā)現(xiàn),雖然CYP450基因表達(dá)比較廣泛, 但其表達(dá)還是有選擇性的, 在哺乳動物中CYP2A1只在肝臟中表達(dá), 這與肝臟的解毒功能有關(guān)。Brown研究證明魚類的CYP450主要在脾、肝、心、頭腎、腎、鰓中表達(dá), 其中在脾和腎中表達(dá)水平較高(Brown, 1998; 郭小澤,2009)。Solé等(2005)在對一系列海洋無脊椎動物CYP450的組織分布進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn), CYP450在環(huán)節(jié)動物的腸中表達(dá)水平最高, 在軟體動物的消化腺中表達(dá)量最大, 在甲殼動物的肝胰腺中表達(dá)最多, 此研究結(jié)果與在岸蟹C. maenas中的研究類似(Damet al,2008)。Matsuo等(2008)利用熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法方法對銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)CYP1A、CYP2K1、CYP2M1 和CYP3A27基因進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn) CYP1A、CYP2M1 和 CYP3A27 在研究的所有組織中均有表達(dá), 且CYP3A27在各組織的表達(dá)量均最高, 而 CYP2K1 只在肝臟和嗅覺器官中表達(dá)。

生物體在生活環(huán)境中會接觸到許多外來物質(zhì),對外來物質(zhì)的清除主要通過肝臟系統(tǒng)CYP450基因表達(dá)進(jìn)行, 這些基因的酶產(chǎn)物催化外來物質(zhì)極性化, 促使外來物質(zhì)易于從體內(nèi)排出(范嵐等, 2009)。同時CYP450轉(zhuǎn)錄表達(dá)容易受到外來物質(zhì)的影響, 外來物質(zhì)可以誘導(dǎo)或者抑制CYP450從而影響治療效果或產(chǎn)生毒副作用。外來物質(zhì)主要通過影響CYP450 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平、CYP450的翻譯過程或者CYP450酶的活性等對CYP450產(chǎn)生影響。CYP2是CYP450中一種重要的藥物代謝酶, 在甲殼動物中主要存在于肝胰腺, 參與許多低分子有機(jī)化合物及藥物在體內(nèi)的代謝。在哺乳動物, CYP2活性已被用于指示外源性化合物引起的肝臟疾病。2006年, 劉樹民等(2006)發(fā)現(xiàn)黃藥子可誘導(dǎo)大鼠肝臟中CYP2E1基因的表達(dá), 黃藥子和當(dāng)歸配伍后CYP2E1基因的表達(dá)下降, 說明黃藥子和當(dāng)歸在CYP2E1基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用。2007年, 陳大健等(2007a, b)研究發(fā)現(xiàn)氟苯尼考和乙醇對鯽魚 CYP2E1酶均具有抑制作用, 說明氟苯尼考和乙醇在 CYP2E1酶的活性上發(fā)揮作用。2003年,Rewitz等(2003)發(fā)現(xiàn)岸蟹C. maenas肝胰腺中CYP330A1 (屬于CYP2基因家族)的表達(dá)能夠被聚丁二烯、苯并[a]芘誘導(dǎo), 說明聚丁二烯、苯并[a]芘在CYP330A1基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用。本實驗用不同濃度磺胺嘧啶刺激三疣梭子蟹CYP2基因的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)磺胺嘧啶在CYP2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平上有影響。各濃度磺胺嘧啶均可誘導(dǎo)肝胰腺中CYP2基因的表達(dá), 并且給藥劑量越大, CYP2基因上調(diào)水平越高, 且出現(xiàn)的峰值越晚, 這說明三疣梭子蟹CYP2基因與磺胺嘧啶的代謝有關(guān), 并且給藥濃度影響CYP2的表達(dá)程度,其原因可能是給藥濃度越高, 肝胰腺CYP2基因表達(dá)量越多且持續(xù)時間越長, 代謝藥物的能力就越強(qiáng), 以使機(jī)體盡快將藥物代謝到正常水平。這是機(jī)體細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制, 通過這樣的機(jī)制, 細(xì)胞增強(qiáng)了對外源性物質(zhì)解毒的能力。隨著給藥時間的推移CYP2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低, 其原因可能是隨著給藥時間的推進(jìn), 藥物在機(jī)體的濃度不斷減少, 藥物代謝量也不斷降低, 導(dǎo)致CYP2基因的表達(dá)慢慢降低最終回到原來的水平。磺胺嘧啶可使CYP2 mRNA表達(dá)升高, 說明其對CYP2有誘導(dǎo)作用, 揭示了磺胺嘧啶與CYP2酶的底物藥物合用時, 很可能會發(fā)生藥物的相互作用, 應(yīng)適當(dāng)調(diào)整用量, 避免發(fā)生不良反應(yīng)。

本文主要圍繞三疣梭子蟹藥物代謝酶CYP2基因克隆及磺胺嘧啶對其mRNA表達(dá)水平影響進(jìn)行研究, 為進(jìn)一步充分了解CYP450 家族的生理功能及生理、生化反應(yīng)過程, 還需要更深入的研究三疣梭子蟹CYP2 基因表達(dá)的組織特異性、蛋白表達(dá)及酶活性的影響。對于三疣梭子蟹CYP2基因的克隆、序列分析以及其表達(dá)情況的研究, 有利于進(jìn)一步深入研究三疣梭子蟹CYP2基因在其生長發(fā)育和藥物代謝中的作用, 同時為深入研究其他物種的CYP2基因功能奠定了理論基礎(chǔ)。

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