張 輝 崔煥忠 楊 歡 秦貴信 常曉博 尹 健 高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春 130118)

干擾素(Interferon，IFN)是有效抵抗病毒入侵的多功能細(xì)胞因子，在先天性免疫抗病毒感染過程中發(fā)揮重要作用，探討病毒抑制干擾素產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是目前研究的熱點［1］。IFN 分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，Ⅰ型與Ⅱ型IFN 都具有抗病毒作用，但Ⅰ型IFN 是機(jī)體對抗病毒感染的關(guān)鍵因素［2］。I 型IFN 可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，II 型IFN 只能由NK 細(xì)胞、激活T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等特定細(xì)胞產(chǎn)生。Ⅰ型IFN 既然為抗病毒先天性免疫的主要細(xì)胞因子，那么它是如何產(chǎn)生，并作用于鄰近細(xì)胞，防止病毒擴(kuò)散的呢?首先在內(nèi)體內(nèi)，TLR3、TLR7/8和TLR9 分別識別dsRNA、ssRNA 和CpG DNA，導(dǎo)致受體二聚化以及TRIF 和MyD88 的招募反應(yīng)，起始信號級聯(lián)放大，激活I(lǐng)RF3/IRF7、NF-κB 和AP-1 通路。RIG-I/MDA5 識別病毒RNA，通過RIG-I 的CARD 結(jié)構(gòu)域激活I(lǐng)FN-β 啟動刺激因子(IPS-1)，IPS-1 調(diào)節(jié)不同的調(diào)節(jié)子和激酶，誘導(dǎo)IRF3、IRF7 和NF-κB 通路激活。IRF3/IRF7、NF-κB 和AP-1 等轉(zhuǎn)錄因子一旦激活，將轉(zhuǎn)運入核，同cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的結(jié)合蛋白(CBP)一起誘導(dǎo)IFN-α和IFN-β 轉(zhuǎn)錄，調(diào)控IFN-α 和IFN-β 的產(chǎn)生。IFN-α和IFN-β 一旦產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外，通過自分泌和旁分泌的方式直接與IFN 受體結(jié)合，聯(lián)合JAK1 激酶的受體磷酸化，通過SH2 區(qū)的磷酸化作用激活STAT1 和STAT2 招募，磷酸化的STAT1 和STAT2與IFN 受體分離后，與IRF9 形成ISGF3 復(fù)合物，轉(zhuǎn)運到核后與ISRE 結(jié)合，導(dǎo)致上百種ISGs 轉(zhuǎn)錄，其中MxA、OAS-1/RNaseL、RIG-I/MDA5、ISG15 和PKR為5 種主要的ISGs［3］。許多ISGs 作為PRRs 識別病毒分子，放大信號通路，增加IFN 產(chǎn)生。本文對激活TLRs、RIG-I/MDA5、JAK-STAT 及ISGs 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 Toll 樣受體及信號通路

Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類蛋白質(zhì)家族，能特異地識別病原相關(guān)的分子模式(PAMPs)。TLRs 獨特的關(guān)鍵信號區(qū)域是位于每種TLR 胞內(nèi)區(qū)以及配體上的Toll 樣白介素-1 受體(TIR)區(qū)域。一旦識別TLRs，PAMPs 通過不同接頭蛋白的TIR 區(qū)域招募不同激酶，觸發(fā)不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致特定基因表達(dá)，參與清除入侵的病毒［4］，其中TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 與控制病毒感染密切相關(guān)［5］。

1.1 TLR3 TLR3 識別poly(I:C)和dsRNA，通過TIR 區(qū)與含有TIR 的接頭蛋白結(jié)合，間接激活I(lǐng)RF3、NF-κB 和AP-1 等轉(zhuǎn)錄因子。關(guān)于IRF3 的激活，TRIF 的N 末端區(qū)域通過NF-κB 活化激酶κ(NAK)-相關(guān)蛋白1(NAP1)和腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子3(TRAF3)結(jié)合TANK-結(jié)合激酶1(TBK-1)/IκB 激酶-ε(IKK-ε)，使IRF3 磷酸化，從而形成二聚體，轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核表達(dá)IFN-β［6］。至于NF-κB 的活化，TRIF 結(jié)合TRAF6 和受體相互作用蛋白1(RIP1)，TRAF6 是泛素連接酶，RIP1 通過TRAF6 的泛素化作用被轉(zhuǎn)化生長因子β 活化激酶(TAK)結(jié)合蛋白2(TAB2)和TAB3 識別，導(dǎo)致TAK1 激活，隨后IKKα 和IKKβ 磷酸化，這兩個活化的激酶使IκBα 磷酸化，IκBα 由于泛素化作用降解，釋放NFκB 到細(xì)胞核。TAK-1 也可激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase)、p38 和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，導(dǎo)致AP-1 家族成員的磷酸化與活化。IRF3、NF-κB 和AP-1 等因子的激活，觸發(fā)IFN-β 基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)IFN-β 產(chǎn)生［7］。

1.2 TLR7/8/9 TLR7/8 識 別19～21 bp 的dsRNA，TLR9 識別DNA 病毒基因組的非甲基化CpG DNA［8］。TLR7/8/9 這三種TLRs都錨定在內(nèi)體膜上，TLR3 以TRIF 為主要接頭蛋白，而TLR7/8/9 以MyD88 為接頭蛋白，誘導(dǎo)I 型IFN表達(dá)。TLR7/8 通過MyD88 結(jié)合TRAF6 和IL-1受體相關(guān)激酶1(IL-1 reporter associated kinase 1，IRAK-1)，起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致IRF-5 和IRF-7 激活。TLR9 在含有TRAF6 和IRAK-1，或者IRAK-4 激酶復(fù)合物的輔助下，促使MyD88 與IRF7 反應(yīng)。在不同細(xì)胞內(nèi)，不同IRAK 家族成員發(fā)揮不同的功能，在pDCs 中IRAK-1 發(fā)揮作用，在HEK細(xì)胞中則IRAK-4 起主要作用。IRF7 也可通過與MyD88 或TRAF6 作用而活化，IRF7/IRAK-1 復(fù)合物誘導(dǎo)IRAK-1 介導(dǎo)的IRF7 磷酸化，隨后磷酸化的IRF7 發(fā)生二聚化，轉(zhuǎn)運入核，誘導(dǎo)IFN-α 表達(dá)。在此過程中，參與NF-κB 活化的IKKα 起著重要作用［9］，因此IRAK4-IRAK1-IKKα 激酶級聯(lián)反應(yīng)可導(dǎo)致IRF7 激活。在pDCs 內(nèi)TLR7/8 和TLR9 通過MyD88 啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活I(lǐng)RF7 產(chǎn)生IFN-α，在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。

2 RIG-I/MDA5 通路

2.1 RIG-I 和MDA5 識別RNA 的特征 維甲酸誘導(dǎo)基因(RIG-I)和MDA5 都是細(xì)胞漿基質(zhì)中識別dsRNA 的受體，二者結(jié)構(gòu)相似，功能不同。MDA5 識別小核糖核酸病毒和poly(I:C)，RIG-I 則識別仙臺病毒和流感病毒等負(fù)鏈RNA 病毒，poly(I:C)常用于RIG-I/MDA5 通路的激活［11］。RIG-I 在體外識別RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，5'端具有三磷酸基團(tuán)的ssRNA 和dsRNA 都能通過RIG-I 激活I(lǐng) 型IFN 產(chǎn)生［12］，那么宿主的細(xì)胞漿基質(zhì)中的受體是如何區(qū)分病毒RNAs和自身RNAs，答案不難但卻非常復(fù)雜。RIG-I 不能識別5'端含有單磷酸的細(xì)胞rRNA和tRNA;其次，由于mRNA 和核內(nèi)小RNA(snRNA)5'端具有甲基鳥苷帽子結(jié)構(gòu)，可保護(hù)RNAs 不被其識別和降解。此外，細(xì)胞RNAs 即使含有5'三磷酸鹽，經(jīng)常被尿苷、2-硫代尿苷或者2'-O-甲基化轉(zhuǎn)錄后修飾，這些修飾能抑制RNA 免疫刺激活性［13］。細(xì)胞RNA 在細(xì)胞環(huán)境下一般不以“裸”分子的形式存在，而是與眾多的RNA 結(jié)合蛋白形成復(fù)合物。因此，這種復(fù)合物的蛋白能使特定種類的RNA 標(biāo)記為“自我”成分而不被識別。

圖1 調(diào)控抗病毒干擾素產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制簡圖［10］Fig.1 Diagram of signal transduction mechanism of regulation of antiviral interferon production［10］

2.2 RIG-I/MDA5 通路的轉(zhuǎn)導(dǎo) RIG-I 的C 末端含有DExD/H-box RNA 解旋酶結(jié)構(gòu)域，N 末端含有兩個半胱天冬蛋白酶招募結(jié)構(gòu)域(CARDs)，RIG-I 通過這些結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)I 型IFN 產(chǎn)生。只有RNA 分子能被RIG-I 的RNA 解旋酶結(jié)構(gòu)域有效地識別和展開，并通過CARD 誘導(dǎo)I 型IFN 產(chǎn)生。因而RIG-I的RNA 解旋酶結(jié)構(gòu)域作為一個開關(guān)在控制CARD是否暴露并激活下游過程中發(fā)揮作用。一旦RIG-I的CARD 激活，通過構(gòu)象變化而暴露，招募另一個含有CARD 蛋白的IPS-1 作為接頭蛋白通過CARDCARD 相互作用。RIG-I 與IPS-1 之間的CARDCARD 相互作用對于dsRNA 誘導(dǎo)的NF-κB、IRF3 和IRF7 的激活非常重要［14］。關(guān)于IRFs 的活化，IPS-1通過TRAF3 轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路，TRAF3 參與TLR 激活通路，這樣RIG-I-IRF 通路與NEMO 和TANK 作用，促進(jìn)TBK1 和IKKε 招募，形成IPS-1-TRAF 復(fù)合物，該復(fù)合物導(dǎo)致TBK1/IKKε 活化，使得IRF3 和IRF7磷酸化，磷酸化的IRF3 和IRF7 形成同源或異源二聚體并轉(zhuǎn)運入核［15］。關(guān)于NF-κB 的活化，同TLR3刺激的NF-κB 活化相似，IPS-1 與TRAF2、TRAF6 和RIP1 相互作用，一旦入核，活化形式的IRF3 或IRF7、NF-κB 及AP-1 與其他共轉(zhuǎn)錄因子，如CREB結(jié)合蛋白(CBP)形成IFN 增強(qiáng)子，產(chǎn)生IFN-β 和IFN-α。

與TLRs 相比，RIG-I 介導(dǎo)的信號通路相對更為重要，敲除不同細(xì)胞RIG-I 和TLR 基因表明，RIG-I和TLR 途徑調(diào)控不同抗病毒信號通路。DCs 和成纖維細(xì)胞敲除RIG-I 基因，IFN-β 的誘導(dǎo)能力顯著下降，然而漿樣DCs 敲除RIG-I 基因，誘導(dǎo)IFN-β 能力沒有變化，但缺少MyD88 和TRIF 時有所改變［16］。RIG-I 和TLR 通路以多種方式識別不同類型細(xì)胞中的病毒，使宿主更有效地抵抗病毒。除RIG-I 外，MDA5 和LPG2 也具有DExD/H-box RNA解旋酶，與RIG-I 相似，MDA5 的N 末端含有兩個CARDs 結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)誘導(dǎo)IFN-β 產(chǎn)生，然而LPG2 缺少CARD 結(jié)構(gòu)域，因而被認(rèn)為是RIG-I 通路的負(fù)調(diào)控因子［17］。

3 IPS-1 通路

IPS-1 在調(diào)控I 型IFN 產(chǎn)生的信號通路中發(fā)揮重要作用，IPS-1 過表達(dá)導(dǎo)致IRF3 和NF-κB 激活，誘導(dǎo)I 型IFN 產(chǎn)生。IPS-1 除了含有N 端CARD 結(jié)構(gòu)域，還含有脯氨酸區(qū)、錨定在線粒體外膜上的C端疏水跨膜區(qū)，突變分析表明CARD 和跨膜區(qū)對于維持IPS-1 功能非常重要［18］。IPS-1 的錯誤定位極大破壞誘導(dǎo)IFNs 能力，暗示線粒體參與先天性免疫。IPS-1 可與Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域作用，直接結(jié)合到IKKα 和IKKβ 激酶的C 末端區(qū)域，激活NF-κB通路。FADD 和線粒體分別通過招募凋亡因子和釋放前凋亡蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，暗示細(xì)胞凋亡是先天性免疫反應(yīng)的一種，IPS-1 可能作為細(xì)胞凋亡和I 型IFN 反應(yīng)的橋梁發(fā)揮作用［19］。

4 JAK-STAT 通路

IFN-β 產(chǎn)生后，應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)入第二階段，在此階段上調(diào)數(shù)百個基因，參與多種功能。這些基因被稱為干擾素刺激基因(ISGs)，JAK-STAT 是調(diào)控Ⅰ型IFN 產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，表達(dá)ISGs 的途徑。

IFN-α 和IFN-β 與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，啟動JAK-STAT 信號通路，受體結(jié)合激活Janus 激酶(JAK)和TYK2，使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)與STAT2 磷酸化。磷酸化的STAT1 和STAT2 與IRF9 形成異源二聚體，形成干擾素刺激基因因子3(ISGF3)復(fù)合物，ISGF3 復(fù)合物入核，與干擾素刺激反應(yīng)元件(ISRE)結(jié)合，誘導(dǎo)由ISRE 產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)。一旦ISGF3 復(fù)合物易位到細(xì)胞核，磷酸化的STAT1 和STAT2 發(fā)生去磷酸化，重新回到細(xì)胞質(zhì)。JAK-STAT 信號通路由三個STAT 負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制劑調(diào)節(jié):抑制細(xì)胞因子信號(SOCS)家族通過抑制JAK 與IFN 受體結(jié)合，從而抑制STATs 磷酸化;PIAS 蛋白家族包括PIAS1、PIAS3 和PIASy，PIAS1 和PIAS3 分別競爭STAT1 和STAT3 啟動子區(qū)域內(nèi)的ISRE，從而抑制ISGs 表達(dá);PIASy 可以召集其他細(xì)胞因子抑制STAT1 轉(zhuǎn)錄激活［20］。PIAS 不僅為STATs 的負(fù)調(diào)控子，也是一個SUMO E3 連接酶［21］。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)是小泛素樣修飾蛋白，負(fù)責(zé)許多蛋白質(zhì)翻譯后修飾。泛素樣修飾蛋白的修飾過程與泛素化反應(yīng)相似，一個SUMO 分子通過E3 連接酶特異序列識別，與靶蛋白結(jié)合。SUMO E3 連接酶是某些蛋白質(zhì)泛素化所必需的，調(diào)控降解過程。SUMO 通過SENP1 的早期解離增強(qiáng)了STAT1 轉(zhuǎn)錄活性，證明SUMO 化修飾對STAT1 活性的負(fù)調(diào)控作用。SUMO 化修飾通過調(diào)節(jié)STAT1 的DNA 結(jié)合特性參與調(diào)控STAT1 反應(yīng)［22］。

5 IFN 誘導(dǎo)基因及其功能

目前已鑒定出300 多種ISGs，只有幾種與誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重塑的細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及翻譯后修飾有關(guān)，從而建立宿主細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)。其他許多ISGs 作為模式識別受體(PRRs)去識別病毒分子或編碼轉(zhuǎn)錄因子，參與放大信號通路，增加IFN 產(chǎn)生，防止病毒傳播。ISG15、RIG-I/MDA5、抗粘病毒A(MxA)、核糖核酸酶L(RNaseL)和蛋白激酶K(PKR)作為抗病毒的效應(yīng)因子研究最為廣泛［23］。

ISG15 為泛素同系物，由ISG15 介導(dǎo)的ISG 化具有調(diào)控IFN 產(chǎn)生的功能。ISG15 的C 端含有LRLRGG 序列，由于泛素化作用LRLRGG 序列暴露出來，ISG 化可通過泛素激活酶、泛素結(jié)合酶及泛素連接酶與底物結(jié)合。泛素激活酶對于ISG15 是特異的，但泛素結(jié)合酶和泛素連接酶既可與泛素結(jié)合，也可與ISG15 結(jié)合。目前已經(jīng)鑒定至少有158 種ISG15 編碼蛋白，其中一些在I 型IFN 產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，包括JAK1、STAT1、RIG-I、Mx1 和PKR［24］。與泛素化相似，ISG 化是可逆反應(yīng)，然而，與Lys48連接泛素的誘導(dǎo)蛋白酶體降解功能不同，ISG 化與K63 連接泛素相似，可招募其他蛋白并調(diào)節(jié)酶的功能。ISG 化可阻止病毒介導(dǎo)的IRF3 降解，IRF3 也可被大量的分泌到細(xì)胞外，作為細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［25］。

Mx 蛋白屬于GTP 酶類，參與細(xì)胞內(nèi)的囊泡轉(zhuǎn)運和細(xì)胞器的動態(tài)平衡，也是IFN 誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)的重要組成部分。Mx 蛋白的獨特屬性是其廣泛的抗RNA 病毒活性，包括流感病毒和布尼亞病毒家族的成員。Mx 蛋白具有一個大的N 末端GTP 酶區(qū)域，一個中心結(jié)構(gòu)域(CID)和一個C 末端亮氨酸拉鏈(LZ)結(jié)構(gòu)域，CID 和LZ 結(jié)構(gòu)域識別目標(biāo)病毒核衣殼結(jié)構(gòu)。正常環(huán)境下MxA 蛋白在細(xì)胞內(nèi)膜累積，通過與LZ 和CID 相互作用形成寡聚體。在病毒感染過程中MxA 單體被釋放，結(jié)合到病毒的核衣殼或其他部位，使其降解［26］。

2'，5'-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)在細(xì)胞內(nèi)低水平表達(dá)，由Ⅰ型IFN 負(fù)調(diào)控。OAS1 以非活性單體形式在細(xì)胞質(zhì)中存在，一旦被病毒RNA 激活，發(fā)生寡聚體化并形成四聚體，四聚體合成2'-5'寡聚腺苷酸(2-5A)，2-5A 與RNaseL 結(jié)合觸發(fā)RNaseL 二聚化，使其切割細(xì)胞和病毒RNAs，被切割的RNAs 激活細(xì)胞質(zhì)PRRs，如RIG-I 和MDA5［27］。

PKR 屬于蛋白激酶家族，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成。PKR 在所有組織中以基本水平組成型表達(dá)，由Ⅰ型和Ⅲ型IFN 負(fù)調(diào)控。正常環(huán)境下PKR 以滅活的單體形式存在，感染時病毒RNA 引起PKR 構(gòu)象變化，使ATP 結(jié)合到PKR 的C 末端激酶區(qū)域激活PKB，激活的PKB 使真核起始因子2α(EIF2α)二聚化和磷酸化，以阻止翻譯過程［28］。PKB 的N 末端有兩個RNA 結(jié)合基序(RBMs)，這些基序通過識別特定的高級結(jié)構(gòu)與RNA 結(jié)合。盡管RNAs 只需要16 bp的RNA 與PKB 結(jié)合，但是較長的RNA 部分參與RBMs 和PKR 過程，激活激酶功能。大于30 bp 的dsRNAs 可有效地激活PKB，具有5'-三磷酸的47nt的ssRNA 激活PKB 能力非常有限［29］。

ISG15 和MxA 只在IFN 刺激之后產(chǎn)生，OASRNaseL 和PKR 以低水平組成型表達(dá)，卻在I 型IFN刺激后表達(dá)增加。OAS 和PKR 組成型表達(dá)表明，這些蛋白不僅作為效應(yīng)因子發(fā)揮作用，而且也可作為dsRNA 特異的PRRs 觸發(fā)抗病毒反應(yīng)［30］。

6 結(jié)語

先天性免疫是宿主抗病毒感染的第一條防線，Ⅰ型IFN 發(fā)揮著重要作用。病毒可操縱TLRs、RIGI/MDA5、IPS-1 和JAK-STAT 等通路來調(diào)控IFN 產(chǎn)生，并通過ISGs 調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。調(diào)控IFN 產(chǎn)生的反應(yīng)可分為兩個階段，第一階段主要通過TLRs、RIGI/MDA5 和IPS-1 通路調(diào)控IFN-α 和IFN-β 的產(chǎn)生。其中TLR3 通過激活NF-κB、IRF3 和AP-1 等轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)IFN-β 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，TLR7/8 和TLR9 通過MyD88 啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活I(lǐng)RF7，產(chǎn)生IFN-α;RIG-I/MDA5 通過DExD/H-box RNA 解旋酶結(jié)構(gòu)域和CARD 結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)I 型IFN 產(chǎn)生;IPS-1 的CARD結(jié)構(gòu)域和疏水跨膜區(qū)對其發(fā)揮功能尤為重要，IPS-1過表達(dá)導(dǎo)致IRF3 和NF-κB 激活，誘導(dǎo)I 型IFN 產(chǎn)生。第一階段產(chǎn)生的IFN 與IFN 受體結(jié)合，反應(yīng)進(jìn)入第二階段，激活JAK-STAT 通路，轉(zhuǎn)導(dǎo)IFN 信號通路，誘導(dǎo)MxA、OAS-1/RNaseL、RIG-I/MDA5、ISG15和PKR 等ISGs 的表達(dá)，許多ISGs 作為PRRs 識別病毒分子，放大信號通路，增加IFN 產(chǎn)生。深入開展調(diào)控I 型IFN 產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究，將有助于更好地了解病毒逃避宿主免疫反應(yīng)機(jī)制。對于病毒性疾病造成的免疫抑制，未來的研究方向可能為鑒定IFN 調(diào)節(jié)活性位點，應(yīng)用感染性cDNA 構(gòu)建基因突變株，消除病毒的免疫抑制功能，更好地控制病毒性疫病的流行。

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