荊贊革裴徐梨唐征張小玲羅天寬劉慶朱世楊

（1.溫州科技職業(yè)學院 浙南作物育種重點實驗室，溫州 325006；2.南京農業(yè)大學 作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室，南京 210095）

青花菜及其近緣種親緣關系SRAP標記分析

荊贊革1裴徐梨2唐征1張小玲1羅天寬1劉慶1朱世楊1

（1.溫州科技職業(yè)學院 浙南作物育種重點實驗室，溫州 325006；2.南京農業(yè)大學 作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室，南京 210095）

利用SRAP分子標記技術，對青花菜與其近緣種進行遺傳多樣性分析。28對SRAP引物共產生302條譜帶，其中多態(tài)性譜帶203條，多態(tài)率為67.22%，表明種質間存在較高的多態(tài)性。相似系數分析表明，其變異范圍為0.461 5-0.900 6，平均遺傳相似系數為0.693 6?！G地’和‘矮抗青’之間的親緣關系最遠，遺傳相似系數為0.461 5；‘Wzvcst-09-224’和‘Wzvcst-09-225’親緣關系最近，遺傳相似系數為0.900 6。聚類分析可將16個材料分為兩大類，第Ⅰ類包括蕓薹屬甘藍種蔬菜，第Ⅱ類為蕓薹屬白菜種。揭示了青花菜及其近緣變種間具有部分相似的遺傳基礎，親緣關系較近。結果表明，同一地域或來源的材料間具有較為相近的遺傳背景，親緣關系相對較近。研究結果有助于青花菜與其近緣種間種質資源分類和優(yōu)異基因利用，加速青花菜新品種選育進程。

青花菜 SRAP 遺傳多樣性 親緣關系分析

青花菜（Brassica oleraceaL. var.italica）別名西蘭花、綠菜花，原產于地中海東部沿岸地區(qū)，是十字花科蕓薹屬甘藍種中以綠或紫色花球為產品的一個變種。目前，青花菜已逐漸成為我國重要的出口創(chuàng)匯蔬菜之一，但其育種基礎相對落后，多數青花菜種子仍依靠進口。隨著青花菜產業(yè)的發(fā)展和生產需求，對青花菜新品種進行自主研發(fā)迫在眉睫。

優(yōu)質種子種苗是蔬菜生產中極其重要的生產資料，近年來許多種子單位對青花菜開展了育種工作，大量優(yōu)質新品種不斷涌入市場。然而由于青花菜品

種間遺傳背景狹窄，產品更新速度較慢。青花菜是由甘藍演化而來，是野生甘藍演化為木立花椰菜過程中出現(xiàn)的一個亞變種［1］，同其它甘藍變種間具有良好的雜交親和性，因此研究青花菜及其近緣種之間的遺傳多樣性，促進優(yōu)異基因轉移，是進行青花菜新品種選育的重要方式之一。

常規(guī)的田間植株形態(tài)鑒定和同工酶鑒定都存在易受環(huán)境條件、所取材料部位等影響的缺點，而近年來發(fā)展起來的DNA分子標記技術，如隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、ISSR、簡單重復序列（SSR）、AFLP、相關序列擴增多態(tài)性（SRAP）等，以其快速、準確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，現(xiàn)已成功應用于辣椒［2］、莼菜［3］、苦瓜［4］、黃瓜［5］、茄子［6］、蘿卜［7］、大白菜［8］、西瓜［9］等多種作物，在種質資源鑒定［10，11］、遺傳材料創(chuàng)建［12］、遺傳多樣性［13，14］、品種鑒定［15，16］等方面都得到了較好的應用。目前對青花菜品種及其近緣種親緣關系分析方面的研究報道較少。本研究運用SRAP分子標記技術對青花菜及其近緣種進行品種鑒定與親緣關系分析，旨在為青花菜與其近緣種間的利用與種質資源分類提供技術基礎和理論依據，從而有助于優(yōu)異近緣種基因轉移，加速青花菜新品種選育進程。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料從浙江各地搜集，共15份甘藍變種類蔬菜，包括10份青花菜品種和2份花椰菜地方品種，甘藍、苤藍、芥藍各1份，以不結球白菜作為對照（表1）。試驗材料種植于溫州科技職業(yè)學院試驗田中，常規(guī)田間管理。

表1 材料名稱和編號

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取適量幼嫩葉片，液氮研磨粉碎后，采用參照植物基因組DNA提取試劑盒操作方法提取基因組總DNA。提取試劑盒（離心柱型）由TIANGEN生物技術有限公司（北京）生產。1.2.2 SRAP-PCR擴增與產物檢測 試驗選用了4個正向引物和12個反向引物（表2），由上海生工生物工程有限公司合成。以基因組DNA為模板進行PCR擴增，總反應體系為16 μL［17］：其中包括15 ng基因組DNA，2.0 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，1 UTaqDNA 聚合酶（TaKaRa），0.25 μmol/L引物。

PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1.5 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min，低溫保存。

擴增產物加4 μL上樣緩沖液。采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠，1×TBE 緩沖液，60 V預電泳30 min后，120 V恒壓電泳1-2 h，至指示劑遷移至凝膠下

部時，結束電泳。采用AgNO3染色法檢測電泳結果。

表2 用于遺傳多樣性分析的SRAP引物序列

1.2.3 數據處理與分析 對SRAP-PCR電泳圖譜進行分析，統(tǒng)計清晰的SRAP位點，同一位置上出現(xiàn)譜帶的記為“1”，未出現(xiàn)譜帶的記為“0”。應用統(tǒng)計分析軟件NTSYS pc version2.10e計算相似性系數，按UPGMA進行聚類分析，繪制聚類分析樹狀圖。

2 結果

2.1 SRAP引物擴增多態(tài)性分析

從48對SRAP引物中篩選出了28對引物組合對16份材料基因組DNA進行了擴增，共產生了302個位點，平均每個引物擴增出10.79個位點。多態(tài)性位點共203條，平均多態(tài)性位點7.25個，多態(tài)率為67.22%，表明甘藍變種間多態(tài)性高，遺傳多樣性較豐富，遺傳背景也相對復雜。

2.2 遺傳相似性分析

根據28對SRAP引物擴增結果，通過NTSYS pc version2.10e軟件計算出品種間遺傳相似系數（GSC）的變異范圍為0.461 5-0.900 6，平均遺傳相似系數為0.693 6?！G地’（3）和‘矮抗青’（16）之間的親緣關系最遠，遺傳相似系數為0.461 5；‘Wzvcst-09-224’（11）和‘Wzvcst-09-225’（12）親緣關系最近，遺傳相似系數為0.900 6（表3）。

2.3 聚類分析

采用 UPGMA 方法進行聚類分析，得到16份材料的遺傳聚類圖（圖1）。在遺傳相似系數0.54處，可將供試材料分為2類：Ⅰ類包括10份青花菜（1-10）、2份花椰菜（11、12），甘藍（13）、苤藍（14）、羽衣甘藍（15）各1份，共15份材料；Ⅱ類僅包括1個材料，即不結球白菜‘矮抗青’（16）。第Ⅰ類15份材料均屬于蕓薹屬甘藍種蔬菜，第Ⅱ類為蕓薹屬白菜種，與植物學分類結果一致。二者雖同屬十字花科蕓薹屬，卻為不同的種，親緣關系相對較遠。從形態(tài)上看，甘藍變種植株相對高大，主根發(fā)達，葉片寬大，被有蠟粉，葉表面常呈灰綠色或藍綠色；不結球白菜植株相對矮小，淺根系，須根發(fā)達。葉

片較小，葉色淡綠至墨綠，葉柄肥厚，白色或綠色。二者間植物學性狀差異較大，不結球白菜與甘藍變種間差異較大，分別形成獨特的類群。在遺傳相似系數為 0.67處，第Ⅰ類又可以分成2個亞組，第一亞組包括10份青花菜品種，第二亞組包括花椰菜、甘藍、苤藍和羽衣甘藍。第一亞組中青花菜No.1-7大多來源于日本，聚為一個小組，表明同一地域來源的材料間具有較為相近的遺傳背景。綠珍F1（9）和美好F1（10）來源于臺灣長勝種苗股份有限公司，聚類在同一小組，推測可能采用了同一親本或親本來源相同；本研究結果表明同一來源或同一地理區(qū)域的品種間具有相對較近的遺傳基礎。第二亞組中Wzvcst-09-224（11）和Wzvcst-09-225（12）搜集于溫州市洞頭縣，為松散型花椰菜地方品種，二者植物學性狀相近，相似系數高，聚類在同一小組。表明二者間基因組信息相近，具有較低的遺傳多樣性。

表3 16個種質間的相似系數

圖1 基于SRAP標記的16份種質聚類圖

3 討論

本試驗中28對多態(tài)性引物組合可檢測到302個位點，其中多態(tài)性位點203個，多態(tài)率為68.26%?？婓w云等［18］采用SRAP標記技術對甘藍種質的遺傳多樣性和親緣關系進行了分析，26個SRAP 引物組合可擴增出穩(wěn)定清晰條帶439條，其中多態(tài)性條帶227條，多態(tài)性位點比率為51.7%。二者平均每個引物組合擴增條帶數和多態(tài)性比例相差較大，推測由不同的引物組合和試驗材料所引起。

甘藍類蔬菜原產地中海沿岸和西北歐的海濱，先經甘藍野生種（Brassico oleraceavar.oleracea）栽培馴化成羽衣甘藍，而后分化出分枝細莖、髓狀莖和高莖3個類型。結球甘藍由不分枝類型的羽衣甘藍分化而來，球莖甘藍起源于髓狀莖類型。分枝細莖類型進化成木立花椰菜，青花菜和花椰菜均為木立花椰菜的亞變種［1］。Song等［19］采用RFLP分子標記分析了蕓薹屬植物野生種和栽培種的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)野生甘藍獨立于甘藍栽培種聚為一類，推測甘藍類作物可能是起源于某一種野生甘藍。田源等［20］利用RAPD標記對甘藍類蔬菜材料進行親緣關系和遺傳多樣性分析。UPGMA分析結果可以將結球甘藍、抱子甘藍、羽衣甘藍、青花菜、花椰菜、皺葉甘藍清楚區(qū)分為6組，從分子生物學的角度分析驗證了它們之間的親緣進化關系。抱子甘藍植物學形態(tài)特征特性與普通甘藍相比差異明顯，遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)與結球甘藍材料親緣關系相對較遠，獨立聚類［8］。周禹等［21］對芥藍、青花菜、結球甘藍和球莖甘藍及它們之間的24個雜交組合的主要植物學性狀進行聚類分析，顯示芥藍與結球甘藍的親緣關系較近，推測芥藍是甘藍種的一個變種。

甘藍變種中青花菜和花椰菜間的親緣關系較近［22］。通過SSR標記可將結球甘藍與青花菜區(qū)分開來，而青花菜與花椰菜卻無十分嚴格的界線，表明花椰菜遺傳多樣性水平較低［23］。孫德嶺等［24］利用AFLP標記對花椰菜、青花菜、紫花菜和黃花菜自交系的親緣關系進行了研究，發(fā)現(xiàn)黃花菜、紫花菜和青花菜間的親緣關系較近。本研究中聚類分析可將供試材料分為甘藍種和白菜種兩大類，表明甘藍變種間具有部分相似的遺傳基礎，親緣關系較近。10份青花菜與所選松散型花椰菜品種聚為不同的亞組，表明其之間具有較高的遺傳多樣性。

蕓薹屬植物的進化研究表明，其三大基本類群，白菜組最原始、芥菜組進化程度稍高、甘藍組進化程度最高［25］，本試驗中通過NTSYS軟件計算得出的品種間遺傳相似系數中，‘綠地’（甘藍組）和‘矮抗青’（白菜組）的遺傳相似系數最小，親緣關系較遠。甘藍組中的5種類型間遺傳相似系數相對較大，表明它們存在特殊的進化關系。

遺傳變異是蔬菜品種改良和選育的重要基礎。蔬菜育種中，變種內變異往往不能充分滿足新品種

對抗病性和抗逆性的需求，而通過雜交引入變種間或種間變異是非常重要的技術手段。大量研究表明，青花菜近緣種質資源中具有多種抗性、品質等優(yōu)良基因，因此通過各種技術手段將這些優(yōu)異因導入青花菜，可有效促進現(xiàn)有品種改良和新品種選育。

4 結論

利用SRAP分子標記技術，對青花菜與其近緣種進行了遺傳多樣性分析。28對SRAP引物共產生多態(tài)性譜帶203條，多態(tài)率為67.22%，表明品種間存在較高的多態(tài)性。SRAP標記聚類分析表明，16份材料的相似系數變異范圍為0.461 5-0.900 6，平均遺傳相似系數為0.693 6。聚類分析可將試驗材料分為二大類，第Ⅰ類包括蕓薹屬甘藍種蔬菜，第Ⅱ類為蕓薹屬白菜種。表明青花菜及其近緣變種間具有部分相似的遺傳基礎，親緣關系較近。聚類結果還表明同一地域或來源的材料間具有較為相近的遺傳背景，親緣關系相對較近。

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（責任編輯 馬鑫）

Genetic Diversity and Relationship Analysis of Broccoli with Its Related Species by SRAP Markers

Jing Zange1Pei Xuli2Tang Zheng1Zhang Xiaoling1Luo Tiankuan1Liu Qing1Zhu Shiyang1
（1. Zhenan Key Laboratory of Crop Breeding，Wenzhou Vocational College of Science and Technology，Wenzhou 325006；2. State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，Nanjing Agricultral University，Nanjing 210095）

In this study, we analyzed genetic diversity and relationship between broccoli and its related species by SRAP molecular markers. Using 28 SRAP primer combinations, a total of 302 amplified fragments were detected and 203 were polymorphic, with polymorphism rate 67.22%, indicating high polymorphism among these germplasm. Similarity coefficient analysis showed that the variation ranged from 0.461 5 to 0.900 6, and the average genetic similarity coefficient was 0.693 6. ‘Lü di’ and ‘Ai kang qing’ had the farthest genetic relationship with genetic similarity coefficient 0.461 5. By contrast, the relationship was closest between ‘Wzvcst-09-224’ and ‘Wzvcst-09-225’, with genetic similarity coefficient 0.900 6. Cluster analysis divided 16 germplasm into two major clusters. Class I contained Brassica oleracea, and class II only had one member Chinese no heading cabbage. The result of cluster indicated that the genetic basis had more similarity between broccoli and its related species, with a closer relationship, comparing with Brassica campestris ssp. chinensis Makino. The results also showed that the same geographic or origin could make the germplasm had relatively similar genetic background and closer genetic relationship. The research could be helpful to germplasm classification and excellent genes utilization for broccoli and its relative species, to speed up the breeding process.

Broccoli SRAP Genetic diversity Genetic relationship

2013-10-23

浙江省自然基金項目（LY12C15009），浙江省農業(yè)新品種選育重大科技專項（2012C12903-3-3），浙江省重大科技項目（2010C12004），溫州科技局項目（N20090016）

荊贊革，男，博士研究生，助理研究員，研究方向：蔬菜遺傳育種與生物技術；E-mail：jingzange@aliyun.com

唐征，男，副教授，研究方向：蔬菜遺傳育種與生物技術；E-mail：tzeng05@163.com