許 莉段逸群?陳宏翔曾志良王 輝

·論著·

雌激素對白念珠菌誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞NLRP3表達的影響

許 莉1段逸群1?陳宏翔2曾志良1王 輝1

目的: 確定雌激素對白念珠菌誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞NLRP3炎性體基因表達的影響。方法: 體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞,將其分為5組:空白對照組、白念珠菌組、白念珠菌＋10－10mol/L 17β－雌二醇組、白念珠菌＋10－9mol/L 17β－雌二醇組和白念珠菌＋10－8mol/L 17β－雌二醇組。熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)NLRP3mRNA表達；Western Blot檢測細胞內(nèi)NF－κBp65和caspase－1p20的活性；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組細胞培養(yǎng)上清液中白細胞介素－1β(IL－1β)的含量。結(jié)果: 巨噬細胞在白念珠菌的刺激下,與空白對照組比較細胞內(nèi)NLRP3mRNA的表達、NF－κB和caspase－1p20活性和細胞培養(yǎng)上清液中的IL－1β含量均明顯升高(P＜0．01)；加入雌激素干預(yù)后,隨著雌激素濃度的增高,細胞內(nèi)NLRP3mRNA表達、NF－κB和caspase－1p20活性、細胞培養(yǎng)上清液中的IL－1β含量明顯低于對照組(P＜0．01)。結(jié)論: 雌激素可能通過抑制NF－κB活性抑制白念珠菌誘導(dǎo)的NLRP3表達、caspase－1的活化和IL－1β的分泌。

白念珠菌； 雌激素； NLRP3； 核因子－κB； 白細胞介素－1β

念珠菌性外陰陰道炎是一種常見的陰道黏膜真菌感染性疾病,病原菌大部分為白念珠菌。白念珠菌廣泛存在于自然界,是人體正常菌群之一,屬于胃腸道和女性下生殖道的正常共棲菌,為條件致病菌。1現(xiàn)已明確白念珠菌引起的感染常與性激素尤其是雌激素的存在有關(guān)。2但雌激素是通過何種機制來抑制免疫應(yīng)答,最終導(dǎo)致念珠菌感染至今仍未闡明。NLRP3炎性體是一類大分子蛋白質(zhì),它通過活化caspase－1,調(diào)控IL－1β等促炎細胞因子的成熟和分泌,在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。3IL－1β為白念珠菌感染時的重要炎癥介質(zhì),它可通過活化炎性細胞而參與宿主抗白念珠菌的免疫反應(yīng)。4Bauernfeind等發(fā)現(xiàn)脂多糖誘導(dǎo)人外周血單核細胞NLRP3轉(zhuǎn)錄的增加依賴核因子(NF)－κB通路的活化。5此外,有研究表明雌激素可影響NF－κB的分泌和表達。6我們推測雌激素可通過影響NF－κB表達進而影響白念珠菌誘導(dǎo)的NLRP3表達及IL－1β分泌。本實驗建立小鼠腹腔巨噬細胞白念珠菌感染模型,觀察雌激素對白念珠菌刺激后NLRP3炎性體表達的影響,為雌激素在白念珠菌致病機制中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 主要試劑 RPMI l640培養(yǎng)基(Gibco公司),小牛血清(杭州四季青生物工程公司),17β－雌二醇(sigma),Trizol(invitrogen),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO),SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(Takara公司), anti－NF－κBp65單抗(Santa),anti－caspase－1p20單抗(Santa),IL－1βELISA試劑盒(晶美生物制劑公司)。

1．2 菌株 白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231由澳大利亞悉尼Westmead醫(yī)院感染性疾病和微生物研究中心提供。白念珠菌菌株實驗前2天經(jīng)培養(yǎng)基27℃?zhèn)鞔囵B(yǎng),取少量菌落于滅菌的PBS中,1500 r/min離心8 min,洗滌2次,將菌液調(diào)成106細胞/mL,臺盼藍染色證實＞95%為活細胞,顯微鏡下觀察＞95%為白念珠菌酵母。

1．3 腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)及處理 雄性BALB/c小鼠(6～8周齡,質(zhì)量18～20 g)購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。常規(guī)分離小鼠腹腔巨噬細胞,加入10 mL含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,細胞調(diào)整為2×105細胞/m L接種于6孔板中,置37℃培養(yǎng)。待細胞貼壁后,更換RPMI 1640培養(yǎng)基,細胞分為5個實驗組:(1)空白對照組:用含10%胎牛血清的RPMI l640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)8 h；(2)白念珠菌組:加入106CFU/mL白念珠菌懸液作用8 h；(3)白念珠菌＋10－10mol/L 17β－雌二醇組:預(yù)先用10－10mol/L 17β－雌二醇作用細胞2 h,再加入106CFU/mL白念珠菌懸液作用8 h；(4)白念珠菌＋10－9mol/L 17β－雌二醇組:預(yù)先用10－9mol/L 17β－雌二醇作用細胞2 h,再加入106CFU/m L白念珠菌懸液作用8 h；(5)白念珠菌＋10－8mol/L 17β－雌二醇組:預(yù)先用10－8mol/L 17β－雌二醇作用細胞2 h,再加入106CFU/mL白念珠菌懸液作用8 h。

1．4 SYBR green熒光定量PCR檢測細胞中NLRP3 mRNA表達 用Trizol試劑提取細胞總RNA,取1μg總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄按照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑說明操作。RT－PCR所用引物序列如下:NLRP3上游:5'－CGAGACCTCTGGGAAAAAGCT－3',下游:5'－GCATACCATAGAGGAATGTGATGTACA－3'；內(nèi)參β－actin:上游5'－TGTCCCTGTATGCCTCTGG－3',下游:5'－CCTTTAGCACGCACTGTAG－3'。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火30 s,40個循環(huán)。β－actin作為內(nèi)參照,NLRP3對β－actin的相對表達量用倍數(shù)表示,計算公式為2－△△CT,其中CT值表示熒光信號強度達到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù),△CT＝目的基因CT－內(nèi)參基因CT,△△CT＝實驗組△CT－對照組△CT。

1．5 免疫印跡分析NF－κBp65和caspase－1p20蛋白表達 分別提取培養(yǎng)細胞的胞漿蛋白和胞核蛋白。按Lowry比色法,以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,測定樣品蛋白濃度。胞漿蛋白用作caspase－1p20蛋白Western Blot分析,核蛋白用作NF－κBp65蛋白Western Blot分析。取各組不同組分蛋白樣品15μL(含胞漿蛋白60μg,核蛋白75μg),經(jīng)10%SDS－PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移膜,加入稀釋后的一抗37℃孵育1 h,特異性二抗及SPHRP37℃孵育1 h,用0．05%DAB緩沖液避光顯色。

1．6 細胞培養(yǎng)上清中IL－1β含量的測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)。按照試劑盒說明進行,實驗完成后用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度值,根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,用間接法讀各樣品的IL－1β含量。

1．7 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)。應(yīng)用SPSS 15．0軟件進行統(tǒng)計。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 細胞內(nèi)NLRP3 mRNA表達的變化 RT－PCR結(jié)果顯示,白念珠菌刺激巨噬細胞后,細胞內(nèi)NLRP3 mRNA表達明顯增加,與空白對照組比較,差異有顯著性(P＜0．01)。加入雌激素干預(yù)后,隨著雌激素濃度的增高,細胞內(nèi)NLRP3 mRNA表達逐漸降低。加入10－9mol/L或10－8mol/L17β－雌二醇能有效抑制白念珠菌刺激引起的細胞內(nèi)NLRP3 mRNA表達,與白念珠菌組比較,差異有顯著性(P＜0．01),見圖1。

圖1 細胞內(nèi)NLRP3 mRNA熒光定量PCR結(jié)果

2．2 細胞內(nèi)NF－κBp65和caspase－1p20蛋白表達的變化 免疫印跡檢測結(jié)果顯示,白念珠菌刺激巨噬細胞后,細胞內(nèi)NF－κBp65和caspase－1p20蛋白表達是空白對照組的4．63和5．16倍(均P＜0．01)。加入雌激素干預(yù)后,隨著雌激素濃度的增高,細胞內(nèi)NF－κBp65和caspase－1p20蛋白表達逐漸降低。加入10－9mol/L或10－8mol/L 17β－雌二醇能有效抑制白念珠菌刺激引起的細胞內(nèi)NF－κBp65和caspase－1p20蛋白表達,與白念珠菌組比較,差異有顯著性(P＜0．01),見圖2。

圖2 NF－κBp65、caspase－1p20免疫蛋白印跡結(jié)果

2．3 培養(yǎng)上清液中細胞因子IL－1β含量的變化ELISA結(jié)果表明,白念珠菌刺激巨噬細胞后,細胞培養(yǎng)上清液中IL－1β含量明顯增加,與空白對照組比較,差異有顯著性(P＜0．01)。加入雌激素干預(yù)后,隨著雌激素濃度的增高,細胞培養(yǎng)上清液中IL－1β含量逐漸降低。加入10－9mol/L或10－8mol/L17β－雌二醇能有效抑制白念珠菌刺激引起的IL－1β分泌,與白念珠菌組比較,差異有顯著性(P＜0．01)。見表1。

表1 培養(yǎng)上清液中細胞因子IL－1β含量的變化

3 討論

NLRP3炎性體是一類分子量約為700 kDa的大分子蛋白復(fù)合體,在細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮外源性微生物或內(nèi)源性危險信號感受器的作用,是活化半胱天冬酶－1 (caspase－1)的分子平臺。NLRP3炎性小體的活化可致無活性的caspase－1前體轉(zhuǎn)化為活性caspase－1,后者可裂解IL－1β、IL－18、IL－33前體以形成活性形式并分泌。3Hise等發(fā)現(xiàn)NLRP3敲除鼠對白念珠菌的抵抗力顯著減弱,7說明NLRP3炎癥小體在宿主抵抗白念珠菌的感染中發(fā)揮保護作用。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn),白念珠菌刺激巨噬細胞后NLRP3 mRNA明顯增加,胞漿內(nèi)caspase－1的活化形式caspase－1p20蛋白表達明顯增加,細胞因子IL－1β的表達亦相應(yīng)明顯增加。這一結(jié)果表明在白念珠菌感染中NLRP3炎性體參與了caspase－1活化及IL－1β的分泌。IL－1β是白念珠菌引起的機體天然免疫反應(yīng)最主要的炎癥因子,可刺激其他細胞因子和炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生,增強細胞免疫和體液免疫介導(dǎo)的抗真菌免疫反應(yīng)及組織損傷過程。4

性激素與性傳播疾病關(guān)系非常密切,有研究表明性激素可以調(diào)節(jié)女性生殖道衣原體感染的易感性和炎癥反應(yīng)。8Shew等發(fā)現(xiàn)雌激素是人乳頭瘤病毒致病的主要輔助因子之一,它可通過調(diào)控細胞因子水平來影響CA的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸。9Kalo－Klein等發(fā)現(xiàn)孕婦及在黃體期的女性容易感染白念珠菌。10這些說明雌激素具有免疫調(diào)節(jié)功能,能影響機體對微生物的易感性。

NF－κB是廣泛存在于人體組織細胞中的轉(zhuǎn)錄因子,最常見的家族成員是p65/p50異源二聚體,對眾多基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。NF－κB的激活包括IκB酶誘導(dǎo)的IκB－α的磷酸化和降解,導(dǎo)致NF－κB釋放,繼而NF－κB活化而轉(zhuǎn)入核內(nèi)。11Ghisletti等發(fā)現(xiàn)17β－雌二醇預(yù)處理能有效地抑制脂多糖引起的巨噬細胞NF－κB亞基的核轉(zhuǎn)位,且NF－κB亞基核轉(zhuǎn)位的抑制反應(yīng)了NF－κB活性的下降。6本實驗中,預(yù)先加入不同濃度的雌激素作用后,白念珠菌刺激的NLRP3 mRNA表達、胞漿內(nèi)caspase－1p20蛋白表達及細胞因子IL－1β的分泌隨著雌激素濃度的增加而逐漸降低,且這種降低趨勢與核內(nèi)NF－κBp65蛋白的減少一致。這表明雌激素可抑制NLRP3表達及IL－1β分泌,且這種抑制作用可能是通過抑制NF－κB活性實現(xiàn)的。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn),NLRP3炎性體參與了白念珠菌感染時致炎因子IL－1β的分泌,雌激素可以劑量依賴的方式抑制NLRP3表達及IL－1β分泌,這種抑制作用可能與雌激素抑制NF－κB活性有關(guān)。這為解釋雌激素在女性白念珠菌感染中的作用機制提供一定的理論依據(jù)。接下來我們將進行小鼠體內(nèi)實驗研究,以期能闡明雌激素調(diào)控NLRP3炎性體的機制。

1 Sobel JD．Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis．Clin Infect Dis,1992,14:148－153．

2 Fidel PL Jr,Cutright J,Steele C．Effects of reproductive hor-mones on experimental vaginal candidiasis．Infect Immun,2000, 68(2):651－657．

3 Kanneganti TD,Ozoren N,Body－Malapel M,et al．Bacterial RNA and small antiviral compounds activate caspase－1 through cryopyrin/NLRP3．Nature,2006,440(7081):233－236．

4Vonk AG,Netea MG,Krieken JH,et al．Endogenous interleukin(IL)－1 and IL－1 are crucial for host defense against disseminated candidiasis．J Infect Dis,2006,193(10):1419－1426．

5Bauernfeind FG,Horvath G,Stutz A,et al．NF－κB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression．J Immunol, 2009,183(2):787－791．

6Ghisletti S,Meda C,Maggi A,et al．17β－estradiol inhibits inflammatory gene expression by controlling NF－κB intracellular localization．Mol Cell Biol,2005,25(8):2957－2968．

7Hise AG,Tomalka J,Ganesan S,etal．An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans．Cell Host Microbe,2009,5(5):487－497．

8 Kaushic C,Zhou F,Murdin AD,et al．Effects of estradiol and progesterone on susceptibility and early immune responses to Chlamydia trachomatis infection in the female reproductive tract．Infect Immun,2000,68(7):4207－4216．

9 Shew ML,McGlennen R,Zaidi N,et al．Oestrogen receptor transcripts associated with cervical human papillomavirus infection．Sex Transm Infect,2002,78(3):210－214．

10 Kalo－Klein A,W itkin SS．Candida albicans:Cellular immune system interactions during different stages of the menstrual cycle．Am JObstet Gynecol,1989,161(5):1132－1136．

11 Konia MR,Schaefer S,Liu H．Nuclear factor－κB inhibition provides additional protection against ischaemia/reperfusion injury in delayed sevoflurane preconditioning．Eur J Anaesthesiol,2009,26(6):496－503．

(收稿:2013－09－29)

Effect of estrogen on candida albicans－induced NLRP3 expression in murine peritonealm acrophages

XU Li,DUAN Yi-qun,CHEN Hong-xiang,et al.Department ofDermatology,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan, 430022

Objective:To investigate the regulatory effectsof estrogen on NLRP3 expression inmurine peritonealmacrophages induced by candida albicans．Methods:Murine peritoneal macrophages were cultured and randomly divided into five groups:blank control group,C.albicans group,C.albicans＋10－10mol/L－17β－estradiol group,C.albicans＋10－9mol/L－17β－estradiol group and C.albicans＋10－8mol/L－17β－estradiol group．ThemRNA expressionsof NLRP3 in the cellswere determined by real－time PCR．Western blotwas performed to determine the activities of NF－κB and caspase－1p20．The protein of interleukin－1β(IL－1β)were determined by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)．Results:The mRNA expressions of NLRP3, the activities of NF－κB and caspase－1p20 in macrophages and the levels of IL－1βin the supernatant increased significantly when compared to the controls(P＜0．01)．After adding estrogen into the cells challenged with C.albicans,themRNA expressions of NLRP3,the activities of NF－κB and caspase－1p20 inmacrophages and the levels of IL－1βin the supernatant decreased with the increasing of estrogen concentrations,when compared to the control group(P＜0．01)．Conclusion:Estrogen can inhibit the expressions of NLRP3,the activation of caspase－1 and the production of pro－inflammatory cytokines IL－1βinmacrophages challenged with C.albicans,through inhibiting the activities of NF－κB．

candida albicans；estrogen；NLRP3；nuclear factor－κB；interleukin－1β

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號:81101201,81171495, 81271765)

1武漢市第一醫(yī)院皮膚科,武漢,430022

2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科,武漢, 430022

?通信作者