王 甜，吳樹彬，鄒麗華，劉晉萍，吉冰洋，唐 躍，吳愛麗

·基礎(chǔ)研究·

丙酮酸鈉在深低溫停循環(huán)順行選擇性腦灌注中的腦保護(hù)作用

王 甜，吳樹彬，鄒麗華，劉晉萍，吉冰洋，唐 躍，吳愛麗

目的 探索在深低溫停循環(huán)（DHCA）期間，順行選擇性腦灌注（ASCP）含丙酮酸鈉（Pyr）的血液能否有效緩解氧化應(yīng)激從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。方法 隨機(jī)選取45只新西蘭兔，18只作為供血兔，27只用于建立模型并隨機(jī)分為：假手術(shù)（Sham）組（n＝9）、ASCP組（n＝9）和Pyr組（n＝9）。Sham組麻醉后開胸，建立體外循環(huán)但不轉(zhuǎn)機(jī)；Pyr組在DHCA中ASCP含Pyr溶液（154 mmol／L）與血液的混合液；ASCP組則為氯化鈉溶液（154 mmol／L）與血液混合液。在麻醉后（T1）、降溫至28℃（T2）、開放升主動(dòng)脈后10 min（T3）、停機(jī)后10 min（T4）及停機(jī)后120 min（T5）五個(gè)時(shí)點(diǎn)采集血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、檢測(cè)動(dòng)脈血?dú)夂筒杉i靜脈球部血液。停機(jī)后安樂死動(dòng)物并進(jìn)行腦組織取材。檢測(cè)樣本中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及S100B蛋白含量。結(jié)果 ASCP組MDA含量高于Sham組和Pyr組（P＜0．05）。ASCP組SOD活性低于Sham組和Pyr組（P＜0．05），與Pyr組在T3、T4和T5三個(gè)時(shí)點(diǎn)血漿S100B蛋白較組內(nèi)T1時(shí)點(diǎn)高（P＜0．05），ASCP組T3、T4和T5時(shí)點(diǎn)血漿S100B蛋白濃度顯著高于同時(shí)點(diǎn)的Sham組和Pyr組（P＜0．05）。結(jié)論 DHCA期間ASCP含外源性Pyr的血液可通過緩解氧化應(yīng)激發(fā)揮較為完善的腦保護(hù)作用。

深低溫停循環(huán)；順行選擇性腦灌注；動(dòng)物模型；丙酮酸鈉

中樞神經(jīng)功能障礙是實(shí)施深低溫停循環(huán)（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）手術(shù)后的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，而順行性選擇性腦灌注（antegrade se?lective cerebral perfusion，ASCP）技術(shù)近年來被視為主動(dòng)脈弓類疾患術(shù)中實(shí)施DHCA較為安全的腦保護(hù)措施［1］。但本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ASCP技術(shù)依然存在腦缺血并通過氧化應(yīng)激等機(jī)制損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)［2］。丙酮酸鈉（Pyruvate，Pyr）是最常見的丙酮酸鹽，可作為機(jī)體內(nèi)源性非酶促抗氧化屏障的重要成員在眾多臨床研究中發(fā)揮其臟器保護(hù)作用。因此，本研究擬探索在DHCA期間ASCP含Pyr的血液觀察其能否緩解氧化應(yīng)激程度，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由阜外心血管病醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一提供購(gòu)買。15～20周齡新西蘭兔45只，2．5～3．5 kg，雌雄不限；其中27只動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)組，另外18只作為供血?jiǎng)游?。術(shù)前6 h禁食，2 h禁水。

1．2 實(shí)驗(yàn)耗材

1．2．1 主要儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)（巴西Intermed公司，Class 1－Type B），雙頭滾壓泵（德國(guó)Stockert公司），阜外嬰兒D型管道（天津塑料研究所），膜肺（Terumo Capiox RW05 Baby－RX），變溫水箱（德國(guó)Jostra公司，型號(hào)：20－600），紫外／可見光分光光度計(jì)（Beckman Coulter，美國(guó)）等。

1．2．2 主要試劑 Pyr（25 mg，Sigma，Germany），兔S100B ELISA試劑盒（RapidBio Lab，USA），兔MDA ELISA試劑盒（Abnova，USA），兔SOD ELISA試劑盒（Abcam，England）等。

1．3 建立改良下半身停循環(huán)聯(lián)合選擇性腦灌注兔模型［3］隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)用新西蘭兔并稱重后，經(jīng)耳緣靜脈注射鹽酸氯胺酮注射液35 mg／kg和地西泮1．5 mg／kg誘導(dǎo)麻醉后經(jīng)口氣管插管維持呼吸，給予0．5 mg維庫(kù)溴銨、鹽酸氯胺酮注射液10 mg／（kg·h）和地西泮1．5 mg／（kg·h）維持麻醉并進(jìn)行心電、肛溫、平均動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)。全身肝素化（500 U／kg）后，胸部正中切口暴露心臟和升主動(dòng)脈，沿主動(dòng)脈游離無名動(dòng)脈及左、右鎖骨下動(dòng)脈，右鎖骨下動(dòng)脈置入16 G動(dòng)脈套管針供全身灌注和選擇性腦灌注，中心靜脈管置入左鎖骨下動(dòng)脈，在導(dǎo)絲引導(dǎo)下送至主動(dòng)脈根部，供灌注停搏液，右心耳處14 F靜脈插管供引流靜脈血。當(dāng)全血激活凝固時(shí)間（activated clotting time，ACT）≥480 s時(shí)開始體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB），全流量設(shè)為120～150 ml／（kg·min），平均動(dòng)脈壓維持在50～60 mm Hg。于轉(zhuǎn)機(jī)10 min后降溫，降至28℃后灌注St．Thomas液20 ml／kg，每隔30 min時(shí)灌注停搏液半量。繼續(xù)降溫至20℃時(shí)將流量降至8～10 ml／（kg·min）并開始下半身停循環(huán)和ASCP。停循環(huán)1 h后恢復(fù)全身灌注并復(fù)溫。復(fù)溫至32℃時(shí)開放升主動(dòng)脈使心臟自動(dòng)復(fù)跳，繼續(xù)復(fù)溫至35℃時(shí)停機(jī)，并給予魚精蛋白注射液拮抗肝素。于停機(jī)后10 min用鹽酸氯胺酮注射液35 mg／kg和地西泮1．5 mg／kg安樂死動(dòng)物。整個(gè)CPB過程采用α－穩(wěn)態(tài)血?dú)夤芾怼?/p>

1．4 實(shí)驗(yàn)流程 將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組，ASCP組和Pyr組，每組9只動(dòng)物，其中ASCP組和Pyr組需要獻(xiàn)血兔供血。在DHCA開始后，Pyr組將Pyr溶液（154 mmol／L）與血液混合后行ASCP；而ASCP組則為154 mmol／L氯化鈉溶液與血液的混合液。Sham組麻醉后開胸后建立CPB但不轉(zhuǎn)機(jī)，在與其他兩組相對(duì)應(yīng)的各時(shí)點(diǎn)的平均值記錄各項(xiàng)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，采樣行生化指標(biāo)分析并取材。ASCP組和Pyr組在麻醉后（T1）、降溫至28℃（T2）、開放升主動(dòng)脈后10 min（T3）、停機(jī)后10 min（T4）及停機(jī)后120 min（T5）五個(gè)時(shí)點(diǎn)采動(dòng)脈血、頸靜脈球部血液和記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。安樂死動(dòng)物時(shí)取大腦新皮質(zhì)組織。

1．5 主要監(jiān)測(cè)指標(biāo)

1．5．1 生理指標(biāo) T1～T5各時(shí)刻血壓、心率、溫度、心電圖、動(dòng)脈血?dú)?/p>

1．5．2 生化指標(biāo)分析 采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法）檢測(cè)各時(shí)刻血漿樣品中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、S100B蛋白含量，采用WST－1法檢測(cè)腦皮質(zhì)裂解液中的超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性。

1．6 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)，不同時(shí)點(diǎn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 新西蘭兔體重及CPB一般資料 不同組別動(dòng)物體重及CPB不同時(shí)段的時(shí)長(zhǎng)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。見表1。

2．2 血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)庵笜?biāo) ASCP組和Pyr組在T2和T3時(shí)刻的平均動(dòng)脈壓（MAP）值、心率（HR）值、血紅蛋白（Hb）值、紅細(xì)胞比容（Hct）值顯著低于組內(nèi)T1時(shí)刻（P＜0．05），也明顯低于同時(shí)刻Sham組（P＜0．05）。ASCP組和Pyr組在T2和T3時(shí)刻的乳酸（Lac）值顯著高于組內(nèi)T1時(shí)刻（P＜0．05），也明顯高于同時(shí)刻Sham組（P＜0．05）。pH值、動(dòng)脈血氧飽和度（SaO2）在不同組別組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)與組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見表2。

表1 動(dòng)物體重及CPB各時(shí)段時(shí)長(zhǎng)（n＝9，±s）

表1 動(dòng)物體重及CPB各時(shí)段時(shí)長(zhǎng)（n＝9，±s）

組別 體重（kg） CPB（min） 阻斷時(shí)間（min） 降溫（min） 復(fù)溫（min）Sham組 3．06±0．40 — — — —ASCP組 2．89±0．25 205．56±30．49 126．78±8．39 48．67±10．86 65．44±9．88 Pyr組 3．17±0．33 208．33±19．51 130．22±11．19 51．67±8．20 68．11±9．36

表2 血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)庵笜?biāo)（n＝9，±s）

表2 血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)庵笜?biāo)（n＝9，±s）

注：＃表示組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)與T1相比P＜0．05；△表示與Sham組相比P＜0．05。

項(xiàng)目 組別 T1 T2 T3 T4 T5 MAP（mm Hg） Sham組 85．78±5．63 82．44±3．91 79．22±4．79 80．67±4．46 86．22±4．21 ASCP組 85．11±4．96 54．56±7．30?！?7．89±5．25?！?6．33±3．97 83．33±6．28 Pyr組 81．33±9．26 53．33±7．14?！?4．78±5．54?！?4．00±7．67 82．56±7．11 HR（bpm） Sham組 240．±13．58 228．33±22．61 238．22±10．94 244．6±12．86 242．2±5．78 ASCP組 245．5±9．84 205．78±26．87＃△220．33±22．93＃246．22±8．69 246．3±9．82 Pyr組 245．2±8．15 197．11±13．79?！?24．11±18．75＃240．0±10．20 240．1±9．76 pH Sham組 7．43±0．08 7．37±0．04 7．42±0．06 7．41±0．03 7．39±0．03 ASCP組 7．42±0．08 7．40±0．09 7．42±0．09 7．42±0．04 7．42±0．05 Pyr組 7．44±0．07 7．39±0．10 7．43±0．07 7．42±0．04 7．42±0．04 SaO2（%） Sham組 99．78±0．37 97．71±4．39 99．90±0．01 99．11±1．87 99．57±0．36 ASCP組 99．09±2．32 99．89±0．03 99．88±0．06 99．57±0．36 99．11±1．87 Pyr組 99．88±0．07 99．90±0．01 99．89±0．03 99．86±0．09 99．11±1．89 Hb（g／L） Sham組 94．7±13．4 95．2±13．1 92．0±9．4 89．9±6．5 94．8±13．1 ASCP組 95．20±16．1 75．70±6．9?！?9．20±11．4＃△89．2±15．5 93．7±15．0 Pyr組 95．20±11．2 76．10±7．2?！?9．3±13．1?！?9．7±10．0 93．4±11．7 Hct（l／L） Sham組 0．308±0．03 0．302±0．03 0．284±0．03 0．282±0．04 0．277±0．03 ASCP組 0．309±0．05 0．239±0．02＃△0．221±0．02?！?．297±0．04 0．293±0．05 Pyr組 0．303±0．04 0．236±0．03＃△0．248±0．03?！?．290±0．04 0．294±0．04 Lac（mom／l） Sham組 3．76±0．54 3．82±0．33 3．61±0．33 3．68±0．39 3．83±0．64 ASCP組 3．79±0．64 4．07±0．57 7．72±0．69?！?．37±0．59＃△3．91±0．62 Pyr組 3．84±0．56 4．14±0．60 6．12±0．90?！?．37±0．52?！?．92±0．59

2．3 各組動(dòng)物大腦皮質(zhì)MDA含量、SOD活性ASCP組MDA含量顯著高于Sham組和Pyr組（P＜0．05）。ASCP組SOD活性含量低于Sham組和Pyr組（P＜0．05）。見圖1、圖2。

圖1 腦組織MDA含量圖

圖2 腦組織SOD活性

2．4 血漿中S100B蛋白含量的變化 ASCP組與Pyr組在T3、T4和T5時(shí)血漿S100B蛋白較T1時(shí)點(diǎn)高（P＜0．05）。在T3、T4和T5時(shí)的S100B蛋白濃度數(shù)據(jù)顯示，ASCP組和Pyr組顯著高于Sham組（P＜0．05），ASCP組顯著高于Pyr組（P＜0．05）。見圖3。

圖3 血漿S100B蛋白含量變化

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用了改良下半身停循環(huán)聯(lián)合ASCP兔模型［3］，收集供血兔的血液作為預(yù)充，較好的維持了轉(zhuǎn)流中的Hb濃度，轉(zhuǎn)流過程中采取了α穩(wěn)態(tài)血?dú)夤芾?，MAP、HR及pH值等血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)庵笜?biāo)的變化均符合DHCA的病理生理過程（見表2）。新西蘭兔Lac基礎(chǔ)值在4～6 mmol／L之間，停循環(huán)期間無氧代謝增加導(dǎo)致Lac的生成增加，低溫下酶活性的降低導(dǎo)致其清除率降低，從而Lac持續(xù)上升，停機(jī)后微循環(huán)改善，Lac逐步清除并降為正常值，符合DHCA術(shù)中的Lac變化。本實(shí)驗(yàn)建立的兔模型將心肌灌注和選擇性腦灌注技術(shù)結(jié)合，用于研究DHCA中的ASCP技術(shù)是否具有可行性和優(yōu)越性。

ASCP被認(rèn)為是DHCA期間最有效的腦保護(hù)措施之一，可以大大減少術(shù)后神經(jīng)功能障礙的發(fā)生。但是，低溫ASCP本身可以引起腦缺血：一方面，冷灌注會(huì)使腦血流自主調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂，引起腦血管收縮［4］，另一方面，低流量引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫和腦血管痙攣等現(xiàn)象也可以進(jìn)一步減少腦血流［5］。腦缺血可引起的氧化應(yīng)激［2］可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧自由基、單線態(tài)氧和H2O2等活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。由于大腦抗氧化屏障相對(duì)較弱、脂類含量尤其是不飽和脂肪酸和兒茶酚胺含量較高［6］，ROS易于通過氧化大腦中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸改變細(xì)胞功能，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和神經(jīng)功能障礙［7－8］。而人體的內(nèi)源性抗氧化損傷機(jī)制可通過酶促和非酶促反應(yīng)屏障清除ROS發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［9］。

DHCA期間，低溫使過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase）活性急劇降低，酶促反應(yīng)屏障受到抑制，同時(shí)ROS大量產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化還原失衡。MDA反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，即細(xì)胞損傷的程度。而本研究數(shù)據(jù)顯示，Pyr的抗氧化效應(yīng)能夠有效降低氧化應(yīng)激程度，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生（見圖1）。血液中S100B蛋白增高是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷特異和靈敏的生化標(biāo)志，神經(jīng)系統(tǒng)損傷后釋放入血，本研究中Pyr可以有效降低S100B蛋白濃度（見圖3），反映其腦保護(hù)效應(yīng)。

Pyr是三羧酸（Tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)的底物，可以補(bǔ)充DHCA期間的能量物質(zhì)，具有一定的抗氧化特性［10］，它能以多種方式緩解氧化應(yīng)激［11－12］，是機(jī)體內(nèi)源性抗氧化屏障的重要成員之一。首先，因具有α－酮基，Pyr可不經(jīng)酶催化直接進(jìn)行氧化脫羧與ROS反應(yīng)，發(fā)揮非酶促反應(yīng)屏障的效應(yīng)。其次，Pyr能提高胞內(nèi)谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平和多種組織的 GSH／GSSG（氧化型谷胱甘肽）比率［12－13］，增強(qiáng)酶促反應(yīng)屏障中的谷胱甘肽過氧化物酶［14］和SOD的活性（見圖2）。此外，Pyr可以降低NADH（煙酸胺腺嘌呤二核苷酸還原型輔酶）氧化還原酶系統(tǒng)中NADH含量［11］，增加大腦NAD＋（煙酸胺腺嘌呤二核苷酸）／NADH的比率，改善氧化還原狀態(tài)［13，15］，減少超氧自由基的產(chǎn)生。同時(shí)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Pyr能抵抗內(nèi)源和外源性H2O2的氧化應(yīng)激毒性，保護(hù)離體大鼠紋狀體神經(jīng)元免受損傷［2］，并可抑制H2O2介導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞［16］和成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡［17］。

研究表明，當(dāng)血漿Pyr濃度為5 mmol／L時(shí)，可以有效緩解海馬區(qū)缺血性損傷［18］。本研究給予劑量可使Pyr的血漿濃度達(dá)到15 mmol／L，因此可經(jīng)易化擴(kuò)散和簡(jiǎn)單擴(kuò)散通過血腦屏障［19］，快速發(fā)揮其腦保護(hù)效應(yīng)。然而，α－丁酮酸與Pyr一樣，可直接與ROS反應(yīng)，也可經(jīng)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體或單純擴(kuò)散穿過血腦屏障［20］，但對(duì)神經(jīng)元存活沒有影響。二者的顯著區(qū)別在于Pyr是糖酵解過程的終產(chǎn)物，可以直接進(jìn)入TCA循環(huán)代謝，產(chǎn)生ATP。在體外研究中，用Pyr孵育糖氧剝奪的神經(jīng)元可提高神經(jīng)元糖原的含量［21］。Pyr促進(jìn)糖原合成的機(jī)制可能在于它可以直接進(jìn)入TCA循環(huán)，增加檸檬酸鹽含量水平［22］。這些研究提示，Pyr除抗氧化應(yīng)激作用外，還可通過能量代謝機(jī)制發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。

本研究局限有以下幾方面：首先，MDA和SOD不能代表全部氧化還原狀態(tài)，更多的氧化應(yīng)激指標(biāo)應(yīng)納入進(jìn)一步研究中。其次，大腦不同區(qū)域?qū)θ毖毖鯎p傷耐受力不同［10－13］，本研究選取了大腦新皮質(zhì)作為研究對(duì)象，不能反映大腦總體損傷。最后，抗

氧化效應(yīng)不是Pyr腦保護(hù)作用的單一機(jī)制，建議未來的研究探索Pyr在能量代謝等更多方面的作用機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，相較于單純血液ASCP，DHCA期間ASCP含Pyr的血液可以有效緩解氧化應(yīng)激，從而減輕神經(jīng)元損傷，發(fā)揮特異性腦保護(hù)作用。

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Brain protective effect of antegrade selective cerebral perfusion with sodium pyruvate in deep hypothermic circulatory arrest

Wang Tian，Wu Shu－bin，Zou Li－h(huán)ua，Liu Jin－ping，Ji Bing－yang，Tang Yue，Wu Ai－li
Department of Cardiopulmonary Bypass，F(xiàn)uwai Hospital，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100037，China

Objective To explore whether a combination of sodium pyruvate（Pyr）and blood for antegrade selective cerebral perfusion（ASCP）during deep hypothermic circulatory arrest（DHCA）could attenuate oxidative stress and exert a better protective effect on the brain．Methods Fourty－five rabbits were selected randomly．Eighteen were used for blood donation，other rabbits used for model establishment and which were divided into：Sham group（n＝9），ASCP group（n＝9）and Pyr group（n＝9）．The Sham group underwent anesthesia and thoracotomy，set up cardiopulmonary bypass（CPB）but no on pump．During DHCA，ASCP was per?formed with a combination of 154 mmol／L isotonic solution of sodium pyruvate and blood for Pyr group but a combination of 154 mmol／L Nacl solution and blood for ASCP group．Blood gas and hemodynamic parameters were measured in five time points during CPB．The rabbits ended with euthanasia after CPB，and their brain tissue were preserved．All samples were used to measure malondialdehyde（MDA）content，superoxide dismutase（SOD）activity and S100B content．Results he MDA content of ASCP group was higher than Sham group and Pyr group（P＜0．05）．The SOD activity of ASCP group was lower than Sham group and Pyr group（P＜0．05）．The S100B concentrations of ASCP group and Pyr group at T3，T4 and T5 points were higher than T1 point in the same groups（P＜0．05）．The S100B concentrations of ASCP group at T3，T4 and T5 points were higher than Sham group and Pyr group at the same points（P＜0．05）．Conclusion The combination of blood and sodium pyruvate for ASCP during DHCA could exert a better protective effect on the brain by attenuating oxidative stress．

Deep hypothermic circulatory arrest；Antegrade selective cerebral perfusion；Animal model；Sodium pyruvate

國(guó)家自然科學(xué)基金（81100178）

100037北京，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，阜外心血管病醫(yī)院體外循環(huán)科（王 甜、吳樹彬、鄒麗華、劉晉萍、吉冰洋），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（唐 躍、吳愛麗）

劉晉萍，Email：jinpingfw＠ Hotmail．com

2014?11?13）

2014?11?14）

10．13498／j．cnki．chin．j．ecc．2014．04．14