張若琪，李蕓霞，彭成

·藥理毒理·

廣藿香酮在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究

張若琪，李蕓霞，彭成

目的：建立廣藿香酮GC-MS測定方法，并進(jìn)行藥動學(xué)研究。方法：采用Agilent HP-5ms色譜柱（30 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm，5 %苯基甲基硅氧烷）；電子碰撞離子源（EI），電子倍增電壓（EMV）模式，檢測離子m/z 168.0。將大鼠分為高、中、低劑量組，分別灌胃給予大鼠廣藿香酮4 mg．kg-1、8 mg．kg-1、16 mg．kg-1，測定不同時間點的血藥濃度，繪制藥時曲線，計算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果：廣藿香酮高、中、低劑量Cmax分別為48.33±13.07 ng．mL-1、98.83 ±36.14 ng．mL-1、190.52 ±42.78 ng．mL-1、Tmax分別為1.33±0.52 h、1.33 ±0.52 h、1.16 ±0.41 h；t1/2z分別為4.91 ±1.03 h、4.64 ±1.23 h、4.29 ±1.49 h。結(jié)論：所用方法處理簡單、靈敏、特異性高、定量準(zhǔn)確，可為廣藿香酮的藥動學(xué)研究提供方法。大鼠口服廣藿香酮4 mg．kg-1～16 mg．kg-1劑量范圍內(nèi)，藥動學(xué)符合線性動力學(xué)過程。

]廣藿香酮; 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法; 血藥濃度；藥動學(xué)

廣藿香油有多種藥理活性，包括止吐作用、殺錐蟲活性、抗細(xì)菌、抗真菌和Ca2+拮抗活性[1～3]。廣藿香酮是廣藿香的一個重要成分，藥理研究表明，廣藿香酮具有抗細(xì)菌和抗真菌[4]的活性。本實驗采用GC-MS法，測定大鼠血漿中廣藿香酮的濃度，并對廣藿香酮灌胃給予大鼠的藥動學(xué)進(jìn)行研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

Agilent 7890A氣相色譜儀，Agilent 5975C串聯(lián)質(zhì)譜檢測器，Agilent ChemStation軟件（美國Agilent）。廣藿香酮（Pogostone）標(biāo)準(zhǔn)品（自制，純度分別為98 %）；內(nèi)標(biāo)（ internal standard, IS）為異土木香內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品（上海一基生物試劑有限公司）；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件 采用Agilent HP-5ms色譜柱（30 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm，5 %苯基甲基硅氧烷）；升溫程序為：起始柱溫為110 ℃，保持1 min；以25 ℃．min-1升溫至240 ℃ 并保持1 min；之后以35 ℃．min-1升溫至280 ℃并保持1 min。質(zhì)譜采用電子碰撞離子源（EI），電子倍增電壓（EMV）模式，增益系數(shù)為1.01，實際EMV為1576.47 V。檢測離子為：廣藿香酮m/z 168.0，內(nèi)標(biāo)異土木香內(nèi)酯m/z 190.1。

1.2.2 溶液的制備 分別稱取適量廣藿香酮和內(nèi)標(biāo)，用甲醇溶解配制成81.2和503.2 μg．mL-1的對照品貯備液，于4 °C冰箱中冷藏。用甲醇稀釋貯備液，依次配制廣藿香酮工作溶液：2.04、10.06、20.4、100.6、204.0、406.0、812.0 ng．mL-1；內(nèi)標(biāo)溶液：5.03 μg．mL-1。

于空白血漿中分別精密加入廣藿香酮工作液和內(nèi)標(biāo)溶液，配成廣藿香酮濃度為1.02, 5.03, 10.2, 50.3, 102.0, 203.0, 406.0 ng．mL-1的對照品血漿，內(nèi)標(biāo)的血漿濃度為0.503μg．mL-1。

四個濃度的質(zhì)控樣品(QC)于樣品分析當(dāng)天配制，廣藿香酮的濃度依次為： 1.02 (LLQC)、5.03(LQC)、50.3 (MQC)、203 (HQC) ng．mL-1。

1.2.3 血漿樣品的處理 于100 μL空白血漿中加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液，再加入50μL對照品工作液，渦旋30 s后，加2 mL乙酸乙酯，渦旋3 min后于5.0×10 3 rpm離心10 min，取上清液，于30 ℃下氮氣吹干，用100 μL甲醇復(fù)溶，于5.0×10 3 rpm離心10 min，取上清液進(jìn)行GC-MS分析，進(jìn)樣量為1 μL。

1.2.4 專屬性試驗 取LLQC、LQC、MQC、HQC質(zhì)控樣本，按“1.2.3”項方法處理后，以“1.2.1”項色譜條件測定廣藿香酮。圖1所示為試驗條件下的廣藿香酮和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖。在試驗條件下，廣藿香酮和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為6.1 min和7.4 min（圖2），峰形良好。6份來自不同大鼠空白血漿樣品經(jīng)“1.2.3”項方法處理后，無明顯干擾。

圖1. 廣藿香酮(A)和內(nèi)標(biāo)異土木香內(nèi)酯(B)的EI-MS質(zhì)譜圖

圖2 廣藿香酮m/z 168.0 (A) 和內(nèi)標(biāo)異土木香內(nèi)酯m/z 190.1 (B)的GC-MS色譜圖

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 以待測物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值對相應(yīng)的待測物質(zhì)量濃度(ng．mL-1) 做標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:廣藿香酮血漿濃度的回歸方程為: y=0.0968x-0.1273, r=0.9958，線性范圍為1.02～406 ng．mL-1，最低定量限為1.02 ng．mL-1。

1.2.6 準(zhǔn)確度及精密度 按“1.2.3”項方法操作，處理LLQC、LQC、MQC、HQC 4個濃度的:廣藿香酮的QC樣本，每濃度做 6個樣本，連續(xù)測定 3 個分析批，以相應(yīng)分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算混合 QC 樣本中各待測物的濃度。結(jié)果表明:廣藿香酮批內(nèi)、批間的方法回收率分別在98.68-103.92 %和97.17-102.83 %以內(nèi)，批內(nèi)、批間精密度RSD均＜8 %(表1) 。

表1 廣藿香酮大鼠血漿樣品的準(zhǔn)確度、精密度和萃取回收率

1.2.7 萃取回收率 按“1.2.3”項方法操作，處理血漿樣品中廣藿香酮LQC、MQC、HQC 3個濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)樣分析后所得待測物的峰面積，與未萃取的樣品進(jìn)樣分析后所得待測物的峰面積相比，計算萃取回收率。廣藿香酮萃取回收率的平均值為74.3 % ;內(nèi)標(biāo)萃取回收率的平均值為 76.3 % ( 表 1) 。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗 取LQC、MQC、HQC 3個濃度的廣藿香酮的QC 樣本，分別考察血漿樣本于室溫下放置 14 h、血漿樣本經(jīng)處理后在自動進(jìn)樣器中室溫下放置 12 h、經(jīng) 3 次凍融及- 20 ℃ 長期冰凍放置 21 d后的穩(wěn)定性。表2顯示，血漿樣本在以上各種貯存條件下均穩(wěn)定。

表2 廣藿香酮大鼠血漿樣品的穩(wěn)定性 (n =3)

1.2.9 藥動學(xué)實驗 SD大鼠 (SPF, 雌性)，體重200～220 g，購自成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。試驗前將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，全程不禁飲水。將18只大鼠分為高、中、低劑量組，分別灌胃給予大鼠廣藿香酮4、8、16 mg/kg。于給藥前及給藥后5、15、30、45 min，1、2、4、6、9、12、16和24 h時，經(jīng)眼眶取血0.3 mL，至于肝素離心管中。于5.0×103 rpm 離心10 min分離血漿，儲存于-20 ℃冰柜中冷藏待測。按“1.2.3”項方法處理后，以“1.2.1”項色譜條件檢測廣藿香酮的濃度。所有數(shù)據(jù)均用Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight Corporation, USA)軟件處理，計算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表3。采用Newman-Keuls test對三個劑量之間AUC0-t/dose、Cmax/dose和t1/2z進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；采用Wilcoxon t rank sum test對三個劑量的Tmax進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明：灌胃給予大鼠廣藿香酮4、8、16 mg．kg-1，Cmax分別為48.33±13.07、98.83 ±36.14、190.52 ±42.78 ng．mL-1；Tmax分別為1.33±0.52、1.33 ±0.52、1.16 ±0.41 h；t1/2z分別為4.91 ±1.03、4.64 ±1.23、4.29 ±1.49 h。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，三個劑量下AUC0-t/dose、Cmax/dose、t1/2z和Tmax均無統(tǒng)計學(xué)差異，大鼠口服廣藿香酮4-16 mg．kg-1劑量范圍內(nèi)，藥動學(xué)符合線性動力學(xué)過程。平均藥-時曲線見圖3。

表3 大鼠灌胃給予廣藿香酮的主要藥動學(xué)參數(shù)(Mean ±SD , n = 6)

t1/2z, h 4.91 ±1.03 4.64 ±1.23 4.29 ±1.49 Tmax, h 1.33±0.52 1.33 ±0.52 1.16 ±0.41 Vz/F, L 17.19±4.13 15.47 ±3.57 14.56 ±5.45 CLz/F, L/h 2.47±0.53 2.38 ±0.52 2.37 ±0.47 Cmax, ng/mL 48.33±13.07 98.83 ±36.14 190.52 ±42.78

圖3 大鼠灌胃給予廣藿香酮的平均藥-時曲線 (n= 6)

2 討論

本實驗采用GC-MS法測定大鼠血漿中廣藿香酮的濃度，用異土木香內(nèi)酯作為內(nèi)標(biāo)物，方法專屬性高，保留時間合適，峰形良好，血漿樣品處理采用液液萃取法，操作簡單，適用于藥動學(xué)的研究。廣藿香酮見光不穩(wěn)定，需避光保存。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，高、中、低劑量下AUC0-t/dose、Cmax/dose、t1/2z和Tmax均無統(tǒng)計學(xué)差異，大鼠口服廣藿香酮4～16 mg/kg劑量范圍內(nèi)，藥動學(xué)符合線性動力學(xué)過程。隨著劑量的增加，Cmax和AUC符合劑量依賴性，其增加的比例與劑量增加的比例一致。廣藿香酮在大鼠體內(nèi)吸收較快，血藥濃度約1 h達(dá)到峰值，說明其具有良好的透膜性。

[1] Y. Yang, K. Kinoshita, K. Koyama, K. Takahashi, T. Tai, Y. Nunoura, K. Watanabe. Anti-emetic principles of Pogostemon cablin (Blanco) Benth [J]. Phytomedicine, 1999, 6:89.

[2] Fumiyuki Kiuchi, Kenji Matsuo, Michiho Ito, Tran Kim Qui, Gisho Honda. New Norditerpenoids with Trypanocidal Activity from Vitex trifolia [J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2004, 52: 1495.

[3] 楊得坡, Chaumont Jean-Pierre, Millet Joeue, 等.藿香和廣藿香揮發(fā)油對皮膚癬菌和條件致病真菌的抑制作用[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2000, 35(1): 9.

[4] Yi YY, He JJ, Su JQ, Kong SZ, Su JY, Li YC, Huang SH, Li CW, Lai XP and Su ZR. Synthesis and antimicrobial evaluation of pogostone and its analogues [J]. Fitoterapia, 2013, 84:135.

（責(zé)任編輯：何瑤）

Pharmacokinetic study of pogostone in rats after oral administration by GC/MS /

ZHANG Ruo-qi, LI Yun-xia, PENGCheng//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective: To establish a method for determination of pogostone in rat plasma by GC-MS and to apply it to the study on pharmacokinetics in rats．Method: The chromatographic separation was performed on a capillary column of Agilent HP-5ms, and the spectrometer was operated in electron-impact ionization with an electron multiplier voltage mode. Three dose groups of 4 mg．kg-1, 8 mg．kg-1, 16 mg．kg-1were adopted in the pharmacokinetic experiment. Concentration-time curves were obtained and the pharmacokinetic parameters were calculated. Result: After oral administration of pogostone in three doses, the Cmaxwere 48.33±13.07 ng．mL-1, 98.83 ±36.14 ng．mL-1, 190.52 ±42.78 ng．mL-1. And the Tmaxwere 1.33±0.52 h, 1.33 ±0.52 h, 1.16 ±0.41 h, respectively. Conclusion: The method is successfully applied to a pharmacokinetic study after the oral administration of pogostone to rats. The mean Cmax and AUC0-t values are both linear in the range of doses administered 4 mg．kg-1～16 mg．kg-1to rats.

Pogostone; GC-MS; plasma concentration; pharmacokinetics

R 285.5

A

1674-926X(2014)02-022-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

張若琪（1982-），女，河南偃師人，講師，從事中藥藥動學(xué)研究

Tel:13882271228 Email: zrq1007@qq.com

彭成，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事疾病動物模型與中藥復(fù)方藥理毒理研究和中藥新藥開發(fā)

2013-09-03