呂維，吳戀，葉娜，羅紅麗，王春艷，萬麗

·品種品質(zhì)·

HPLC法同時測定川芎藥材中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的含量

呂維，吳戀，葉娜，羅紅麗，王春艷，萬麗

目的：建立高效液相色譜法同時測定川芎藥材中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的方法。方法：采用Dikma Kromasil C18(250 nm×4.6 mm,5 μm)色譜柱；流動相為甲醇-0.1%冰醋酸水溶液（65∶35）；流速1.0 mL．min-1；檢測波長：320 nm；柱溫30℃。結(jié)果：川芎藥材中2種成分得到良好的分離，阿魏酸在0.032～0.3179μg范圍內(nèi)，藁本內(nèi)酯在0.244～2.44 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.4%和98.8%。結(jié)論：本方法簡便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為多組分評價川芎藥材質(zhì)量提供了可靠的分析方法。

]HPLC；阿魏酸；藁本內(nèi)酯；川芎

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，應(yīng)用非常廣泛。其性溫，味辛、微苦，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效。主治血瘀氣滯致月經(jīng)不調(diào)，肝郁氣滯而致血行不暢的胸脅疼痛、頭痛、風(fēng)寒濕痹等疾病[1]，現(xiàn)代藥理研究表明川芎具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制脂質(zhì)過氧化、抗血栓、抗心肌缺血、舒張血管、抑制神經(jīng)元變性等藥理作用[2～5]。川芎主要活性成分是藁本內(nèi)酯、川芎嗪、阿魏酸等[6～8]，因川芎嗪約占生藥的0.001%～0.002%[9]，含量甚微，故本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，建立了同時測定川芎藥材中阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量的方法，為組分評價川芎藥材質(zhì)量提供了一定科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1200 series，包括四元泵（G1311A）帶真空脫氣機(jī)（G1322A）,柱溫箱（G1316A），DAD紫外檢測器（G1315D），Agilent Technologies 色譜工作站（美國Agilent 公司）；KQ3200E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-5203，上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴鍋（北京國華醫(yī)療器械廠）；BS124S（萬分之一）、BP211D（十萬分之一）型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

藁本內(nèi)酯（批號：MUST-12082702，純度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；阿魏酸（批號：MUST-12112204，純度≥99.32%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；川芎藥材（購自成都市國際商貿(mào)城藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館盧先明教授鑒定為傘形科藁本屬植物川芎）。所用水為超純水，高效液相用甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma Kromasil C18(250 nm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-0.1%冰醋酸（65∶35）；檢測波長：320 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL．min-1；進(jìn)樣量：10μl。

2.2 方法的專屬性

在上述色譜條件下，分別取對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣分析，在供試品色譜圖中，各色譜峰得到良好的分離，無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 對照品和川芎藥材色譜圖

2.3 供試品溶液的制備

取川芎藥材粉末（過3號篩）0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50mL。稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取阿魏酸對照品和藁本內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸15.984 μg、含藁本內(nèi)酯0.122 mg的混合對照品溶液。按“2.1.1”色譜條件，分別進(jìn)樣2、5、10、15、20 μl，測定，記錄各自峰面積，以對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得阿魏酸回歸方程：Y=4963.6X+20.246(r=0.9994)，藁本內(nèi)酯回歸方程：Y=2047.8X+41.195（r=0.9994)。阿魏酸在0.0320～0.3179 μg范圍內(nèi)，藁本內(nèi)酯在0.244～2.44 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

同一混合對照品溶液重復(fù)測定6次，計(jì)算阿魏酸、藁本內(nèi)酯的RSD分別為1.96%、1.38%，說明精密度良好。

2. 6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下的同一供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，12，24 h，照“2.1”色譜條件，進(jìn)樣分析，分別求得阿魏酸、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為1.73%、1.91%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2. 7 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批川芎藥材粉末約0.5 g，6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，照“2.1”色譜條件，進(jìn)樣分析，分別求得阿魏酸、藁本內(nèi)酯含量平均值分別為1.569 mg．g-1、12.232 mg．g-1；RSD分別為1.87%、1.16%。

2. 8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批川芎藥材粉末6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入混合對照品適量，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，照“2.1”色譜條件，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。阿魏酸、藁本內(nèi)酯平均回收率分別為98.4%、98.8%；RSD分別為1.41%、1.23%。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品測定

取不同批次川芎藥材粉末約0.5 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件，進(jìn)樣分析，分別計(jì)算其2種成分的含量，結(jié)果見表2。

表2 川芎藥材中阿魏酸和藁苯內(nèi)酯測定結(jié)果（n=2）

3 四川敖平 2012 1.436 12.751 4 四川敖平 2012 1.311 11.427 5 四川敖平 2013 1.564 12.268 6 四川敖平 2013 1.378 13.546 7 四川敖平 2013 1.452 12.039 8 四川都江堰 2012 1.699 13.778 9 四川都江堰石羊鎮(zhèn) 2013 1.546 18.62 10 四川都江堰石羊鎮(zhèn) 2013 1.772 13.573

3 討論

3.1 色譜條件的選取與優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)中有機(jī)相選擇甲醇，水相考察了冰醋酸、磷酸、甲酸。結(jié)果，以甲醇-0.1%冰醋酸水溶液能達(dá)到較好的分離效果，并且用等度洗脫的方法實(shí)現(xiàn)了阿魏酸和藁本內(nèi)酯的同時測定。

3.2 供試品溶液的制備方法考察

根據(jù)川芎化學(xué)成分，總結(jié)2010年版《中國藥典》川芎制劑中川芎提取溶劑，考察了甲醇、乙醇，結(jié)果兩種溶劑提取的阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量差別不大，又考慮甲醇毒性，所以選擇了乙醇作為提取溶劑。另外，同時比較了超聲和回流的提取方法，結(jié)果回流方法提取的量高于超聲提取。因此，采用以乙醇回流提取1小時作為供試品溶液的制備方法。

3.3 川芎藥材的貯存

在本實(shí)驗(yàn)過程中，作者發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，貯存川芎藥材粉末的封口袋上有粘滯的手感，而川芎藥材中的藁本內(nèi)酯的量有所降低。劉毅[10]等也發(fā)現(xiàn)川芎藥材以粉末狀態(tài)放置，藁本內(nèi)酯的量降低非常明顯，表面“泛油”現(xiàn)象嚴(yán)重。從不同批次川芎藥材測定結(jié)果中也可看出，2013年收集的川芎藥材中阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量均較2012年的高。因此，建議川芎藥材貯存時間不宜過長，不要以粉末狀態(tài)貯存，應(yīng)以原藥材保存為佳。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部) [S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:38.

[2] Hou Y Z,Zhao G R,Yang J,et al.Proective effect of Ligusticum chuanxiong and Angelica sinensis on endothelial cell damage induced by hydrogen peroxide[J].Life Sci, 2004,75(19):1775.

[3] Adluri R S,Shanmugavel M,Nagarajan D,et al.Influence of ferulic acid on nicotine-induced lipid peroxidation,DNA damage and infammation in experimental rats as compared to N-acetylcysteine[J].Toxicology,2008,243(20):317.

[4] 尚立芝,韋大文,王峰.川芎嗪對心肌缺血再灌注損份大鼠HSP25和p38MAPK表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23 (10):882.

[5] Yan R,Ko N L,Li S L,et al.Pharmacokinetics and Metabolism of Ligustilide,a Major Bioactive Component in Rhizoma Chuanxiong,in the Rat[J].Drug Metab Dispos,2008,36(2):400.

[6] 郝淑娟,張振學(xué),田洋,等.川芎化學(xué)成分研究[J].中國現(xiàn)代中藥,2010,12(3):22.

[7] Li S L,Yan R,Tam Y K,et al. Post-harvest alteration of the main chemical ingredients in Ligustcun chuanxiong Hort[J]. Chem Pharm Bull,2007,55:140.

[8] 張玲,劉友平,李旻,等.川芎化學(xué)成分分離鑒定與藁苯內(nèi)酯的含量測定[J].中國藥房,2010,21(15):1381.

[9] 陳立娜,金哲雄,蔣竟,等.川芎嗪提取工藝的研究[J].黑龍江醫(yī)藥,2000,13(5):278.

[10] 劉毅,劉素香,張鐵軍,等.HPLC法測定川芎中阿魏酸和藁本內(nèi)酯[J].藥物評價研究,2010,33(3):210.

（責(zé)任編輯: 胡慧玲）

Simultaneous determination of the content of ferulic acid and ligustilide in Chuanxiong by HPLC/

LV Wei, WU Lian,YE Na, LUO Hong-li, WANG Chun-yan, WAN Li//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective: To develop a HPLC method for simultaneous determination of the content of ferulic acid and ligustilide in Chuanxiong. Method: The analysis was performed an a Kromasil C18(250 nm×4.6 mm,5μm) column. The mobile phase consisted of methanol-0.1%glacial acetic acid(65:35).The fow rate was 1.0 mL．min-1. The detection wavelength was 320 nm and column temperature was 30℃. Result: The ferulic acid and ligustilide was separated perfectively. The standard curve was liner within the concentration range of 0.032 μg ～0.3179 μg for ferulic acid and 0.244 μg ～2.4 μg for ligustilide. The recovery was 98.4% for ferulic acid and 98.8% for ligustilide, respectively. Conclusion: The method is simple, accurate and reproducible, which can be used for the quality control of Chuanxiong.

HPLC; ferulic acid; ligustilide;Chuanxiong

R 284

A

1674-926X(2014)02-003-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

呂維（1989-），女，四川綿陽人，在讀碩士研究生，從事中藥有效成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

Tel:13618082932 Email:lvwei2007@126.com

萬麗，女，教授，從事中藥有效成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 Tel:15982418713 Email:wanli8801@163.com

2013-08-19