王春艷，閻斌倫

（淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇連云港 222005）

0 引言

抗生素抗藥基因作為一種新型環(huán)境污染物受到越來越廣泛的重視?？顾幓蚩赏ㄟ^基因水平轉(zhuǎn)移等方式在不同環(huán)境介質(zhì)間傳播并使其產(chǎn)生耐藥性［1］。整合子作為一種與耐藥基因水平傳播有關(guān)的可移動基因元件，通過基因盒的位點特異重組系統(tǒng)捕獲和轉(zhuǎn)移抗藥基因，同時提供啟動子實現(xiàn)基因盒的表達(dá)。作為攜帶多種耐藥基因的重組表達(dá)系統(tǒng)，整合子在廣泛的環(huán)境介質(zhì)中被檢出，已成為當(dāng)前抗性基因水平轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域的另一熱點［2－3］。目前公認(rèn)的整合子有Ⅳ類，其中第Ⅰ、Ⅱ類整合子是在捕獲和表達(dá)耐藥基因中最常見的［4－5］。

養(yǎng)殖環(huán)境作為抗藥因子的孳生地、儲藏庫和擴(kuò)散源，已引起全球性的關(guān)注。水產(chǎn)養(yǎng)殖易發(fā)生細(xì)菌性病害，水和底泥環(huán)境中微生物群落多樣性復(fù)雜，抗性基因宿主廣泛，有些病原菌本身也是人類病原菌，這些人畜共患病原菌耐藥性的獲得及其病害的發(fā)生和流行將會給人類帶來災(zāi)難性的后果。前期研究發(fā)現(xiàn)［6］，連云港贛榆縣水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)耐藥菌多為致病性弧菌，且對多種抗生素耐藥，因此繼續(xù)深入認(rèn)識和了解該地區(qū)耐藥菌的產(chǎn)生機(jī)制以及抗生素傳播途徑意義重大，能夠為有效控制抗藥基因污染提供理論依據(jù)，對合理使用抗生素及控制耐藥性的發(fā)生和擴(kuò)散起著極其重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 本研究前期成功從連云港贛榆縣九里鄉(xiāng)、海頭鎮(zhèn)和青口鹽場3個水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)篩選得到66株多抗性菌株［6］，將其作為檢測抗藥基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制的目標(biāo)菌種。

1.1.2 主要試劑和儀器 Taq DNA聚合酶（MBI，USA）；5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷（X－gal）（Sigma）；異丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）（Sigma），Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0（TaKaRa），pMD19－Tsimple Vector（TaKaRa），PTC－200TMPCR儀（BioRad），凝膠成像儀（BIORAD），電泳儀（BIORAD）。

1.2 樣品DNA提取

耐藥菌株采用水煮法快速提取基因組DNA。挑取適量菌苔于200μL雙蒸水中，煮沸10min，0℃快速冷卻5min，4℃10 000r／min離心5min，取上清液即可作為PCR擴(kuò)增的待用模板。

養(yǎng)殖區(qū)底泥樣品宏基因組DNA采用Fast PrepTMFP120（Thermo Electron Corp，USA）核酸提取儀進(jìn)行破碎前處理，F(xiàn)astDNA○R SPIN Kit for Soil快速提取試劑盒進(jìn)行提取。所有的DNA均取自0.3g左右的沉積物樣品。提取的基因組DNA用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，λDNA／HindⅢ（天根生化科技（北京）有限公司）作為標(biāo)準(zhǔn)的分子量標(biāo)記，－80℃保存。

1.3 整合子基因檢測

依據(jù)文獻(xiàn)［7］，通過引物IntI1－F／IntI1－R和In－tI2－F／IntI2－R對Ⅰ、Ⅱ類整合酶基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物5’－CS／3’－CS對整合子可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（終體積25μL）為100μmol／L dNTP，1.5μmol／L MgCl2，1×Taq buffer，2μmol／L primer，1.5UTaq DNA聚合酶，1μL DNA模板。無菌去離子水作為PCR反應(yīng)的負(fù)對照。

整合子PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55／50℃退火30s，72℃延伸60s，運行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

整合子可變區(qū)PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30s，58.5℃退火45s，72℃延伸2 min，運行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。D2000被用來作為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記。

1.4 底泥16SrRNA克隆文庫構(gòu)建

細(xì)菌克隆文庫構(gòu)建采用F27和R1492為引物進(jìn)行PCR，采用TaKaRa試劑盒進(jìn)行純化，純化后PCR產(chǎn)物通過連接試劑盒連接到pMD19－Tsimple Vector，將連接好的載體轉(zhuǎn)化入Top10大腸桿菌（TaKaRa）感受態(tài)細(xì)胞。在涂有X－gal和IPTG的氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取克隆子，采用特異引物RV－M和M13－47的PCR擴(kuò)增進(jìn)行插入片段的篩選。

1.5 測序及系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取PCR擴(kuò)增片段大小正確的陽性克隆以及整合子基因擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果運用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行核酸比對，確定克隆子菌屬以及整合酶、基因盒類型。利用Dotur軟件對全部克隆子進(jìn)行97%cutoff水平下的操作單元（OTU）劃分，選取已測核酸序列和最高相似度比對序列共同進(jìn)行分析，運用MEGA version 4.1軟件Neighbor－Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖1所示）。

2 結(jié)果與討論

2.1 整合子檢測結(jié)果

本項目對常見的Ⅰ類、Ⅱ類整合子進(jìn)行檢測，同時利用NCBI數(shù)據(jù)庫已有數(shù)據(jù)，對攜帶的耐藥基因盒進(jìn)行序列分析。利用特定引物對整合酶進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅱ類整合酶基因擴(kuò)增結(jié)果全部為陰性。Ⅰ類整合酶基因PCR產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符，經(jīng)測序和核酸序列同源性分析，與GenBank已知的Ⅰ類整合酶基因同源性為99%。在被檢測的66株多抗性菌種中，有42株攜帶Ⅰ類整合酶基因。對整合酶陽性樣品進(jìn)行基因盒區(qū)域擴(kuò)增，僅有兩個樣品被檢測到含有基因盒結(jié)構(gòu)，得到不同長度的片段，大小分別為1.08，0.79，0.49，0.23kb。根據(jù)克隆和測序結(jié)果可知，大小為0.23kb和0.49kb的短片段是空基因盒，沒有攜帶任何抗藥基因，1.08 kb和0.79kb的片段主要為攜帶編碼氨基糖苷類耐藥性的aadA1基因以及傳遞對甲氧芐啶類抗菌藥的dfr17基因。

由此可見，連云港贛榆縣3個養(yǎng)殖區(qū)采樣站位整合子類型以Ⅰ型為主，細(xì)菌對甲氧芐啶類、氨基糖甙類抗菌藥的耐藥性與基因盒的存在有直接關(guān)聯(lián)，但是其他類型的抗生素耐藥，如氨芐青霉素、土霉素、紅霉素，并沒有證據(jù)顯示與整合子捕獲基因盒有直接關(guān)系。整合子—基因盒系統(tǒng)已經(jīng)成為抗生素耐藥水平傳播的又一重要途徑。

圖1 16SrRNA基因克隆文庫構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of bacterial 16SrRNA clone library

2.2 底泥微生物群落調(diào)查結(jié)果

利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行克隆文庫構(gòu)建，得到底泥中微生物群落組成。3個站位共得到克隆子210個，核酸序列97%cutoff獲得OTU 98個（A33， B24，C41）。將測序16SrRNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列具有高相似度（≥97%）。結(jié)合最相似比對序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。3個站位細(xì)菌微生物群落多樣性豐富，其中弧菌屬是優(yōu)勢菌群，同時也發(fā)現(xiàn)黃桿菌屬、梭菌屬、硫酸鹽還原菌以及少量腸道致病菌。養(yǎng)殖區(qū)底泥微生物的多樣性為抗性基因的傳播提供了廣泛的宿主，某些致病菌抗性的獲得將會增加人類健康的風(fēng)險。

3 結(jié)論

對從連云港贛榆縣3個養(yǎng)殖場篩選得到的66株多抗性細(xì)菌進(jìn)行整合子基因檢測，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型整合子占據(jù)優(yōu)勢，Ⅱ型整合子未檢出。甲氧芐啶類、氨基糖甙類耐藥基因的形成與基因盒捕獲有關(guān)。整合子—基因盒系統(tǒng)已成為該調(diào)查區(qū)域重要的抗性基因傳播途徑。養(yǎng)殖區(qū)底泥微生物群落多樣性豐富，為抗性基因的傳播提供了廣泛宿主。耐藥基因傳播機(jī)制的深入研究，對海水養(yǎng)殖區(qū)域合理使用抗生素以及耐藥細(xì)菌污染預(yù)防提供了理論依據(jù)。

［1］ BARLOW R S，PEMBERTON J M，DESMARCHELIER P M，et al.Isolation and characterization of integron－containing bacteria without antibiotic selection［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（3）：838－842.

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［6］ 王春艷，閻斌倫.連云港市贛榆縣水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中哈氏弧菌耐藥性研究［J］.淮海工學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，22（1）：88－91.

［7］ WANG Chunyan，DANG Hongyue，DING Yongsheng.Incidence of diverse integrons andβ－lactamase genes in environmental Enterobacteriaceae isolates from Jiaozhou Bay，China［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24：2889－2896.