張雪輝，唐 蕊，徐立實，馬 錫

(邢臺學院化學工程與生物技術(shù)學院，河北 邢臺 054001)

生物防治具有安全、無殘留、無污染等優(yōu)點，隨著人們對蔬菜的數(shù)量和質(zhì)量需求的不斷提高，世界各國對生態(tài)環(huán)境保護的日益重視，植物病害的生物防治已成為重要的防治手段，并廣泛運用于生產(chǎn)，取得了顯著效果。其中利用植物病原菌的拮抗菌即生防菌對植物病害進行生物防治研究是當前的一大熱點，也將成為控制植物病害所的最佳選擇之一。目前，研究發(fā)現(xiàn)的生防菌的種類包括真菌、細菌和放線菌等，并且一些抑菌效果顯著的生防菌已經(jīng)開發(fā)應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如德國開發(fā)的商品制劑Contans WG可以用于防治萵苣菌核病，美國研制成功的Soil Gard，用于防治猝倒病和根腐，意大利研制的Biofox C專用于防治鐮刀菌屬病害[1]；芬蘭的Kemira用灰綠鏈霉菌研制的放線菌活體制劑Mycostop通過在植物的根部定殖、生長、繁殖來防治一些常見的土傳病害,且對植物沒有任何毒性[2]。但多數(shù)研究處于試驗研發(fā)階段。王遠山等發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌GH6菌株對煙草疫霉具有較好的拮抗作用[3]。張璐等利用從黃瓜根際土壤篩選的細菌DS-1、放線菌SG-126和細菌Q-2防治黃瓜枯萎病的效果分別為51.43%、42.86%和 37.50%[4]。燕嗣皇等[5]、周淑香等[6]發(fā)現(xiàn)木霉菌對人參銹腐病菌、西洋參立枯病菌及黃芪根腐病菌等藥用植物病原菌有較強的拮抗作用。本試驗從土壤中分離出一菌株XM-10，并測試了其對多種植物病原菌的拮抗作用，發(fā)現(xiàn)其抑菌活性較強，具有較為廣泛的抑菌譜，在此基礎(chǔ)上對其進行了初步鑒定，為該菌株開發(fā)成環(huán)境友好型生物制劑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

生防菌XM-10、黃瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌、大豆菌核病菌、棉枯萎病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、玉米大斑病菌、辣椒疫病病菌等(邢臺學院微生物實驗室提供)。

1.2 培養(yǎng)基

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaC1 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂 17 g，水 1000 mL,pH7.2～7.4。

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂17 g，水 1000 mL。

1.3 主要儀器

SPX-250B-Z型生化恒溫培養(yǎng)箱、ZWY-2102C雙層恒溫振蕩培養(yǎng)箱、Gene Pro基因擴增儀、凝膠成像儀、ZHJH-C1115B型無菌操作臺、TGL-20M臺式冷凍離心機等。

1.4 生防菌XM-10抑菌活性測定

以黃瓜枯萎、小麥赤霉等9種病原菌為靶標菌，活化培養(yǎng)，用打孔器打取直徑為1.0cm的菌盤，置于PDA平板的中央,在平板內(nèi)一側(cè)靠近邊緣的兩個點,接入放線菌XM-10,每個處理3個重復。于25℃培養(yǎng)4 d，測量抑菌帶，計算抑菌率[7]。

1.5 生防菌XM-10的鑒定

1.5.1 個體形態(tài)顯微觀察

在高氏一號培養(yǎng)平板上，接入生防菌XM-10菌體，在培養(yǎng)基上嵌入蓋玻片，待生防菌XM-10長到蓋玻片上后，取下蓋玻片，進行菌體形態(tài)顯微觀察。

1.5.2 菌落形態(tài)特征觀察

將生防菌XM-10接到高氏一號培養(yǎng)平板和PDA平板上，觀察其菌落特征。

1.5.3 16S rRNA序列分析

基因組DNA的提取參考文獻[8-9]所述方法進行。即將生防菌XM-10轉(zhuǎn)接到高氏一號液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d,取40 mL,1 0000 r/min,離心5 min,收集菌體，用生理鹽水洗滌2遍,取1 mL于1.5 mL離心管中充分懸浮菌體，每管加入300 mL TE溶液,再加入10 mg/mL的溶菌酶溶液10μL和20 mg/mL的蛋白酶K溶液6μL,充分搖勻,于37℃水浴2 h。每管加入10%SDS溶液20μL和0.5 mmol/L的EDTA溶液20μL,55℃水浴過夜。加等體積的Tris飽和酚溶液,充分搖勻，1 0000 r/min離心8 min,取上清轉(zhuǎn)至離心管中。向各管中添加等體積的24∶1的氯仿/異戊醇,充分搖勻,1 0000 r/min離心8 min,取上清轉(zhuǎn)至離心管中。加等體積異丙醇,-20℃沉淀30 min,8000 r/min離心5 min,棄上清，保留沉淀。加70%乙醇洗滌2次,每次用8000 r/min離心5 min,棄上清，保留白色沉淀。將各離心管倒置于無菌濾紙上,充分干燥后,加 30μL TE 溶液,4℃過夜,取 5μL，在 80 V電壓下進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察比較，采集圖像。

將經(jīng)酶法提取得到的生防菌XM-10總DNA進行16S rRNA的擴增[10]。PCR擴增正向引物為PA:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 反向引物 PB:5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR擴增條件為:95℃ 5 min；95℃ 1 min,54℃ 1 min,72℃ 3 min,35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化。

PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。再利用blast在線分析比對服務(wù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行相關(guān)有效種的相似性搜索,并結(jié)合形態(tài)特征，確定菌株的屬種。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性測定

生防菌XM-10對小麥赤霉等9種植物病原菌的抑制效果(表1)，對所測定的9種植物病原菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，抑菌率在47.8%～87.6%之間，其中對小麥赤霉病菌和黃瓜枯萎病菌的抑制率分別達到了87.6%和83.7%，抑菌帶在4.9～6.9 mm之間，其中對黃瓜枯萎病菌的抑菌帶最寬，達6.9 mm。表明其抑菌譜較廣。

表1 生防菌XM-10的抑菌活性

2.2 生防菌XM-10的鑒定

2.2.1 個體形態(tài)顯微觀察

對生防菌XM-10個體形態(tài)進行顯微觀察，總結(jié)特征如下：呈現(xiàn)大量細小的菌絲(圖1-1)，無隔、有分支。孢子絲長而直，少數(shù)頂端圈卷。孢子球形，表面光滑(圖 1-2)。

2.2.2 菌落形態(tài)特征觀察

在高氏一號培養(yǎng)基上XM-10菌落特征表現(xiàn)為灰色干燥粉末、圓形、菌落隆起，基生菌絲微黃色，不易挑取、與培養(yǎng)基較緊密的結(jié)合在一起，菌落也沒有霉菌菌落那么大和疏松。在PDA培養(yǎng)基上，呈鼠灰色至灰褐色，邊緣白色(圖1-3)。

圖1 生防菌XM-10個體形態(tài)及菌落特征

2.2.3 生防菌XM-10的16S rRNA序列分析

生防菌XM-10基因組DNA在凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像見圖2左。與marker相比，可以得知生防菌XM-10基因組DNA大于2000 bp。16S rRNA基因的PCR擴增產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像見圖2右。從圖中可以分析得知，PCR產(chǎn)物分子量大約在1500 bp左右。經(jīng)過16S rRNA基因測序，得知生防菌XM-10的16S rRNA基因序列的有效片段長度為1461 bp。經(jīng)Blast比對，與生防菌XM-10相似性最高有效種為黃灰鏈霉菌(Streptomyces flavogriseus ATCC 33331,相似性為98%)，委內(nèi)瑞拉鏈霉菌 (S.venezuelae ATCC 10712,相似性為98%)，灰色鏈霉菌 (S.griseus subsp.griseus NBRC 13350,相似性為98%),海洋鏈霉菌(S.sp.Sirex AA-E,相似性為98%)。根據(jù)上述分析結(jié)果，結(jié)合對生防菌XM-10菌落外部特征和菌體形態(tài)的觀察，可以初步判定生防菌XM-10為黃灰鏈霉菌。

圖2 基因組DNA和PCR產(chǎn)物電泳圖譜

3 討論

生物防治是環(huán)境友好的防治方法，可以減輕化學農(nóng)藥污染，符合高效環(huán)保的理念，有利于可持續(xù)發(fā)展，并有修復土壤生物多樣性的作用，極具開發(fā)潛力，成為當今研究和開發(fā)的熱點[11]。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，也是人口大國，不斷提高農(nóng)產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量勢在必行。篩選拮抗能力強、抑菌譜廣、抗逆性強以及在植物根際和土壤定殖能力強的植物病原菌的拮抗菌，是未來研發(fā)生防制劑的主要方向[12]。本試驗從土壤中分離出的菌株XM-10，對多種植物病原菌有較強的拮抗活性，具有較為廣泛的抑菌譜，因此該拮抗菌具有良好的應用潛力和前景。16S rRNA基因序列具有保守性、存在的普遍性和基因序列的穩(wěn)定性，使得16S rRNA基因序列分析的重現(xiàn)性極高[13]。同時16S rRNA基因序列具有功能和進化的同源性，分子大小適中，并攜有充分的生物信息，16S rRNA序列分析在現(xiàn)代微生物分類鑒定上發(fā)揮著越來越大的作用。本研究通過16S rRNA序列分析，結(jié)合個體形態(tài)特征和菌落特征觀察，將生防菌XM-10初步判定為黃灰鏈霉菌。

應用生防菌的活體制劑，會避免大量單一使用抗生素造成的破壞自然界微生物的平衡、造成自然選擇壓力等弊端，應用前景廣闊。本研究中生防菌XM-10是在抑菌試驗研究基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其具有較為廣泛的抑菌譜，有希望開發(fā)成廣譜的活體制劑。但生防菌在生產(chǎn)應用上存在一些問題，如在田間的定殖能力，生防菌的抗藥能力，菌種穩(wěn)定性問題等。因此，要充分發(fā)揮該拮抗菌的生防潛能，在理論和實踐上還需要進行大量的研究工作，如生防菌XM-10發(fā)酵條件優(yōu)化、活性物質(zhì)分離純化、抑菌機理研究及在田間施用后，在植物根際或土壤中的定殖能力，抗各種化學藥劑的能力及其遺傳穩(wěn)定性等。

[1]胡燕梅，楊 龍.利用微生物防治植物病害的研究進展[J].中國生物防治，2006(S1)：190-193.

[2]閆 霜，吳洪生，周曉冬，等.黃瓜枯萎病生物防治研究進展[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2011(1)：86-92.

[3]王遠山，王 平，胡正嘉.綠針假單胞菌GH6菌株對煙草疫霉的拮抗作用研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2002，21(3)：66.

[4]張 璐，杜秉海，魏 珉，等 .黃瓜枯萎病拮抗菌的生防效果及其對植株生長代謝的影響 [J].山東農(nóng)業(yè)科學，2007(4)：89-92.

[5]燕嗣皇，吳石平，陸德清 .木霉生防菌對根際微生物的影響與互作[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2005，18(1)：40.

[6]周淑香，李小宇，張連學，等.6株木霉菌對人參銹腐病的防治效果[J].中國生物防治，2010，26(2)：69.

[7]張紅丹，杜 茜，張正坤，等.放線菌769抑菌譜及液體培養(yǎng)生長曲線的測定[J].中國植保導刊，2010，7：5-9.

[8]黃大林，陳森洲，徐雅娟 .廣西紅樹林土壤放線菌的分離和DNA 的提取方法[J].廣西醫(yī)學，2008，30(11)：1657-1659.

[9]秦 盛，趙立興，陳 云，等 .藥用植物內(nèi)生放線菌的分離、篩選及活性菌株YIM-61470鑒定 [J].微生物學通報，2009，36(11)：1693-1699.

[10]趙麗明，丁延芹，路曉萌，等.西瓜根際枯萎病拮抗放線菌的篩選及鑒定[J].生物技術(shù)通報，2010(5)：107-110.

[11]趙曉宇，孟利強，沙長青，等.生防菌防治土傳真菌病害現(xiàn)狀及抗性物質(zhì)的研究進展 [J].國土與自然資源研究，2013，5：95-96.

[12]楊秀榮，劉水芳，孫淑琴.生防細菌防治土傳病害的研究進展[J].天津農(nóng)業(yè)科學，2008，14(4)：38-42.

[13]楊 霞，陳 陸，王川慶.16S rRNA基因序列分析技術(shù)在細菌分類中應用的研究進展[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2008，36(2)：55-60.