黃 俊，伍菲菲，賀利恒，張志偉*

(1.南華大學(xué) 腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001；2.邵陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校， 湖南 邵陽 422000；3.婁底市中心醫(yī)院，湖南 婁底 417000)

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miR-200c在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

黃 俊1,2，伍菲菲1,3，賀利恒1，張志偉1*

(1.南華大學(xué) 腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001；2.邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 湖南 邵陽 422000；3.婁底市中心醫(yī)院，湖南 婁底 417000)

目的：探討miR-200c(Homo sapiens miR-200c)在人胃癌組織的表達(dá)改變情況及其臨床意義。方法：采用原位雜交檢測40例正常人群胃黏膜組織以及121例胃癌患者組織中miR-200c的表達(dá)情況。結(jié)果：原位雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-200c在胃癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)。在121例胃癌組織中，miR-200c的表達(dá)水平與胃癌臨床分期(P<0.05)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)情況顯著相關(guān)。結(jié)論：miR-200c在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，其下調(diào)程度與胃癌臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。

miR-200c；胃癌；臨床意義

眾所周知，miRNA是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，人類miRNA充當(dāng)腫瘤基因或抑瘤基因的作用，調(diào)控其靶基因的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明，miRNA-200c通過靶基因ZEB1上調(diào)RASSF1A表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT效應(yīng)[2]，且miR-200c在乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[3-4]。以上研究結(jié)果提示，miR-200c表達(dá)下調(diào)可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正常胃黏膜組織樣本40例，胃癌組織樣本121例，上述組織芯片均由中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈(zèng)。

原位雜交探針：miR-200c miRCURYTM LNA custom detection probes (美國Exiqon公司)。

1.2 原位雜交

60℃烤片2h，二甲苯脫蠟，第1缸15min，第2缸25min，無水乙醇脫二甲苯5min；100%、85%、70%梯度酒精復(fù)水各5min，無酶水洗；3%過氧化氫室溫處理8min，無酶水洗1min×3次；3%胃蛋白酶37℃消化20min，PBS水洗5min×3次，無酶水洗1min×1次；1%多聚甲醛室溫固定10min，無酶水洗1min×3次；滴加適量預(yù)雜交液以覆蓋組織，55℃預(yù)雜交2h；將miR-200c探針按說明稀釋于滅菌無酶水中，終濃度為31nM，滴加適量雜交液以覆蓋組織，55℃雜交過夜，次日用2×SSC緩沖液洗5min×2次，0.5×SSC，0.2×SSC緩沖液洗各15mim×1次；滴加封閉液，37℃封閉30min；滴加生物素化鼠抗地高辛，室溫孵育2h，PBST緩沖液洗5min×4次；滴加SABC，室溫孵育30min，PBST緩沖液洗5min×3次；DAB顯色，0.75mL蒸餾水中加A、B、C顯色液各一滴，混勻，滴加至標(biāo)本上，顯微鏡下控制顯色，充分水洗；蘇木素染色，充分水洗，中性樹膠封片保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 原位雜交檢測miR-200c在胃癌及正常胃黏膜組織中表達(dá)情況

原位雜交結(jié)果表明，在121例胃癌芯片組織中，miR-200c陽性表達(dá)51例，陽性率為42.1%；40例正常胃黏膜組織中，miR-200c陽性表達(dá)31例，陽性率為77.5%，兩組比較差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 miR-200c表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

原位雜交結(jié)果顯示，miR-200c在121例胃癌組織中，70例低表達(dá)，51例高表達(dá)。采用軟件分析發(fā)現(xiàn)，miR-200c的表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡、細(xì)胞分化程度無顯著相關(guān)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)；miR-200c的表達(dá)隨著臨床分期的升高而降低，III～I(xiàn)V期胃癌組織中miR-200c的表達(dá)顯著低于I～I(xiàn)I期胃癌組織中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；胃癌患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-200c表達(dá)顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429，其是從兩個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而來。miR-200b-200a-429簇位于染色體1p36，miR-200c-141簇位于染色體12p13[1]。最近，有研究報(bào)導(dǎo)miR-200家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)，如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌以及胃癌等[5]。研究顯示，miR-200家族是抑癌基因，并且調(diào)控EMT。miR-200直接靶向EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2，而ZEB1和ZEB2可抑制鈣黏蛋白的表達(dá)。miR-200也通過靶向β-catenin mRNA 抑制β-catenin/Wnt 信號(hào)通路[3]，從而突出了miR-200在腫瘤中的侵襲和轉(zhuǎn)移作用。

本研究通過原位雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-200c在胃癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)。在121例胃癌組織中，miR-200c的表達(dá)水平與胃癌臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示miR-200c可能作為胃癌的預(yù)后相關(guān)分子。miRNA作為腫瘤基因或抑瘤基因這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究提供了新思路，也為腫瘤的防治、診斷、分子分型、預(yù)后以及療效監(jiān)測甚至輔助治療提供了新策略。筆者將繼續(xù)深入研究miR-200c在胃癌中的功能，系統(tǒng)闡明其參與胃癌發(fā)生發(fā)展可能的分子機(jī)制，為胃癌的防治提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] TANG H, DENG M, TANG Y, et al. miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression[J].Clin Cancer Res,2013,19(20):5602-5612.

[2] ILIOPOULOS D,LINDAHL-ALLEN M,POLYTARCHOU C,et al.Loss of miR-200 inhibition of Suz12 leads to polycomb-mediated repression required for the formation and maintenance of cancer stem cells[J]. Mol Cell,2010,39(5):761-772.

[3] SHIMONO Y, ZABALA M, CHO RW, et al. Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells[J]. Cell,2009,138(3):592-603.

[4] HOWE EN, COCHRANE DR, RICHER JK. Targets of miR-200c mediate suppression of cell motility and anoikis resistance[J].Breast Cancer Res, 2011,13(2):R45.

[5] CEPPI P, MUDDULURU G, KUMARSWAMY R, et al. Loss of miR-200c expression induces an aggressive, invasive, and chemoresistant phenotype in non-small cell lung cancer[J]. Molecular Cancer Research,2010(8):1207-1216.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2013-12-24

國家自然科學(xué)基金(81101643)

黃俊(1982-)，男，邵陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校講師，研究方向?yàn)槲赴┌l(fā)病分子機(jī)制。

張志偉，南華大學(xué)腫瘤研究所副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲赴┌l(fā)病分子機(jī)制。

R735.2

A

1673-2197(2014)08-0103-01