劉 穎，曹佳佶，章浩偉，何亞金，徐欣欣

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

低場核磁共振技術(shù)快速檢測鮮乳水分方法研究

劉 穎，曹佳佶，章浩偉，何亞金，徐欣欣

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

運用低場核磁共振技術(shù)研究鮮乳變質(zhì)過程中水分的變化規(guī)律，選取反轉(zhuǎn)恢復(fù)脈沖序列和Carr-Purcell-Meiboom-Gill序列測定鮮乳樣品在不同貯藏時間的弛豫參數(shù)，根據(jù)縱向弛豫時間T1、橫向弛豫時間T2觀測樣品的水分含量，并通過T2反演數(shù)據(jù)的擬合結(jié)果得出自由水和結(jié)合水的變化趨勢。研究表明，隨著貯藏時間的延長直至鮮乳變質(zhì)腐敗，鮮乳中的總水分先減少后增加，其中自由水減少，結(jié)合水先減少后增加。結(jié)果表明，低場核磁共振技術(shù)可用于快速、有效地判定鮮乳的新鮮程度，并有助于在鮮乳貯運過程中品質(zhì)的實時監(jiān)控。

低場核磁共振；弛豫時間；自由水；結(jié)合水；快速檢測

乳及乳制品含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1]，如人體日常所需的蛋白質(zhì)、鈣質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)等，且鮮乳作為所有乳制品的原料，其質(zhì)量直接影響乳制品的風(fēng)味、感官指標(biāo)、衛(wèi)生指標(biāo)以及營養(yǎng)價值，需從根源上密切關(guān)注鮮乳的品質(zhì)變化。可見，如何快速、有效地檢測鮮乳的新鮮度并對其品質(zhì)進行監(jiān)控具有重要的實際意義。

鮮乳是天然的培養(yǎng)基，極易腐敗變質(zhì)，而其變質(zhì)過程中除非出現(xiàn)強烈異味，否則難以覺察。鮮乳的含水量較高（約為87%），且食品中的水分是引起食品化學(xué)性及微生物性變質(zhì)的重要因素之一，直接關(guān)系到食品的貯藏特性。所以，鮮乳水分的快速檢測可作為觀察其新鮮度和變質(zhì)腐敗的有效途徑。但在食品分析方法中，水分含量測定往往難以獲得精確可靠的數(shù)據(jù)。傳統(tǒng)測定水分含量的方法主要包括卡爾·費休法、近紅外光譜法、電導(dǎo)測定法等，但存在操作煩瑣、費時、易受實驗操作產(chǎn)生誤差等缺點。而應(yīng)用核磁共振技術(shù)對所測樣品沒有限制，可實現(xiàn)快速無損檢測，在檢測速度、準(zhǔn)確度和靈敏度上都占有一定的優(yōu)勢[2-5]，是測量食品中水分含量的理想手段。本研究采用低場核磁共振技術(shù)（磁場強度為0.5 T），較高場磁共振儀造價低廉，易于廣泛應(yīng)用到食品檢測領(lǐng)域[6-8]。

本研究通過測定鮮乳樣品的弛豫時間參數(shù)，來觀測鮮乳水分隨貯藏時間延長的變化情況[9]。進一步反演、擬合T2數(shù)據(jù)，探討鮮乳在變質(zhì)過程中水分的結(jié)合狀態(tài)，分析對比自由水與結(jié)合水隨鮮乳放置時間的變化趨勢，從而快速、準(zhǔn)確的判定鮮乳的新鮮程度，有助于在鮮乳運輸或貯藏過程中品質(zhì)的實時監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

盒裝鮮乳 市購；1 mL吸管（獨立包裝） 美國Biologix公司；吸水紙 日本小津產(chǎn)業(yè)株式會社；8～12 mm硅膠試管塞 上海禾汽玻璃儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NMI20核磁共振分析儀（氫質(zhì)子共振頻率21.7 MHz，主磁場強度0.5 T，配套T2-Inverter反演軟件和10 mm× 200 mm核磁共振專用測試管） 上海紐邁科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低場磁共振測定水分原理

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)的基本原理是通過外加交變磁場激發(fā)處于靜磁場中的原子核，使其自旋能級發(fā)生塞曼分裂，進而脫離靜止、低能的平衡狀態(tài)[10]。在停止射頻脈沖后，原子核從非平衡狀態(tài)恢復(fù)至平衡狀態(tài)，其縱向磁化矢量方向和橫向磁化矢量方向恢復(fù)平衡所用的時間，即為研究中重要磁共振參數(shù)：縱向弛豫時間T1和橫向弛豫時間T2[11-12]。食品中水分的研究基于低場核磁共振的工作原理，利用水分子中氫原子核在磁場中的活動特性，分析研究食品的水分變化情況[13-15]。水分含量的多少直接影響著組織的平均弛豫時間[16]，弛豫時間越短表明水分子與大分子結(jié)構(gòu)結(jié)合越緊密，弛豫時間越長表明水分子越自由[17]。綜合分析縱向弛豫時間T1和橫向弛豫時間T2所提供的水分子結(jié)合力和流動性質(zhì)等信息[18]，可進一步觀測自由水與結(jié)合水的存在狀態(tài)。

1.3.2 測定鮮乳水分的脈沖序列選取

在食品研究領(lǐng)域中最常用的磁共振方法是檢測樣品1H質(zhì)子的弛豫時間T2，因為其 用時較短，可同時得到樣品中多種組分的信息。但當(dāng)橫向弛豫時間T2檢測不能得到所有需要信息時，如水分子的結(jié)合性和流動性等信息，可利用縱向弛豫時間T1進行輔助檢測，進一步分析樣品中各成分與周圍環(huán)境的特征，得到所需信息[19]。在核磁共振系統(tǒng)中通過射頻脈沖產(chǎn)生射頻磁場，從而驅(qū)動激發(fā)磁化矢量，產(chǎn)生核磁共振信號的動力源。所以，不同射頻脈沖形式所產(chǎn)生的作用是不同的。在食品研究中，測量橫向弛豫時間T2常用的脈沖序列有硬脈沖FID序列、硬脈沖回波序列和Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列等；測量縱向弛豫時間T1常用的脈沖序列是反轉(zhuǎn)恢復(fù)脈沖（inversion-recovery，IR）序列和飽和恢復(fù)脈沖（saturation-recovery，SR）序列等。

在本研究中， 測量縱向弛豫時間T1序列脈沖的選取考慮到SR序列雖然要求的采集數(shù)據(jù)相對 較少，但計算結(jié)果精確度相對較差。所以選用IR序列測量縱向弛豫時間T1值。在選取脈沖序列測量橫向弛豫時間T2時，因CPMG脈沖序列能夠克服磁場不均勻性及分子擴散效應(yīng)所產(chǎn)生的影響[20]，且實驗對象為鮮乳，其中水分含量約占87%，弛豫速度相對較慢，克服了CPMG脈沖序列難以測試衰減速度較快物質(zhì)的缺點[21]，可采集到完整的數(shù)據(jù)信號，并準(zhǔn)確地測得樣品的橫向弛豫時間T2值。

1.3.3 鮮乳的取樣與貯藏

將剛生產(chǎn)的市售盒裝鮮乳迅速帶至實驗室進行取樣，采用獨立包裝的巴氏吸管滴取1 mL鮮乳至核磁專用檢測管中，避免取樣過程中交叉污染引起鮮乳樣品的變質(zhì)。用硅膠試管塞密封，防止樣品中水分的自然蒸發(fā)和外界潮濕空氣對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。將樣品置于射頻線圈中心，在30 ℃的低場磁共振儀恒溫箱的條件下，在貯藏0、24、48、72、96 h后分別測定樣品的弛豫特征值。實驗取3 份平行，編號為1～3號，每份平行測5 次，測得弛豫參數(shù)的平均值。

1.3.4 NMR弛豫時間測定

利用反轉(zhuǎn)恢復(fù)脈沖IR序列和硬脈沖CPMG序列測定樣品的縱向弛豫時間T1和橫向弛豫時間T2，使樣品中心、射頻線圈中心和磁體中心保持在同一位置。IR實驗采用的參數(shù)：重復(fù)時間（repetition time，TR）1 000 ms、采樣點數(shù)（number of data points，TD）1024、譜寬（spectral width，SW）100 kHz、累加采集次數(shù)（number of signal，NS）16，逐步改變反轉(zhuǎn)時間記錄累加數(shù)據(jù)的傅里葉變換頻譜峰值，利用T1擬合程序得到T1測量值。CPMG實驗采用的參數(shù)：90o射頻時間（P1）16 μs、180o射頻時間（P2）32 μs、90o和180o射頻之間的時間間隔（D1）100 μs、回波點數(shù)（C1）32，利用T2擬合程序進行雙組分?jǐn)M合得到T2測量值。每間隔24 h測定樣品的弛豫時間T1、T2，考察弛豫參數(shù)的變化，分析樣品中水分變化和結(jié)合狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮乳水分弛豫時間的變化趨勢

采用反轉(zhuǎn)恢復(fù)脈沖IR序列及CPMG脈沖序列分別測定1～3號鮮乳樣品的縱向弛豫時間T1、橫向弛豫時間T2，得到3 組鮮乳樣品的弛豫參數(shù)T1、T2的平均值隨貯藏時間延長的變化過程如圖1所示。

從圖1可觀察到縱向弛豫時間T1隨時間的延長呈現(xiàn)“倒拋物”形態(tài)，即縱向弛豫時間先增大后減小。對比分析表1中T1數(shù)據(jù)可得，鮮乳在貯藏48 h后，縱向弛豫參數(shù)T1增大到800 ms左右，隨后又出現(xiàn)明顯減小趨勢下降至700 ms左右。在最初的48 h內(nèi)，T1快速增大，而在48～96 h內(nèi)T1不斷減小，并且最終的T1值大于初始值?？v向弛豫時間T1可以從分子角度闡明氫質(zhì)子所處環(huán)境，在0～48 h內(nèi)縱向弛豫時間T1變長表示自由水含量更占優(yōu)勢；在48～96 h內(nèi)縱向弛豫時間T1變短表示結(jié)合水比例逐漸增大。同時，縱向弛豫時間T1值的大小與以拉莫爾頻率移動的氫質(zhì)子數(shù)目呈反比，因此可推測出鮮乳中總水量先減小后增加。

圖1 弛豫時間T1、T2與貯藏時間之間的關(guān)系Fig.1 Relationship between T1or T2relaxation time and storage time

表1 1～3號樣品在不同貯藏時間的T1值Table 1 T1values of samples No.1, 2 and 3 during different storage times

表2 1～3號樣品在不同貯藏時間的T2值Table 2 T2values of samples No. 1, 2 and 3 during different storage times

為了進一步研究不同自由度的氫質(zhì)子在物質(zhì)內(nèi)部的情況，由圖1觀察到3 組鮮乳的橫向弛豫時間T2隨時間逐漸遞減，從表2的T2實驗數(shù)據(jù)可知，3 組鮮乳樣品的橫向弛豫時間T2在96 h內(nèi)由125 ms左右持續(xù)縮短至106 ms左右，T2值的減小表明水分中氫質(zhì)子的自由度不斷降低。

結(jié)合縱向弛豫時間T1的變化情況進行綜合分析，鮮乳樣品在0～48 h內(nèi)，T2值減小則氫質(zhì)子自由度降低，表示自由水比例減小，而同時T1變長表示鮮乳中自由水比例仍大于結(jié)合水比例；在48～96 h內(nèi)，T2值仍然減小則氫質(zhì)子自由度持續(xù)降低，自由水比例繼續(xù)減小，且T1變短表示鮮乳中結(jié)合水比例增大。

2.2 鮮乳水分的不同結(jié)合狀態(tài)

由于弛豫時間信號T1、T2反映的是鮮乳樣品內(nèi)部處于不同環(huán)境中的氫質(zhì)子弛豫信號的總和，為了更直觀、詳細地了解各種環(huán)境下氫質(zhì)子的弛豫情況，對采集到的橫向弛豫時間T2數(shù)據(jù)進行反演[22]。以1號試管為樣例，將鮮乳樣品的橫向弛豫時間T2數(shù)據(jù)導(dǎo)入T2-Inverter反演軟件中進行反演計算，得到結(jié)合水和自由水質(zhì)子密度圖譜T21、T22。將不同時期的自由水質(zhì)子密度T21和結(jié)合水質(zhì)子密度T22數(shù)據(jù)進行擬合處理，繪制成圖2所示的反演信號趨勢圖。由于2號、3號樣品的反演信號的擬合趨勢與1 號樣品一致，故直接選取1號樣品擬合曲線所表示的樣品信息進行分析。

圖2 1號樣品自由水、結(jié)合水及總水量反演信號趨勢Fig.2 Trends of free water, bound water and water content in sample No. 1

弛豫時間T21其質(zhì)子密度較低，代表與大分子結(jié)合較緊密的質(zhì)子，可反映結(jié)合水的變化情況。弛豫時間T22其質(zhì)子密度較高，代表自由度大的質(zhì)子，可反映自由水的變化情況。由圖2可觀察到，結(jié)合水質(zhì)子密度T21呈先降低后升高的趨勢，自由水質(zhì)子密度T22呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。在鮮乳的變質(zhì)過程中，當(dāng)其含有的動物體抗菌物質(zhì)減少或消失后，存在于鮮乳中的微生物如乳鏈球菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和一些蛋白質(zhì)分解菌等開始生長繁殖[23]。在0～72 h內(nèi)，乳酸鏈球菌的生長占優(yōu)勢，在乳酸菌、酵母菌和水的作用下，加速分解乳糖和其他糖類產(chǎn)生乳酸，自由水含量快速減少。同時，蛋白質(zhì)在遇酸和蛋白質(zhì)分解菌的共同作用下發(fā)生變質(zhì)，蛋白質(zhì)分子表面的親水基團以氫鍵緊密結(jié)合的結(jié)合水分子層消失，結(jié)合水含量逐漸減少。在72～96 h內(nèi)，鮮乳中的乳糖含量已基本消耗，脂肪含量相對較高，在脂肪酶的催化作用下逐次水解，自由水含量持續(xù)減少。并伴隨著如芽孢桿菌、假單胞菌、變形桿菌等腐敗細菌的生長繁殖，吸收水分轉(zhuǎn)化為細菌細胞體內(nèi)的結(jié)合水，結(jié)合水含量增加。

為了進一步觀測總含水量的變化趨勢，對每組對應(yīng)的自由水與結(jié)合水反演信號疊加后得到總水分的反演信號值，并通過對總水分反演信號值進行擬合，得到鮮乳中水分隨貯藏時間延長的變化趨勢。由圖2中擬合得到的總水量關(guān)于時間變化的曲線，可以觀察到含水量的反演信號值從4 000 ms左右起始呈現(xiàn)下降趨勢，且在0～48 h時間段內(nèi)下降趨勢明顯，隨著貯藏時間的延長，下降速度變得平緩，在72 h之后總水分反演信號值出現(xiàn)小幅回升，但96 h的反演信號值遠小于0 h的初始值?？梢?，鮮乳中總水量隨貯藏時間的延長直至鮮乳變質(zhì)的過程中呈現(xiàn)先快速減少后小幅增加的趨勢。總體而 言，鮮乳腐敗變質(zhì)時的總水量較其新鮮時明顯減少。

采集鮮乳樣品及其存放96 h后的橫向弛豫時間T2數(shù)據(jù)并反演得到結(jié)合水質(zhì)子信號T21、自由水質(zhì)子信號T22，測得3 份樣品信號幅值的均值，分析對比新鮮牛乳與變質(zhì)牛乳的結(jié)合水與自由水信號比例變化如圖3所示。

圖3 樣品自由水與結(jié)合水比例對比（0 h和96 h）Fig.3 Comparison of bound water and free water proportion (0 and 96 h)

表3 樣品自由水與結(jié)合水反演信號及比值(0 h和96 h)TTaabbllee 33 SSiiggnnaall rraattiioo ooff bboouunndd wwaatteerr ttoo ffrreeee wwaatteerr ((00 aanndd 9966 hh))

由圖3中的數(shù)據(jù)并結(jié)合前文弛豫時間T1、T2檢測法得到的實驗結(jié)果，分析可得結(jié)合水在牛乳含水量中的比例增大，自由水在牛乳含水量中的比例減小。根據(jù)表3對比可知，變質(zhì)腐敗的牛乳較新鮮牛乳而言，結(jié)合水與自由水反演信號幅值的比值較大。所以，結(jié)合水與自由水的比值可以作為牛乳品質(zhì)監(jiān)測及快速檢測牛乳腐敗的依據(jù)。

3 結(jié) 論

鮮乳是天然的培養(yǎng)基，在貯藏過程中受微生物的影響極易發(fā)生腐敗變質(zhì)，且內(nèi)部物質(zhì)成分變化復(fù)雜，從而引發(fā)鮮乳水分結(jié)構(gòu)和流動性的不斷變化。本研究主要利用低場核磁共振技術(shù)檢測鮮乳水分隨貯藏時間延長的變化情況，和傳統(tǒng)的乳制品水分檢測方法相比，低場核磁共振檢測方法具有以下優(yōu)勢：快速無損的檢測手段，在檢測過程中不會對食品的品質(zhì)、風(fēng)味等各方面因素造成任何的影響；實驗操作方便，實驗的可重復(fù)性比較高且精確度高；受樣本大小和外觀色澤的影響較小，只需少量樣本便可測定該食品的品質(zhì)狀況；通過宏觀檢測提供分子和質(zhì)子水平的信息，可更方便快捷地研究樣品分子環(huán)境。結(jié)果表明：鮮乳在變質(zhì)過程中的總水分先減少后增加，其中自由水減少，結(jié)合水先減少后增加。該研究有助于鮮乳在貯藏過程中快速檢測和品質(zhì)監(jiān)控，為乳制品行業(yè)及相關(guān)監(jiān)管部門監(jiān)測、控制和評價鮮乳的品質(zhì)提供了新的研究思路和有效手段，并為進一步研究牛乳摻水、鮮乳的貨架期、運輸過程中鮮乳的驗收及質(zhì)量評價等問題提供了理論依據(jù)。

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Rapid Detection of Water Content in Fresh Milk by Low-Field Nuclear Magnetic Resonance

LIU Ying, CAO Jia-ji, ZHANG Hao-wei, HE Ya-jin, XU Xin-xin
(College of Medical Instrument and Food Sciences, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

Low-f i eld nuclear magnetic resonance (LF-NMR) was used to study the change of water content in fresh milk during the deterioration process. IR pulse sequence and carr-purcell-meiboom-gill (CPMG) pulse sequence were selected to determine relaxation parameters of fresh milk sample at different storage times. According to the collected relaxation time T1and T2, the water content of milk samples could be observed. Furthermore, the changing trend s of free water and bound water were concluded by fi tting T2inversion data. This research showed that the total water content of fresh milk decreased fi rstly and then increased with the extension of storage time, among which the free water decreased continuously, and the bound water decreased initially and subsequently increased. The experimental results demonstrated that LF-NMR could be applied to determine the freshness of milk rapidly and eff i ciently, which will be benef i cial to monitor the quality of fresh milk in real time during transportation or storage.

low-field nuclear magnetic resonance (LF-NMR); relaxation time; free water; bound water; rapid detection

TS207

A

1002-6630（2014）14-0093-04

10.7506/spkx1002-6630-201414018

2014-03-12

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（61101174）；上海理工大學(xué)核心課程建設(shè)項目；教委卓越工程師培養(yǎng)計劃項目；大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（XJ2013250）

劉穎（1980—），女，副教授，博士，研究方向為核磁共振技術(shù)。E-mail：ling2431@163.com