孟 甜，黃韜睿，李玉鋒

（1.四川旅游學(xué)院烹飪系，四川 成都 610100；2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

響應(yīng)面法優(yōu)化郫縣豆瓣制曲工藝

孟 甜1，黃韜睿1，李玉鋒2

（1.四川旅游學(xué)院烹飪系，四川 成都 610100；2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken法分析優(yōu)化郫縣豆瓣制曲工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取曲精量、制曲溫度、制曲時(shí)間為響應(yīng)因素，以成曲質(zhì)量指標(biāo)（蛋白酶活力和α-淀粉酶活力）綜合評(píng)分為響應(yīng)值，建立回歸模型，并結(jié)合實(shí)際操作情況，得出郫縣豆瓣最佳制曲工藝條件為：曲精量0.28%、制曲溫度33.50 ℃、制曲時(shí)間32.50 h，此時(shí)成曲質(zhì)量指標(biāo)綜合評(píng)分為98.23。

Box-Behnken法；優(yōu)化；郫縣豆瓣；制曲工藝

郫縣豆瓣是最為出名的四川調(diào)味品之一，被譽(yù)為川菜之魂[1-2]，以色澤油潤紅亮、醬香濃郁、味鮮辣醇和、外觀黏稠絨實(shí)等特點(diǎn)著稱[3-4]。在許多經(jīng)典川菜如麻婆豆腐、回鍋肉等的烹調(diào)中都必不可少，而且還是四川火鍋底料中的主料，不僅增色提味，還別具風(fēng)味。

傳統(tǒng)郫縣豆瓣以豆瓣為原料，霉菌為主要微生物菌種，經(jīng)自然制曲、天然發(fā)酵而成[5]。制曲的目的是通過米曲霉等菌種在原料上生長(zhǎng)繁殖，以便于在發(fā)酵時(shí)利用它們所分泌的多種酶類。這種方法通常需要7～8 d，受到季節(jié)限制不能常年生產(chǎn)，且成曲質(zhì)量也不穩(wěn)定[6]。而豆瓣質(zhì)量的好壞關(guān)鍵在于制曲質(zhì)量，因此在整個(gè)生產(chǎn)過程中制曲環(huán)節(jié)顯得尤為重要，是豆瓣生產(chǎn)中最重要的質(zhì)量控制點(diǎn)[7]。目前對(duì)豆瓣發(fā)酵工藝研究較多[8-12]，而制曲工藝的報(bào)道卻較少。為了對(duì)傳統(tǒng)的制曲工藝進(jìn)行優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken法，以成曲中蛋白酶活力和α-淀粉酶活力為指標(biāo)，對(duì)影響成曲質(zhì)量的主要因素進(jìn)行研究，并對(duì)結(jié)果加以驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 菌種

滬釀3.042號(hào)米曲霉 中國科學(xué)院成都分院。

1.2 試劑

鉬酸鈉、鎢酸鈉、硫酸鋰、磷酸、濃鹽酸、碳酸鈉、三氯乙酸、硼酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、碘液 成都科龍化工試劑廠。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；ISO9001電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-25型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；TMQ-R-3250自動(dòng)臺(tái)式滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.4 方法[13]

1.4.1 蛋白酶活力測(cè)定

稱取充分研細(xì)的成曲5 g，加水至100 mL，在40 ℃水浴內(nèi)間斷攪拌1 h，過濾，濾液用pH 7.2磷酸緩沖液稀釋至一定倍數(shù)；取樣品稀釋液1 mL，置于40 ℃水浴中預(yù)熱2 min，再加入同樣預(yù)熱的酪蛋白溶液1 mL，精確保溫10 min，時(shí)間到后立即再加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)；繼續(xù)置于水浴保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后過濾，取濾液1 mL，再加0.4 mol/L碳酸鈉5 mL、已稀釋的福林試劑1 mL搖勻，40 ℃保溫發(fā)色20 min后，680 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白[14]。

在40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位，以U/g干基表示。

1.4.2 α-淀粉酶活力測(cè)定

取2%可溶性淀粉20 mL和pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液5 mL于25 mm×200 mm試管中，在60 ℃恒溫水浴中預(yù)熱4～5 min。加入預(yù)先稀釋的酶液0.5 mL，立即記錄時(shí)間，充分搖勻，定時(shí)用吸管取出反應(yīng)液0.5 mL，滴于預(yù)先充滿比色稀碘液（約1.5 mL）的白瓷板空穴內(nèi)。當(dāng)穴內(nèi)顏色反應(yīng)由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色，與標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色相同時(shí)，即為反應(yīng)終點(diǎn)，并記錄時(shí)間/min。1 mL酶液于60 ℃、pH 6.0條件下，1 h液化1 g可溶性淀粉，即為1個(gè)酶活力單位，以U/g干基表示。

1.5 制曲工藝

取蒸熟冷卻后的蠶豆和小麥（質(zhì)量比4：1）500 g，加入已與面粉拌和后的曲精（曲精、面粉質(zhì)量比1：10），充分拌勻，攤平，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)工藝條件進(jìn)行培養(yǎng)，中間翻曲一次。其中，曲精呈黃綠色、無夾心、無灰黑絨毛及其他異色，孢子數(shù)經(jīng)測(cè)定[15]約為17×109個(gè)/g（干基計(jì)），細(xì)菌數(shù)低于104個(gè)/g。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 單因素試驗(yàn)

以蛋白酶活力和α-淀粉酶活力為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)依次對(duì)曲精量、制曲溫度、制曲時(shí)間進(jìn)行考察，試驗(yàn)水平分別選取曲精量質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%；制曲溫度25、28、31、34、37、40 ℃；制曲時(shí)間12、18、24、30、36、42、48 h。

1.6.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)方案。響應(yīng)變量Y為根據(jù)蛋白酶活力和α-淀粉酶活力在成曲質(zhì)量中的重要性求加權(quán)和得到的綜合評(píng)分。自變量A為曲精量、B為制曲溫度、C為制曲時(shí)間。本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、模型建立及數(shù)據(jù)分析，利用Design Expert 8.0.5軟件輔助完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 曲精量考察

接種曲精量直接影響豆瓣制曲的周期。接種量大可縮短制曲周期，減少雜菌污染機(jī)會(huì)；但接種量過大，營養(yǎng)物質(zhì)主要被用于菌體細(xì)胞增長(zhǎng)，并產(chǎn)生大量代謝廢物，導(dǎo)致微生物所處環(huán)境惡化，菌體細(xì)胞會(huì)較早衰老，且有限的營養(yǎng)物質(zhì)也不足以維持米曲霉的生長(zhǎng)所需，會(huì)形成大量休眠孢子，降低酶活力；接種量過小，微生物生長(zhǎng)繁殖不足，使得營養(yǎng)過剩，造成浪費(fèi)，增加生產(chǎn)成本[16]。選定制曲時(shí)間30 h、制曲溫度30 ℃，考察曲精量對(duì)成曲質(zhì)量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 曲精量對(duì)蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影響Fig.1 Effect of inoculum amount on protease activity and α-amylase activity

由圖1可知，蛋白酶活力和α-淀粉酶活力隨接種曲精量的增加而增大，達(dá)到最大值時(shí)的曲精量分別為0.25%、0.35%，相應(yīng)的酶活力分別為2 135.81、133.45 U/g；隨著接種量的持續(xù)增加，酶活力呈逐漸減小趨勢(shì)。因此，控制接種曲精量在0.25%～0.35%。

2.1.2 制曲溫度考察

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素之一。一般來講，溫度低于25 ℃霉菌發(fā)芽緩慢；溫度高于38 ℃，也不利于霉菌發(fā)芽，反而適合細(xì)菌的發(fā)育繁殖，易染雜菌，影響制曲[17-18]。在溫度控制適當(dāng)時(shí)，米曲霉占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，可以抑制雜菌生長(zhǎng)，空氣中的雜菌只能少量繁殖，對(duì)成曲的質(zhì)量影響不大。選定接種曲精量為0.25 %，制曲時(shí)間30 h，考察制曲溫度對(duì)成曲質(zhì)量的影響，結(jié)果如圖2所示。蛋白酶活力和α-淀粉酶活力隨著制曲溫度的升高而增大，達(dá)到最大值時(shí)的溫度分別為34、31 ℃；隨著制曲溫度的繼續(xù)升高，酶活力呈逐漸減小趨勢(shì)。因此，控制制曲溫度在31～34 ℃。

圖2 制曲溫度對(duì)蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影響Fig.2 Effect of koji-making temperature on protease activity and α-amylase activity

2.1.3 制曲時(shí)間考察

制曲時(shí)間對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖有著重要影響。制曲時(shí)間過短，微生物生長(zhǎng)沒有達(dá)到最佳，原料利用率低，酶活力不高；制曲時(shí)間過長(zhǎng)，酶活力反而逐漸下降，同時(shí)由于微生物的生長(zhǎng)繁殖，又需要多消耗原料，增加了浪費(fèi)，而且影響制曲設(shè)備的周轉(zhuǎn)、增加通風(fēng)機(jī)電力消耗[19]。因此以酶活力達(dá)到最高點(diǎn)為依據(jù)制定制曲時(shí)間。選定接種曲精量為0.25 %、制曲溫度31 ℃，考察制曲時(shí)間對(duì)成曲質(zhì)量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 制曲時(shí)間對(duì)蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影響Fig.3 Effect of koji-making time on protease activity and α-amylase activity

由圖3可知，隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶活力和α-淀粉酶活力逐漸增大，二者達(dá)到峰值的時(shí)間分別為30、36 h；繼續(xù)延長(zhǎng)制曲時(shí)間，蛋白酶活力和α-淀粉酶活力逐漸減小。因此選擇制曲時(shí)間在30～36 h之間。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。對(duì)表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得成曲質(zhì)量指標(biāo)（蛋白酶活力和α-淀粉酶活力）的綜合評(píng)分Y對(duì)自變量曲精量（A）、制曲溫度（B）、制曲時(shí)間（C）的多元回歸方程：

該模型方差分析結(jié)果見表2。對(duì)成曲質(zhì)量綜合評(píng)分所建立的回歸模型極顯著（P＜0.000 1），且各因子系數(shù)均有意義，試驗(yàn)的3 個(gè)因素對(duì)蛋白酶活力的曲面效應(yīng)皆顯著，對(duì)綜合評(píng)分的交互影響中，AB、AC交互作用顯著。此外，回歸模型的診斷分析表明，相關(guān)系數(shù)R2= 0.994 2，模型的信噪比為25.293，一般認(rèn)為模型的可接受信噪比大于4，說明模型的擬合度和可信度非常高；變異系數(shù)越小說明試驗(yàn)可靠性越高，本試驗(yàn)的變異系數(shù)為1.73，說明試驗(yàn)可靠性良好。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)矩陣響應(yīng)數(shù)據(jù)結(jié)果Table 1 Box-Behnken design matrix with experimental results and response valluueess

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the regression model

為更直觀地反映響應(yīng)因素對(duì)響應(yīng)值的影響，對(duì)獲得的回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面圖及等高線圖分析，結(jié)果如圖4所示?？梢钥闯觯? 個(gè)響應(yīng)因素在選定的范圍內(nèi)都存在響應(yīng)極值，AB、AC交互作用顯著，BC交互作用不顯著，結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致。由等高線和響應(yīng)面圖分析，結(jié)合回歸模型可以預(yù)測(cè)出當(dāng)曲精量（A）為0.28%、制曲溫度（B）33.67 ℃、制曲時(shí)間（C）32.73 h時(shí)，成曲質(zhì)量指標(biāo)綜合評(píng)分為98.69。

圖4 各因素及其相互作用影響綜合評(píng)分的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of independent variables on comprehensive quality score

2.3 回歸模型的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為驗(yàn)證預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的擬合程度及方程的合適性、有效性，采用綜合評(píng)分最大響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的響應(yīng)因素值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，考慮到實(shí)際操作的方便及工藝的實(shí)際情況，對(duì)響應(yīng)因素值進(jìn)行修正，曲精量（A）為0.28 %、制曲溫度（B）33.50 ℃、制曲時(shí)間（C）32.50 h，經(jīng)過3 組平行實(shí)驗(yàn)，綜合評(píng)分平均值為98.23，預(yù)測(cè)結(jié)果（98.69）與實(shí)驗(yàn)值相對(duì)偏差僅為0.47%，此時(shí)蛋白酶活力和α-淀粉酶活力平均值分別為2 071.06 U/g、138.72 U/g。證明模型是合適有效的，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。在后期發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中[20]，測(cè)得豆瓣的氨基酸態(tài)氮含量為1.95 g/100 g，全氮利用率可達(dá)90%以上，與制曲工藝優(yōu)化前相比提高了10%左右。

3 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，曲精量、制曲溫度、制曲時(shí)間對(duì)郫縣豆瓣制曲過程中米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力、α-淀粉酶活力均有顯著影響，顯著順序?yàn)榍浚局魄鷷r(shí)間＞制曲溫度，而且各因素存在一定的交互作用。

通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)得出郫縣豆瓣最優(yōu)的制曲工藝條件為：接種曲精量0.28%、制曲溫度33.50 ℃、制曲時(shí)間32.50 h，在此條件下成曲質(zhì)量指標(biāo)綜合評(píng)分可達(dá)98以上。同時(shí)，在本試驗(yàn)范圍內(nèi)建立的回歸模型可靠有效，可用來預(yù)測(cè)設(shè)定條件范圍內(nèi)郫縣豆瓣制曲工藝參數(shù)的響應(yīng)值，且擬合度較好，在此條件下，豆瓣的氨基酸態(tài)氮含量為1.95 g/100 g豆瓣，全氮利用率達(dá)90%以上，與制曲工藝優(yōu)化前相比提高了10%左右。研究結(jié)果可為郫縣豆瓣傳統(tǒng)制曲工藝的改進(jìn)提供參數(shù)借鑒。

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Optimization of the Preparation of Pi’xian Bean Sauce Koji by Response Surface Methodology

MENG Tian1, HUANG Tao-rui1, LI Yu-feng2
(1. Department of Cuisine, Sichuan Tourism University, Chengdu 610100, China; 2. College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

Response surface methodology using Box-Behnken design was employed to optimize the preparation of Pi’xian bean sauce koji. Based on single-factor experiments, inoculum amount, koji-making temperature and time were chosen as independent variables, and the comprehensive evaluation score of koji quality indicators (protease activity and α-amylase activity) was the response variable. As a result, a mathematical model was established by Box-Behnken design. The optimal preparation conditions for Pi’xian bean sauce koji under actual operation circumstances were determined as 0.28%, 33.50 ℃ and 32.50 h for inoculum amount, koji-making temperature and time, respectively. The resulting product exhibited a comprehensive quality score of 98.23.

Box-Behnken design; optimization; Pi’xian bean sauce; koji preparation

TS264.2

A

1002-6630（2014）15-0193-05

10.7506/spkx1002-6630-201415039

2013-09-05

四川省教育廳科研基金項(xiàng)目（10ZC063）

孟甜（1985—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：mengtian85@sohu.com