李嘉文，鄭冬冬，王宏勛，劉志國(guó)，余曉麗，周幗萍，李 睿,*

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.河南醫(yī)藥技師學(xué)院制藥工程系，河南 開(kāi)封 475000；3.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

腸出血性大腸桿菌O157：H7變種Q蛋白對(duì)志賀毒素表達(dá)的影響

李嘉文1,2，鄭冬冬1，王宏勛3，劉志國(guó)1，余曉麗1，周幗萍1，李 睿1,*

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.河南醫(yī)藥技師學(xué)院制藥工程系，河南 開(kāi)封 475000；3.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

1株腸出血性大腸桿菌O15 7：H7變種EC169菌株，攜帶stx基因但不表達(dá)志賀毒素。通過(guò)高效熱不對(duì)稱交錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（high-efficiency thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction，hiTAIL-PCR）hiTAILPCR擴(kuò)增得到EC169 stx1及其上游核苷酸片段并克隆測(cè)序，結(jié)果表明：EC169 q基因與標(biāo)準(zhǔn)株sakai q基因相比存在6個(gè)SNP位點(diǎn)。通過(guò)PCR擴(kuò)增O157：H7高毒株EC150 q基因全長(zhǎng)，并構(gòu)建表達(dá)載體pkk223-q分別轉(zhuǎn)化EC169和低毒株EC157。反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源q基因在EC169和EC157重組菌中可高效表達(dá)，并引起EC157stx轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，但EC169重組菌stx轉(zhuǎn)錄水平不變。反向乳膠凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)EC157重組菌志賀毒素表達(dá)量提高，而EC169重組菌志賀毒素表達(dá)量不變。Q蛋白變異可能并非EC169志賀毒素不表達(dá)的主要原因。

大腸桿菌O157：H7；Q蛋白；反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR；志賀毒素；hiTAIL-PCR

腸出血性大腸桿菌O157：H7是一類(lèi)十分重要的食源性致病菌，感染人體后會(huì)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心或嘔吐，部分患者還會(huì)有發(fā)熱癥狀出現(xiàn)。可引起胃腸道以及全身性的疾病，如出血性腸炎和溶血性尿毒綜合征，臨床表現(xiàn)為溶血性貧血、急性腎衰竭、凝血功能障礙、血小板減少等[1-2]。感染嚴(yán)重者可導(dǎo)致病人死亡，一些重癥患者還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[3-4]。1982年大腸桿菌O157：H7被認(rèn)定為嚴(yán)重致病菌，其感染率也于20世紀(jì)90年代后逐年升高[5]。患者感染大腸桿菌O157：H7后，在使用抗生素治療時(shí)，有誘導(dǎo)志賀毒素表達(dá)和加劇病人病情的危險(xiǎn)[6]。以上這些特點(diǎn)使腸出血性大腸桿菌O157：H7成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。

腸出血性大腸桿菌O157：H7的主要毒力因子是志賀毒素。志賀毒素（Shiga toxin，Stx）由噬菌體上的stx基因編碼[7-8]。stx基因位于Stx噬菌體的晚期操縱子中，有stx1和stx2兩種類(lèi)型，分別編碼Stx1和Stx2兩種毒素[9-10]。q基因是晚期轉(zhuǎn)錄的抗終止基因，它編碼的Q蛋白作用于晚期啟動(dòng)子PR’，激活stx基因轉(zhuǎn)錄，所以志賀毒素的表達(dá)與q基因密切相關(guān)[11]（圖1）。

圖1 1 stxstx基因的表達(dá)調(diào)控[12][12]Fig.1 Expression and regulation of stx gene[12]

Koitabashi等[13-14]從日本、泰國(guó)、中國(guó)山東省等地牛肉標(biāo)本分離到了數(shù)株菌，這些菌屬于O157：H7或O157：H-血清型，都攜帶stx2基因，但不產(chǎn)志賀毒素2，經(jīng)絲裂霉素C誘導(dǎo)，仍不能產(chǎn)生志賀毒素，研究發(fā)現(xiàn)這些菌q基因序列存在較大變異，可能由于Q蛋白活性弱導(dǎo)致Stx2表達(dá)量低。目前僅日本Miyamoto實(shí)驗(yàn)室發(fā)表了類(lèi)似的研究報(bào)告，但該類(lèi)腸出血性大腸桿菌變種的志賀毒素基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚[15]。本實(shí)驗(yàn)室有1株日本Miyamoto實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送的腸出血性大腸桿菌O157：H7臨床株EC169，攜帶stx1和stx2基因但不產(chǎn)志賀毒素[16]。攜帶stx1但不產(chǎn)Stx1的O157菌株是否也由于獨(dú)特的q基因造成Q蛋白活性弱，造成Stx1不能正常表達(dá)，目前尚無(wú)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)擬研究腸出血性大腸桿菌O157：H7變種Q蛋白對(duì)志賀毒素表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究大腸桿菌志賀毒素的表達(dá)調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸出血性大腸桿菌O157：H7臨床株：高毒株EC150與變種EC169由日本九州大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院Miyamoto實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。腸出血性大腸桿菌O157：H7質(zhì)控菌株：低毒株EC157由武漢市疾病預(yù)防與控制中心贈(zèng)送。質(zhì)粒pkk223由浙江工業(yè)大學(xué)朱廷恒老師贈(zèng)送。

大腸桿菌DH5α 北京鼎國(guó)昌 盛生物技術(shù)有限公司；pGEM-T Easy載體 美國(guó)Promega公司；DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒 美國(guó)Omega Bio-Tek公司；DNA Marker、Ex Taq PCR試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ等 日本TaKaRa公司；VTEC-RPLA檢測(cè)試劑盒 日本生研公司；GoldView核酸染料 北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷、引物合成 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5424R型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；CF15R型立式冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；Spectrum752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；Tgradient型PCR儀 德國(guó)Biometra公司；ABI7500型熒光定量PCR儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Dyy-8C型電泳儀、DyCP-31D型電泳槽 北京市六一儀器廠；GBox-HR-E-M型凝膠成像儀 英國(guó)Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 EC169 q-stx1區(qū)hiTAIL-PCR擴(kuò)增與克隆測(cè)序

高效熱不對(duì)稱交錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（high-efficiency thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction，hiTAIL-PCR）實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)簡(jiǎn)并引物（long arbitrary degenerate primer，LAD）采用LIU yaoguang等[17]設(shè)計(jì)的4條簡(jiǎn)并引物L(fēng)AD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1-4，并去掉了所添加的酶切位點(diǎn)。特異性引物（special primer，SP）為自己設(shè)計(jì)，SP1和SP2之間間隔306 bp，SP2和SP3之間間隔503 bp。LAD系列簡(jiǎn)并引物分別與SP1用于第l輪PCR擴(kuò)增，SP2和SP3分別與AC1用于第2和第3輪PCR擴(kuò)增。序列見(jiàn)表1[17]。

表1 hiTAIL-PCR引物名稱及序列Table 1 Primers used for hiTAIL-PCR

EC169基因組DNA采用細(xì)菌基因組試劑盒提取。hiTAIL-PCR預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μL，PCR反應(yīng)體系為：2 μL的10×Ex Taq buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTP、1.5 μL 10 μmol/L SP1、1 μL20 μmol/L的 LAD、2 μL模板DNA、0.2 μL Ex Taq DNA聚合酶，加無(wú)菌雙蒸水至總體積20 μL。取稀釋了100 倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL作為第1輪hiTAIL-PCR反應(yīng)的模板。第1輪hiTAILPCR反應(yīng)總體積為25 μL，反應(yīng)體系如下：2.5 μL的10×Ex Taq buffer、2.64 μL 2.5 mmol/L dNTP、2 μL 10 μmol/L SP2、2 μL 10 μmol/L的ACl、1 μL模板DNA、0.2 μL Ex Taq DNA聚合酶，加無(wú)菌雙蒸水至總體積25 μL。取稀釋了20 倍的第1輪hiTAIL-PCR產(chǎn)物做為第2輪hiTAIL-PCR反應(yīng)的模板。第2輪hiTAIL-PCR反應(yīng)總體積為50 μL，反應(yīng)體系如下：5 μL 10×Ex Taq buffer、4 μL 2.5 mmol/L dNTP、2 μL 10 μmol/L SP3、2 μL 10 μmol/L的AC1、1 μL模板DNA、0.3 μL Ex Taq DNA聚合酶，加無(wú)菌雙蒸水至總體積50 μL。3輪hiTAIL-PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表2[17]。將PCR擴(kuò)增得到的目的條帶切膠回收，并克隆到pGEM-T Easy測(cè)序載體，送往生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

表2 hiTAIL-PCR循環(huán)條件Table 2 Thermal conditions for hiTAIL-PCR

1.3.2 構(gòu)建表達(dá)載體pkk223-q及重組子的轉(zhuǎn)化

使用primer5設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增高毒株EC150 q基因全長(zhǎng)的引物，并在上游引物5’端加上EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，下游引物5’端加上HindⅢ的酶切位點(diǎn)。上游引物序列（5’→3’）：GAATTCATACAC TGGCGATAAA，下游引物序列（5’→3’）：AAGCTTATGCAGATTTTTAC GA，產(chǎn)物大小為509 bp。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，其中dddH2O 18.3 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL， 10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μL， Ex Taq酶0.2 μL，EC150 DNA 1.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94℃ 1 min，50 ℃ 30 s，72℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。滅菌三蒸水作為陰性對(duì)照。將PCR產(chǎn)物純化備用。

將pkk223載體用EcoRⅠ和HindⅢ酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離后進(jìn)行切膠回收，將回收的目的條帶與EC150 q基因PCR產(chǎn)物連接，得到重組載體pkk223-q，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞EC169和EC157，構(gòu)建重組菌，菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆[18]。

1.3.3 絲裂霉素C誘導(dǎo)細(xì)菌

將EC157、EC169及重組菌接種到LB液體培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基加入氨芐青霉素（ampicillin，Amp）至終質(zhì)量濃度為80 μg/mL，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。取菌液1 mL加入到4 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中， 37 ℃、150 r/min培養(yǎng)2 h。加入絲裂霉素C至終質(zhì)量濃度0.5 μg/mL，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)4 h。

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR分析基因轉(zhuǎn)錄

采用RNAiso Plus試劑盒提取EC157、EC169及重組菌的RNA。去除基因組DNA后，用PrimerScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用SyBR Premix ExTaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為：12.5 μL的SyBR Premix ExTaqTMⅡ(2 M)，上下游引物各1 μL，ROX Reference Dye（50×）0.5 μL，cDNA 1 μL，最后加RNase Free ddH2O至總體積為25 μL。以16S rRNA作為內(nèi)參基因。q基因擴(kuò)增上游引物為：CCGCAGTGCTGTGACGATGA，下游引物為：AATCCCCTCCGCTTTGTGAA。目的片段大小為189 bp。分別采用TaKaRa公司的EVS和EVT（RR105A）引物對(duì)擴(kuò)增stx1和stx2基因。q、stx1、stx23 個(gè)基因的熒光定量PCR的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件相同。擴(kuò)增反應(yīng)具體條件為：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)，在每一循環(huán)的退火階段收集熒光進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，記錄熒光信號(hào)的變化，得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。

1.3.5 反向乳膠凝集（reverse passive latex agglutination，RPLA）實(shí)驗(yàn)

將EC169、EC157及重組菌接種于含80 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)。取60 μL接種于3 mL新鮮CA-yE液體培養(yǎng)基中，36℃、130 r/min搖床培養(yǎng)2 h。向每管中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（終濃度為1 μmol/L）誘導(dǎo)毒素的表達(dá)，36 ℃、130 r/min搖床培養(yǎng)6 h。取3 mL菌液于離心管中900×g離心15 min，取上清即為RPLA檢樣。按VTEC-RPLA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大腸桿菌志賀毒素滴度。

1.3.6 噬菌體的誘導(dǎo)

將EC157、EC169菌株接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.8，將其轉(zhuǎn)入20 mL的LB液體培養(yǎng)基，并加入絲裂霉素C至終濃度為0.5 μg/mL，另設(shè)不加絲裂霉素C的組為對(duì)照。然后37 ℃、120 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)14 h，加入50 μL氯仿繼續(xù)震蕩培養(yǎng)15 min。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其OD600nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 EC169 q-stx1區(qū)序列的hiTAIL-PCR擴(kuò)增與克隆測(cè)序

以提取的EC169基因組DNA作為模板，將三輪擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，通過(guò)在膠上觀察第一輪和第二輪PCR產(chǎn)物條帶相差的大小，是否與設(shè)計(jì)的SP2和SP3相差的大小一致來(lái)判斷是否為目的條帶。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。用LAD1-3作為隨機(jī)引物擴(kuò)增時(shí)在2 000 bp和1 000 bp都出現(xiàn)了特異 性條帶，并且兩條條帶的第3輪產(chǎn)物與第2輪產(chǎn)物的條帶大小差值與預(yù)期的503 bp都吻合，由此可初步判斷這兩條條帶均為目的條帶。為了獲得更長(zhǎng)的stx1基因上游序列，將泳道 9中2 000 bp的條帶進(jìn)行切膠回收并克隆測(cè)序，得到了EC169 stx1基因上游序列。

圖2 EC169 q--stx1區(qū) hiTAIL-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 hiTAIL-PCR products of q-stx1region in EC169

將測(cè)序得 到的stx1基因及其上游q基因序列用DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接，并上傳至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，序列號(hào)為JQ327854.1。對(duì)EC169 stx1基因上游序列進(jìn)行分析，晚期基因啟動(dòng)子PR’、終止子tR’及stx1基因啟動(dòng)子Pstx1均未發(fā)現(xiàn)突變。EC169的q基因與日本Sakai菌株相比有6 個(gè)SNP位點(diǎn)，相似性達(dá)98.6%。

2.2 反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR分析基因轉(zhuǎn)錄水平

由圖3可知，經(jīng)過(guò)絲裂霉素C誘導(dǎo)后，EC157重組菌和EC157的3個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平都存在差異。EC157重組菌q基因轉(zhuǎn)錄水平明顯高于EC157，說(shuō)明外源的q基因?qū)隕C157重組菌后成功表達(dá)。EC157重組菌stx1和stx2基因轉(zhuǎn)錄水平均高于EC157，說(shuō)明抗終止子Q蛋白在EC157重組菌中的高效表達(dá)，能促使stx基因的表達(dá)顯著上調(diào)。

圖3 EC157和EC157重組菌基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 Relative mRNA transcription levels in EC157 and EC157 recombinant bacteria

圖4 EC169和EC169重組菌基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 Relative mRNA transcription levels in EC169 and EC169 recombinant bacteria

由圖4可知，經(jīng)過(guò)絲裂霉素C誘導(dǎo)后， EC169重組菌中q基因轉(zhuǎn)錄水平較高，而未導(dǎo)入外源q基因的EC169 q基因沒(méi)有mRNA的轉(zhuǎn)錄。EC169重組菌和EC169的stx1基因和stx2基因也沒(méi)有mRNA的轉(zhuǎn)錄。說(shuō)明外源q基因?qū)隕C169后能高效表達(dá)，但并未激活下游stx1基因和stx2基因的表達(dá)。

2.3 RPLA實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按VTEC-RPLA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大腸桿菌志賀毒素，在明亮處墊上黑紙觀察凝集現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EC169、EC169重組菌志賀毒素1型和2型凝集價(jià)均小于1：2，說(shuō)明志賀毒素產(chǎn)量很低無(wú)法檢出。EC157志賀毒素1型和2型凝集價(jià)分別為1：16和1：32，EC157重組菌志賀毒素滴度均有所上升，志賀毒素1型和2型凝集價(jià)達(dá)到了1：32和1：64。

2.4 噬菌體的誘導(dǎo)

未經(jīng)絲裂霉素C誘導(dǎo)的EC157、EC169菌液渾濁，誘導(dǎo)后的EC157菌液較澄清但仍有少量菌體。而EC169菌液仍然較渾濁。分別用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其OD600nm值，未經(jīng)誘導(dǎo)的EC157O的D600nm值為1.770，EC169 O的D600nm值為1.745。經(jīng)絲裂霉素C誘導(dǎo)后EC157的OD600nm值為0.180，EC169的OD600nm值為1.553。

3 結(jié) 論

腸出血性大腸桿菌O157：H7作為一種危害性極大的致病菌已引起人們的重視，研究也日益深入，但大部分集中在檢測(cè)和防控方面，志賀毒素調(diào)控機(jī)制的研究卻相對(duì)較少[19-20]。Koitabashi等[14]對(duì)一株攜帶stx2基因但不產(chǎn)Stx2毒素的O157菌株Thai-12研究發(fā)現(xiàn)，Thai-12 Stx噬菌體為缺陷型，不能正常復(fù)制，無(wú)法誘導(dǎo)出游離噬菌體。但將標(biāo)準(zhǔn)株EDL933的q基因?qū)刖闠hai-12后，stx2表達(dá)量大幅提高。推斷Q蛋白活性弱是導(dǎo)致Thai-12 stx2不能表達(dá)的主要原因之一[14]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)一株攜帶stx1基因但不產(chǎn)志賀毒素的腸出血性大腸桿菌O157：H7 EC169進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC169 q基因與sakai標(biāo)準(zhǔn)株q基因相比存在6個(gè)SNP位點(diǎn)，但stx1基因的啟動(dòng)子并未突變也沒(méi)有缺失。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，絲裂霉素C可誘導(dǎo)大腸桿菌釋放噬菌體，提高志賀毒素表達(dá)量[21]。將高毒株EC150 q 基因?qū)氲投局闑C157和無(wú)毒株EC169，誘導(dǎo)后通過(guò)反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR和RPLA實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。經(jīng)過(guò)絲裂霉素C誘導(dǎo)，EC157重組菌的q、stx1和stx2基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于EC157，說(shuō)明外源q基因在EC157重組菌中正常表達(dá)，并對(duì)下游stx基因轉(zhuǎn)錄的具有正調(diào)控作用。Mahesh等[22]也報(bào)道了高毒株中Stx噬菌體上的q基因與志賀毒素產(chǎn)量有相關(guān)性。

絲裂霉素C誘導(dǎo)后，EC169重組菌q基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于EC169，說(shuō)明外源q 基因在EC169重組菌中順利表達(dá)，但仍然檢測(cè)不到stx1基因和stx2基因的轉(zhuǎn)錄。RPLA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)EC157重組菌中志賀毒素的表達(dá)量提高，而EC169重組菌中志賀毒素仍不能表達(dá)。噬菌體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)EC157中噬菌體可被誘導(dǎo)，而EC169 噬菌體可能為缺陷型噬菌體。Koitabashi等[14]報(bào)道的Thai-12 Stx噬菌體為缺陷型，但導(dǎo)入外源q基因能大幅提高Thai-12菌株stx2基因表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)的菌株EC169則觀察不到此類(lèi)現(xiàn)象，推測(cè)Q蛋白變異可能不是EC169不表達(dá)志賀毒素的主要原因。

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Effect of Protein Q on Shiga Toxin Expression in Enterohemorrhage Escherichia coli O157 Variant

LI Jia-wen1,2, ZHENG Dong-dong1, WANG Hong-xun3, LIU Zhi-guo1, YU Xiao-li1, ZHOU Guo-ping1, LI Rui1,*
(1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Department of Pharmaceutical Engineering, Henan Medicine Technician College, Kaifeng 475000, China; 3. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

An enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157: H7 strain EC169 carrying both stx1and stx2genes but not producing Shiga toxins was used in this study to investigate the reason for these characteristics. The stx1gene and its upstream region from EC169 were amplified by hiTAIL-PCR. Sequencing data showed that EC169 q gene had 6 single nucleotide polymorphism (SNP) sites compared with the corresponding region of the typical strain sakai. A highly virulent O157:H7 strain EC150 and a hypovirulent O157: H7 strain EC157 were tested in this study. The full length of EC150 q gene was amplified and connected to the expression vector pkk223. The recombinant plasmid was then transformed into EC169 and EC157, respectively. The qRT-PCR results showed that the pkk223-q vector was efficiently expressed in the two recombinant strains, respectively. qRT-PCR and RPLA results demonstrated that the level of Shiga-toxin expression was improved in EC157 recombinant strain, but its expression was not changed in EC169 recombinant strain. These results suggest that the SNP variation of protein Q might not be responsible for the non-expression of Shiga-toxins in EC169, suggesting that other mechanisms may be involved in controlling the expression of Shiga-toxins in EC169. This study might contribute to study the control and regulation of Stx phage.

E. coli O157: H7; protein Q; qRT-PCR; Shiga-toxin; hiTAIL-PCR

R378.2

A

1002-6630（2014）15-0151-05

10.7506/spkx1002-6630-201415031

2013-10-21

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA101703-3）；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（教外司留20111139）；湖北省教育廳優(yōu)秀中青年人才計(jì)劃項(xiàng)目（Q20111710）；武漢市科技局國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（2013030409020113）

李嘉文（1988—），男，碩士研究生，主要從事食品安全和食品微生物研究。E-mail：821483258@qq.com

*通信作者：李睿（1972—），女，教授，博士，主要從事食品安全和食品微生物研究。E-mail：liruiwuhan@163.com