趙雄偉，林海建，張志明，沈亞歐，潘光堂

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，成都611130

隨著我國工業(yè)化和城市化步伐的加快，以及農(nóng)藥、化肥等不合理的施用，土壤重金屬污染也隨之加重，重金屬不僅限制農(nóng)作物的生長發(fā)育，更為重要的是可通過食物鏈傳遞危及到人類健康[1～3]。鉛是現(xiàn)存環(huán)境最大量的有毒重金屬污染元素，據(jù)統(tǒng)計，全世界每年鉛生產(chǎn)超過 500萬噸[4]，也是最難控制的污染物之一，其比重高達11.34 g/cm3[5,6]。玉米是我國主要的糧食、飼料作物，以及重要的工業(yè)和食品深加工原料，然而我國、特別是西南地區(qū)種植的玉米，已日益受到重金屬Pb2+的污染[7,8]。

Dai等[9]利用高濃度 Pb2+(195.55 mg/kg)處理后的土壤研究玉米品質(zhì)，結(jié)果表明，對供試的25個玉米品種種植在污染土壤與未被污染土壤情況下籽粒Pb2+含量的比較，其中有12個供試品種的籽粒Pb2+含量有明顯變化，且超過國家食用安全標(biāo)準(zhǔn)，而另外13個品種籽粒Pb2+含量則變化不大，且低于國家食用安全標(biāo)準(zhǔn)。金楓等[10]在高濃度 Pb2+(333.32 mg/kg)脅迫下對 12個玉米自交系及其雜交種籽粒Pb2+含量進行了測定分析，發(fā)現(xiàn)在籽粒 Pb2+含量未超標(biāo)的雜交種中，50%的雜交種是以自交系 178為親本之一組配的，說明自交系178在高濃度Pb2+污染下玉米籽粒 Pb2+低富集或低吸收育種的優(yōu)良供體親本。上述研究結(jié)果表明，玉米品種間對籽粒 Pb2+的吸收和富集存在著明顯的差異，培育籽粒 Pb2+低富集或低吸收的玉米品種也是完全可能的。

近年來，玉米耐重金屬相關(guān)QTL研究取得了一定進展。Roberta等[11]對玉米葉片中6種金屬(Cu、Fe、Mn、Mg和 Sr)含量進行了 QTL定位分析，共檢測到8個QTLs，分布在第1、2、3、5、8號染色體上，表型貢獻率范圍為 6.30%～11.00%。Dong等[12]對玉米苞葉、葉片、莖稈和籽粒的As含量進行了QTL定位分析，共定位到9個相關(guān)的QTLs，其中與籽粒相關(guān)的3個 QTLs分布在第3、5、7號染色體上，表型貢獻率范圍為 8.52%～10.73%；進一步研究發(fā)現(xiàn)，籽粒As含量跟苞葉、葉片和莖稈As含量間不存在重合QTL。因此認為作物籽粒中控制重金屬含量的基因可能相對獨立[13,14]。該研究結(jié)果為選育籽粒重金屬低積累品種提供了新的思路。

迄今為止，國內(nèi)外對玉米籽粒Pb2+含量的QTL定位研究還尚未見相關(guān)報道。本研究以本課題組[10]前期試驗結(jié)果獲得的玉米籽粒 Pb2+低富集的自交系178與籽粒 Pb2+高富集的自交系 9782為試驗材料，構(gòu)建RIL群體，采用SSR標(biāo)記構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，對控制玉米籽粒Pb2+含量的QTL進行定位分析，旨在進一步探明玉米耐 Pb2+或籽粒 Pb2+低富集性狀的遺傳變異規(guī)律，為今后開展玉米耐Pb2+育種、特別是籽粒Pb2+低富集品種的分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗種質(zhì)材料與土壤環(huán)境

本課題組通過前期研究，已篩選出的籽粒 Pb2+低富集的自交系 178與籽粒 Pb2+高富集的自交系9782為親本，配置178×9782雜交組合，從得到的F2群體中隨機抽取單株，經(jīng)連續(xù)多代自交，構(gòu)建了一個由 176個株系組成的RIL群體。以該群體及兩親本為本研究的試驗材料。

在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安多營農(nóng)場內(nèi)進行田間試驗；土壤經(jīng)風(fēng)干、壓碎過篩(5 mm)后測定，土壤Pb2+含量為 24.92 mg/kg，pH為 6.33，全氮、全磷、全鉀的含量分別為1.70 g/kg、0.57 g/kg、13.64 g/kg；該土壤質(zhì)量指標(biāo)在國家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB15618-1995)一級限值以內(nèi)，滿足控制性試驗的要求。

1.2 方法

1.2.1 Pb2+脅迫處理

首先將供試土壤裝入塑料盆中，每盆裝土壤 15 kg，然后將試驗材料的種子直播于此塑料盆中，每份材料種植4盆，共712((176+2)×4)盆。待出苗長至3葉期時，每盆留取長勢一致的幼苗 3株，呈三角形排列，此時向塑料盆中的土壤加入Pb(NO3)2溶液，濃度設(shè)定為 333.32 mg/kg。常規(guī)管理，人工控水，防止?jié)菜^量使土壤中的 Pb2+外滲。玉米生長期間定期測定土壤中Pb2+濃度，通過外加Pb(NO3)2溶液的方式確保Pb2+濃度的相對穩(wěn)定。

1.2.2 性狀考察和籽粒Pb2+含量測定

根據(jù)親本和RIL群體不同家系的成熟期及時收獲、曬干。室內(nèi)考察各株系的穗長、穗粗、行粒數(shù)、穗重和百粒重。不同株系收獲后手工脫粒，在65℃烘箱中烘干至恒重，最后每份家系中均勻取一部分樣品在小型萬能粉碎機(型號：Z-750)上粉碎，完全過篩(20 mm)，裝入塑料樣品袋，作為Pb2+含量的測定樣品[15]。稱取樣品2.5 g(精確到 0.001 g)后放于三角瓶中，瓶內(nèi)放3～4粒玻璃珠，加10 mL 混合酸(高氯酸和硝酸的體積比是1:4)及濃硫酸2.5 mL。置于有石棉網(wǎng)的電爐上進行消化，若液體變棕黑色，再加混合酸，直至冒白煙、消化液呈無色透明或略帶黃色時為止，用蒸餾水少量多次的洗滌三角瓶，洗液無損地轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容至刻度、搖勻。用石墨爐(型號: GZ10-AA7003)原子吸收分光光度法測定Pb2+含量，重復(fù)測定2次。

1.2.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL分析

利用CTAB法[16]提取2個親本自交系和176個RIL群體家系的基因組 DNA。從玉米數(shù)據(jù)庫(www.maizegdb.org)中選取覆蓋全基因組的1189對SSR標(biāo)記，參照Senior等[17]方法進行多態(tài)性篩選，PCR擴增產(chǎn)物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法檢測。記錄數(shù)據(jù)時，帶型與母本178相同的記作1，與父本9782相同的記作2，缺失或模糊記作0，得到的SSR多態(tài)性標(biāo)記用于群體的基因型分析。所有 RIL單株帶型按孟德爾分離比例(1 : 1)進行卡方檢驗，推斷標(biāo)記是否存在偏分離。采用 MAPMAKER/EXP3.0b軟件(LOD＞3.0，重組率小于 0.5)，Kosambi函數(shù)計算分子標(biāo)記遺傳距離(cM)，用Mapchart2.2[18]繪制連鎖圖譜。

1.2.4 統(tǒng)計分析與QTL定位分析

用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。在QTL定位時，利用Windows QTL Cartographer 2.5[19]軟件，復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite interval mapping, CIM)，檢測運算模型標(biāo)準(zhǔn)模型6，背景標(biāo)記設(shè)為5，窗口是10 cM。以LOD閾值2.5為指標(biāo)來判斷QTL是否存在，若標(biāo)記區(qū)間中LOD＞2.5，則認為該區(qū)間LOD最高處對應(yīng)的位點為1個QTL，并估計各個QTL對表型變異的貢獻率和加性效應(yīng)。QTL命名采用McCouch等[20]原則。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米籽粒Pb2+含量表型分析

在高濃度Pb2+(333.32 mg/kg)土壤脅迫下，父本9782籽粒Pb2+含量為0.39 mg/kg，超過國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)；母本178籽粒Pb2+含量為0.22 mg/kg，接近國家食品安全指標(biāo)[21]。兩親本籽粒 Pb2+含量之差0.17 mg/kg，自交系9782籽粒Pb2+含量極顯著高于自交系 178(|t| = 9.71＞t0.01(2)=9.21)。

在RIL群體不同家系中，籽粒Pb2+含量平均值為0.46 mg/kg，變幅范圍為0.11 mg/kg～1.03 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)差 0.025 mg/kg，變異系數(shù)為64.70%。其中有9個家系的籽粒未超過國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)，占總家系的5.08%。該RIL群體方差分析表明(表1)，不同家系的籽粒 Pb2+含量存在極顯著差異，說明該性狀在不同基因型間存在顯著差異，受基因型影響較大。從偏度(0.65)和峰度(0.31)來看，群體內(nèi)各家系的籽粒 Pb2+含量符合正態(tài)分布，出現(xiàn)了超親變異。綜合推測該群體籽粒中 Pb2+含量是由多個基因控制的數(shù)量性狀。

2.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

從1189對SSR引物中篩選擴增效果好、多態(tài)性明顯的引物共165對，多態(tài)性比例為13.92%。根據(jù)SSR引物擴增信息，利用Mapmaker/EXP3.0b作圖軟件構(gòu)建連鎖圖譜，165對SSR標(biāo)記不均等的分布在玉米10條染色體上，圖譜總長度為1499.85 cM，平均間距為9.07 cM，其中有142對引物間的遺傳距離小于20 cM，占總引物的86.06%(圖1)。另外，4對標(biāo)記間的遺傳距離大于30 cM，分別在2、4、5號染色體上，這可能與染色體不同位置發(fā)生交換的幾率不等或者雙親在這些染色體片段上的多態(tài)性較低有關(guān)。進一步對 SSR標(biāo)記進行卡平方(χ2)檢驗，結(jié)果表明(表2)，作圖所用的165個SSR標(biāo)記中有131個標(biāo)記符合 1 : 1的單基因理論分離比，占總標(biāo)記數(shù)的79.39%；34個標(biāo)記顯著偏離1 : 1分離比，其中極顯著偏分離標(biāo)記 (P＜0.01)有18個。偏向母本178的標(biāo)記有13個，偏向父本9782的標(biāo)記有21個，分別占偏分離總標(biāo)記數(shù)的38.24%和61.76%。第6號染色體上偏分離標(biāo)記所占的比例最高，占到該染色體上標(biāo)記數(shù)的33.33%，第7號染色體上無偏分離標(biāo)記。

表1 玉米178×9782 RIL群體Pb2+含量性狀表型分析

2.3 籽粒Pb2+含量的QTL定位

以成熟期玉米籽粒 Pb2+含量兩重復(fù)的平均值為表型指標(biāo)，共檢測到2個與籽粒中Pb2+含量相關(guān)的QTLs—qPC1和qPC4(表3)。qPC1位于第1號染色體標(biāo)記 umc1661～phi002之間，鄰近區(qū)間為 144.73 cM～168.19 cM，表型貢獻率為11.13%，加性效應(yīng)為正，其增效等位基因來自母本178；qPC4位于第4號染色體標(biāo)記 umc1117～nc005之間，鄰近區(qū)間為16.05 cM～24.28 cM，表型貢獻率為5.55%，加性效應(yīng)為負，其增效等位基因來自父本9782。

2.4 籽粒Pb2+含量與產(chǎn)量性狀的相關(guān)性分析

對178份試驗材料的籽粒Pb2+含量與其產(chǎn)量性狀進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)玉米不同基因型籽粒中Pb2+含量與穗長、穗粗、行粒數(shù)、百粒重等性狀相關(guān)系數(shù)r的絕對值介于0.059～0.13之間，小于r0.05(177)，均未達到顯著水平，表明籽粒中 Pb2+含量與穗長、穗粗、行粒數(shù)、穗重和百粒重等產(chǎn)量性狀無關(guān)，極有可能是受不同的基因控制。

圖1 玉米178×9782RIL群體遺傳連鎖圖譜

表2 染色體分布和偏分離情況

表3 玉米籽粒重金屬Pb2+含量的QTL及效應(yīng)

3 討 論

籽粒中重金屬Pb2+含量的高低直接關(guān)系到玉米品質(zhì)優(yōu)劣和食品安全，就重金屬對食品的污染而言,國家出臺的糧食重金屬限制標(biāo)準(zhǔn)(GB2762-2005)，玉米籽粒中的重金屬含量不得高于國家糧食安全標(biāo)準(zhǔn)。前人研究已經(jīng)表明，玉米吸收土壤中的重金屬后大部分富集于根部器官，只有一小部分通過體內(nèi)的共質(zhì)體、質(zhì)外體和導(dǎo)管途徑運輸?shù)降厣喜糠?，體內(nèi)的重金屬會通過直接或間接的方式影響著玉米的生理生化；但由于不同基因型間的遺傳背景與生理特性不同，從而對不同玉米品種生長發(fā)育產(chǎn)生傷害的程度不同[22～24]。影響玉米籽粒重金屬的積累因素很多，除了土壤中重金屬含量本身外, 也與同化產(chǎn)物積累量的多少密切相關(guān)[25]。本研究模擬了高濃度重金屬Pb2+(333.32 mg/kg)污染條件，測定不同基因型玉米籽粒Pb2+含量。分析發(fā)現(xiàn)RIL群體間籽粒Pb2+含量差異極顯著，表明完全有可能通過篩選獲得籽粒 Pb2+低富集的育種種質(zhì)材料，用于培育籽粒 Pb2+低富集的新品種。對籽粒中 Pb2+含量與產(chǎn)量性狀相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)不同基因型玉米籽粒中Pb2+含量與其穗長、穗粗、行粒數(shù)、穗重和百粒重等產(chǎn)量性狀無關(guān)，這一結(jié)果跟 Amin等[26]研究結(jié)果一致；同時，還有多個研究者對一些玉米不同器官金屬含量進行了QTL定位的研究[12,27]，結(jié)果表明籽粒與其他器官之間不存在重合QTL，也從不同層面上說明控制籽粒重金屬含量的基因可能是相對獨立的，這些結(jié)果綜合說明玉米籽粒Pb2+含量極可能是一個相對獨立性狀。綜合結(jié)果表明通過遺傳育種方法培育籽粒 Pb2+低富集且高產(chǎn)的新品種也是可能的。

目前，關(guān)于玉米籽粒重金屬Pb2+含量的QTL定位還未見有報道。本研究用玉米籽粒 Pb2+含量兩個重復(fù)的平均值為指標(biāo)，LOD閾值為2.5，共檢測到2個相關(guān)的QTLs(qPC1和qPC4)，分別位于第1和4號染色體，表型貢獻率分別為11.13%和5.55%。盡管這一結(jié)果跟Dong等[12]研究發(fā)現(xiàn)控制籽粒重金屬砷(As)含量的QTLs存在差異，但通過網(wǎng)站(http://www.maizegdb.org)與本研究檢測到的QTLs進行物理位置比較后發(fā)現(xiàn)，本研究檢測到的qPC1與位于第 1號染色體上控制莖稈砷(As)含量的主效QTL(表型貢獻率為 14.86%)座位相鄰；而且也與周金鳳等[27]研究發(fā)現(xiàn)位于第1號染色體控制籽粒Mn2+含量相關(guān)的主效QTL的座位相近。我們據(jù)此有理由推斷，本研究所獲得的位于第一條染色體上的QTL可能存在控制玉米籽粒低 Pb2+積累的基因。因此，位于第一染色體上的qPC1座位，可以用作開展玉米籽粒 Pb2+低富集新品種選育的分子輔助標(biāo)記。

從本研究QTL定位結(jié)果來看，它們對表型變異的貢獻率不太高，且數(shù)量少，要揭示玉米籽粒中控制 Pb2+含量遺傳的分子機理還有許多基礎(chǔ)工作要做。為此，構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜，進行多種方式的脅迫試驗以及QTL定位研究是十分必要的，如在重金屬 Pb2+污染的大田或水培條件下試驗，采用大量不同遺傳背景玉米材料或高密度的SNP分子標(biāo)記來發(fā)掘穩(wěn)定表達的主效低Pb2+富集QTL，對玉米遺傳圖譜與基因組的物理圖譜進行對比，篩選、克隆、鑒定玉米耐 Pb2+或籽粒低 Pb2+積累的候選基因，以此為分子標(biāo)記輔助技術(shù)選育低 Pb2+積累品種提供更科學(xué)的理論依據(jù)。

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