景 明，陳正君，王雅莉，張艷霞，劉雪楓

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000）

·實(shí)驗(yàn)研究·

結(jié)腸癌微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、增殖及CD13、CD133表達(dá)的影響

景 明1，2，陳正君1，王雅莉1，張艷霞1，2，劉雪楓1

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000）

目的觀察結(jié)腸癌微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）形態(tài)、增殖及CD13、CD133表達(dá)的影響。方法對(duì)照組為BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組采用Transwell小室建立BMSCs與結(jié)腸癌SW480細(xì)胞非接觸、共培養(yǎng)的微環(huán)境。顯微鏡觀察BMSCs的形態(tài)變化，四氮唑蘭比色法（MTT）檢測(cè)BMSCs增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其周期及表面抗原的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組BMSCs的形態(tài)具備了惡性腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，增殖速度增高，其S期細(xì)胞含量（41.1%）較對(duì)照組（9.67%）明顯增加；實(shí)驗(yàn)組BMSCs的CD13的表達(dá)為89.7%±9.5%，明顯高于對(duì)照組的67.1% ±8.1%（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組BMSCs的CD133的表達(dá)為90.5%±6.4%，明顯高于對(duì)照組的4.3%±1.2%（P＜0.01）。結(jié)論應(yīng)用Transwell小室可實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞和BMSCs非接觸共培養(yǎng)，并能誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，其機(jī)制與引起細(xì)胞形態(tài)、增殖能力及細(xì)胞表面標(biāo)記物等生物學(xué)特性的改變有關(guān)。

結(jié)腸癌微環(huán)境；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞周期；CD13和CD133

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一群來(lái)源于骨髓組織中的多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能，易于體外分離并培養(yǎng)，具有極好的遷移能力及腫瘤趨向性和低免疫原性，是理想的組織工程種子細(xì)胞［1，2］。然而，隨著近年來(lái)對(duì)BMSCs生理特性和腫瘤研究的不斷深入，卻發(fā)現(xiàn)BMSCs經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)，尤其在腫瘤微環(huán)境中可能發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3，4］。為此，本實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室建立BMSCs與結(jié)腸癌細(xì)胞SW480非接觸共培養(yǎng)的模擬腫瘤微環(huán)境，對(duì)微環(huán)境中BMSCs形態(tài)、增殖及細(xì)胞表型等相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步了解BMSCs在重塑的腫瘤微環(huán)境中生物學(xué)行為的變化提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠，體重（180±20）g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（甘）2001－0001－0001332，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證號(hào)：SYXK（甘）2001－0001－0000390。

1.2 細(xì)胞株 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株購(gòu)自江蘇江陰齊氏生物科技有限公司。

1.3 主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶（trypsin，Hyclone公司）；二甲亞砜（DMSO，美國(guó)Amresco公司）；碘化丙啶（PI，美國(guó)Sigma公司），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司）。

1.4 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋電機(jī)公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickin－son公司），熒光顯微鏡及攝像系統(tǒng)（日本Nekon90I公司），Transwell插入式培養(yǎng)皿（美國(guó)Millicell公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)板（南京建成生物工程研究所），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

2 方法

2.1 BMSCs的分離培養(yǎng) Wistar大鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死后，無(wú)菌條件下剝離肌肉，分離股骨及脛骨，剪去兩端軟骨暴露出骨髓腔，隨后用注射器吸取DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔2～3次，收集沖洗液至離心管。1 000 rpm離心10 min，棄上清，制成細(xì)胞懸液，接種于50 mL培養(yǎng)瓶，置于37℃、飽和濕度、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。48 h后換液，去除未黏附的細(xì)胞，以后每3天更換培養(yǎng)液一次。

待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，按照1∶2比例傳代，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 U·mL－1的DMEM培養(yǎng)液，2～3日更換培養(yǎng)液一次，根據(jù)生長(zhǎng)情況傳至3～4代，用臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活力在95%以上時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組

2.2.1 對(duì)照組 第4代的BMSCs置于37℃、5% CO2孵箱中用含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 U·mL－1的DMEM培養(yǎng)液?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)組 BMSCs與SW480非接觸共培養(yǎng)。采用有PET膜的Transwell懸掛式培養(yǎng)小室結(jié)合6孔板進(jìn)行培養(yǎng)，將第4代BMSCs細(xì)胞接種于放有小室的6孔板內(nèi)，小室內(nèi)種植SW480細(xì)胞，調(diào)整兩種細(xì)胞的比例為1∶1，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 U·mL－1的DMEM培養(yǎng)液，每24 h更換培養(yǎng)液一次。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2孵箱。以上兩組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs細(xì)胞，用含0.25%胰蛋白酶消化，制成l×106個(gè)·mL－1左右單細(xì)胞懸液檢測(cè)指標(biāo)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×104個(gè)·mL－1，接種于96孔板，每孔200μL，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液。在一周內(nèi)每天每組取1孔進(jìn)行計(jì)數(shù)，另外每組各取3孔分別加入20μLMTT（5 mg·mL－1），繼續(xù)孵育4 h后小心棄去液體，每孔內(nèi)加入150μL DMSO，搖床上低速震蕩10 min。在490 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度（A）值，再根據(jù)吸光度和細(xì)胞計(jì)數(shù)的關(guān)系，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，并計(jì)算結(jié)腸癌微環(huán)境對(duì)BMSCs生長(zhǎng)的增殖率，增殖率（%）＝（實(shí)驗(yàn)－對(duì)照）／對(duì)照×100%。

2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原 取潔凈的塑料試管，分別加入熒光標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體CD13和CD133各20μL，每管加入細(xì)胞懸液100μL，混合均勻，室溫下孵育30 min。每管加入1.5 mL PBS，充分混勻，1 800 rpm離心5 min后棄上清，每管加200μL PBS?；靹蚝螅魇郊?xì)胞儀檢測(cè)，用Apple隨機(jī)軟件進(jìn)行分析，每個(gè)樣本分析10 000個(gè)細(xì)胞。

2.3.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)裝2 mL DMEM培養(yǎng)液的離心管中，以5 000 rpm轉(zhuǎn)速離心3 min。棄棄去上清液，用2 mL PBS洗滌細(xì)胞沉淀，以0.8 mL預(yù)冷PBS制備單細(xì)胞懸液（2×106個(gè)·mL－1），邊振蕩邊逐滴加入2.4 mL預(yù)冷至4℃的無(wú)水乙醇進(jìn)行細(xì)胞固定。4℃冰箱固定24 h，再用冷PBS液洗滌細(xì)胞兩次去除固定液，加300～500 μL碘化丙啶染液，在室溫下避光放置20 min以上。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果。計(jì)量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，組間比較用配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BMSCs形態(tài)鑒定 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)48 h后細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)為：可見(jiàn)散在貼壁細(xì)胞，細(xì)胞排列紊亂，呈長(zhǎng)梭形或多角形，細(xì)胞之間通過(guò)突起相連接，細(xì)胞的兩極朝向不規(guī)律；7～10 d后，呈梭形或長(zhǎng)多邊形，貼壁細(xì)胞體積增大，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，形態(tài)不完全均一，但細(xì)胞排列整齊，邊界清晰，在培養(yǎng)瓶中分布及生長(zhǎng)均勻。原代培養(yǎng)10～14 d細(xì)胞可達(dá)80%～90%融合，經(jīng)過(guò)3代后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)大體相似（見(jiàn)圖1、2）。

圖1 第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（×100）

圖2 第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（×200）

3.2 共培養(yǎng)后BMSCs的細(xì)胞形態(tài) 共培養(yǎng)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中有部分細(xì)胞出現(xiàn)圓形的形態(tài)改變（見(jiàn)圖3）。用限制稀釋法繼續(xù)培養(yǎng)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)不一，細(xì)胞較大，胞核增大，核大小、形狀和染色不一，并可見(jiàn)巨核、雙核、異型核、多核等，具備了惡性腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)（見(jiàn)圖4）。

圖3 共培養(yǎng)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)（Bar，100μm）

圖4 繼續(xù)共培養(yǎng)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bar，200μm）

3.3 BMSCs表面抗原檢測(cè) 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)記物，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組BMSCs的CD13和CD133的陽(yáng)性表達(dá)均高于對(duì)照組（見(jiàn)表1）。

表1 結(jié)腸癌微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD13和CD133表達(dá)的影響（±s）

表1 結(jié)腸癌微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD13和CD133表達(dá)的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01

表面抗原 CD13 CD133對(duì)照組（%）67.12±8.10 4.33±1.24實(shí)驗(yàn)組（%） 89.73±9.51* 90.50±6.42*

3.4 BMSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)和細(xì)胞周期 MTT結(jié)果顯示，BMSCs和結(jié)腸癌SW480細(xì)胞共培養(yǎng)后，其增殖速度明顯高于對(duì)照組（見(jiàn)表2、圖5）。

表2 結(jié)腸癌微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖率的影響（%，±s）

表2 結(jié)腸癌微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖率的影響（%，±s）

注：與對(duì)照組同時(shí)間增長(zhǎng)率比較，*P＜0.01

時(shí)間（d）1 2 3 4 5 6 7對(duì)照組（%） 8.57±2.26 48.57±3.88 71.43±4.10 85.71±6.66 91.43±7.71 111.43±8.22 117.14±8.01實(shí)驗(yàn)組（%） 17.14±2.10* 62.86±3.35*100.00±5.66*122.86±5.20*148.57±4.85*157.14±7.84*182.86±7.92*

3.5 BMSCs細(xì)胞周期 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組BMSCs各周期比例分別為G0／G1：78.65%±1.12%，G2／M：11.68%±0.34%，S：9.67% ±0.20%；與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)后，BMSCs各周期比例分別為G0／G1：48.82%±0.47%，G2／M：10.08%± 0.13%，S：41.1%±0.26%。實(shí)驗(yàn)組BMSCs處于靜止期（G0／G1）的細(xì)胞比例低于對(duì)照組（P＜0.01），而處于增殖期（G2／M、S）的細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）（見(jiàn)圖6、7）。

4 討論

隨著對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymalstem cells，MSCs）研究的不斷深入，越來(lái)越多的干細(xì)胞成瘤的現(xiàn)象被報(bào)道［5，6］。Rubio等［7］報(bào)道將體外培養(yǎng)8個(gè)月內(nèi)、分裂90～140次的間充質(zhì)干細(xì)胞移植入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)引起腫瘤產(chǎn)生。他們也發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增6～8周的人MSCs是安全的，但經(jīng)過(guò)4～5月長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，間充質(zhì)干細(xì)胞可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。Miura等［8］將鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)一年以上連續(xù)傳代后，獲得無(wú)限群體倍增數(shù)，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，形成纖維肉瘤，進(jìn)一步通過(guò)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)后形成腫瘤；但同樣的條件下培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞卻沒(méi)有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。因此，MSCs的惡性轉(zhuǎn)化，目前尚存在爭(zhēng)議。

圖5 結(jié)腸癌微環(huán)境對(duì)BMSCs增殖率的影響（±s）

圖6 單獨(dú)培養(yǎng)后對(duì)照組各細(xì)胞周期（±s）

圖7 共培養(yǎng)后實(shí)驗(yàn)組各細(xì)胞周期（±s）

腫瘤微環(huán)境能調(diào)控腫瘤細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化等多種生物學(xué)行為［9］，但對(duì)其相互作用規(guī)律及其機(jī)理，目前還缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。本實(shí)驗(yàn)利用Transwell小室建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)體系，以此系統(tǒng)模擬結(jié)腸癌微環(huán)境，來(lái)探討結(jié)腸癌微環(huán)境對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的影響。CD13又稱(chēng)為氨肽酶N，表達(dá)于腫瘤干細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［10］；CD133是分子量為120 kD的糖蛋白，近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，CD133可能是腫瘤干細(xì)胞表面的特異性分子，并且極有可能成為治療腫瘤的一個(gè)有效的靶點(diǎn)［11］。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和BMSCs共培養(yǎng)后，BMSCs細(xì)胞形態(tài)不一，體積增大，胞核也增大，并可見(jiàn)巨核、雙核、多核、異型核等細(xì)胞，具備了惡性腫瘤細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。進(jìn)一步研究表明，實(shí)驗(yàn)組BMSCs的CD13和CD133的陽(yáng)性表達(dá)均高于對(duì)照組，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組BMSCs的增殖能力也明顯強(qiáng)于對(duì)照組，S期（增殖期）細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組。提示腫瘤微環(huán)境可誘導(dǎo)BMSCs分化，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與引起增殖能力、細(xì)胞表面標(biāo)記物及細(xì)胞形態(tài)等生物學(xué)特性的改變有關(guān)。

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Influence of colon carcinoma m icroenvironment on cellmorphology，proliferation and expressions of CD13and CD133of bonemarrow mesenchymal stem cells

JINGMing1，2，CHEN Zheng-jun1，WANG Ya-li1，ZHANG Yan-xia1，2，LIU Xue-feng1
（1.Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2.China Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacology and Toxicology of Gansu Province，Lanzhou 730000，China）

ObjectiveTo investigate the effect of Colon carcinomamicroenvironment on cellmorphology，proliferation and expressions of CD13and CD133of bonemarrow mesenchymal stem cells.MethodsControl group was bonemarrow derived stroma cells cultured in DMEM medium，experimentalgroup was（BMSCs）SW480 cells and bonemarrow derived stroma cell（BMSCs）co－cultured in transwell chamber.The cellmorphology of BMSCs was observed by microscope，and the generation of BMSCswere detected by MTTmethod.Cell cycle and expressions of CD13and CD133were analyzed by flow cytometry（FCM）.ResultsCompared with control group，BMSCs in experimental group had the feature ofmalignant tumor cells，the generation speed significantly quicker and the percentage of Sphasewas significantlymore than control group，The expressions of CD13in experimental group（89.7%±9.5%）were significantly higher than control group（67.1%±8.1%）（P＜0.01），and the expressions of CD133in experimental group（90.5%±6.4%）were significantly higher than control group（4.3%±1.2%）（P＜0.01）.ConclusionThese findings suggested that transwell chamber can help to achieve cocultivation of SW480 cells and BMSCs and inducemalignant transformation of BMSCs cell，themechanism could be related to the changes of bionomics such as cellmorphology，reproductive activity and cell surfacemarker.

Colon carcinomamicroenvironment；BMSCs；Cell cycle；CD13and CD133

R730.23

A

2095－5375（2014）09－0497－005

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81360522）

景明，男，教授，研究方向：中藏藥新制劑研究，E－mail：jm＠gszy.edu.cn

陳正君，男，研究方向：中藏藥新制劑研究，Tel：0931－8765458，E－mail：547649265＠qq.com