朱愛萍，吳小華，于曉惠，張 敏，常秀峰，徐清華，焦保權(quán)，張 潔

肝臟是動(dòng)物體內(nèi)最大的器官，具有十分復(fù)雜的功能，包括代謝、合成和儲(chǔ)存功能及調(diào)節(jié)和維持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定等。肝臟再生能力極其強(qiáng)大，肝細(xì)胞受損24 h后開始增殖，這期間是由G0期細(xì)胞向G1/S轉(zhuǎn)變，肝部分切除48 h后小血管開始形成，薄壁組織、肝小葉逐漸形成，肝臟逐漸長(zhǎng)大并恢復(fù)功能［1］。肝部分切除模型［2］的建立推動(dòng)了肝臟再生機(jī)制的研究工作。大量研究結(jié)果顯示，肝臟的再生過(guò)程受到多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的調(diào)控，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-A)［3］、白介素(IL)-6［4］、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)［5］、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)［6］、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)［7］、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)［8］及肝刺激物質(zhì)(HSS)［9］等，這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子在動(dòng)物體內(nèi)形成了一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，保證機(jī)體組織和器官的正常重建并維持其正常生長(zhǎng)。鯊魚的肝臟約占內(nèi)臟重量的75%，許多研究者已從鯊魚體內(nèi)分離克隆了多種與肝再生和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的刺激因子［10-16］。本研究通過(guò)條紋斑竹鯊肝臟2/3部分切除模型建立獲得正常和24 h再生肝組織，利用差別顯示逆轉(zhuǎn)錄 －聚合酶鏈反應(yīng)(differential display reverse transcription polymerase chain reaction，DDRT-PCR)技術(shù)進(jìn)行肝再生過(guò)程中差異表達(dá)基因的篩選，為進(jìn)一步研究肝再生過(guò)程中差異表達(dá)的相關(guān)功能基因奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)肝病藥物作用新靶點(diǎn)及肝再生機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 條紋斑竹鯊魚(280 g)，編號(hào)4，為中科院南海海洋所海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng);無(wú)菌注射器、吸收性明膠海綿、非吸收性外科縫線、醫(yī)用縫合針、手術(shù)剪、手術(shù)刀均購(gòu)自杭州華東醫(yī)藥器材公司。

1.2 試劑 麻醉劑:2%水合氯醛溶液，按每公斤鯊魚體重注射15 ml即300 mg水合氯醛配制。大腸桿菌E．coli TG1菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存;Taq DNA聚合酶及相應(yīng)PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自上海萊楓生物公司;AxyPreTMDNA Gel Extraction Kit購(gòu)自 AXYGEN公司;pMD?18-T Simple Vector購(gòu)自 Takara公司;Trizol、Reverse Transcription Reaction(First-Strand cDNA Synthesis)試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.3 肝臟2/3部分切除模型建立 將4 ml麻醉劑注射鯊魚腹部皮下，2 ～3 min 補(bǔ)加 1 ml［17］，待鯊魚失去運(yùn)動(dòng)能力后開始手術(shù)。沿腹部中線剪開鯊魚皮膚，切開肌層，切除肝臟右葉2/3部分為正常肝組織，將其迅速放入液氮中冷凍后移至－70℃冰箱保存?zhèn)溆?。在?chuàng)傷處滴加鏈霉素(0．1 g)和青霉素(10萬(wàn)單位)，縫合肌層和皮膚傷口，將鯊魚繼續(xù)飼養(yǎng)24 h后拆除傷口縫線取剩余肝組織的切除邊緣部分為再生肝組織［12］。

1.4 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 采用Trizol法分別提取正常及再生24 h肝組織的total RNA，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度。采用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(First-Strand cDNA Synthesis Reverse Transcription Reaction)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件:1250 ng total RNA，RT primer/olig(dT)15 2．5 μl/1．25 μl，70℃ 10 min，迅速冰浴2～5 min;后依次加入MgCl2(25 mmol/L)5．0 μl，dNTP Mix(10 mmol/L)2．5 μl，10 × RT buffer 2．5 μl，RNase inhibitor 0．625 μl，AMV Reverse Transcriptase 0．625 μl，總反應(yīng)體系為 25 μl，42℃50 min，95℃ 5 min，立即置于冰上冷卻，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 差異顯示PCR 采用萊楓公司2×Taq PCR Master Mix試劑，將2條錨定引物和20條隨機(jī)引物配對(duì)形成40種組合對(duì)正常和再生24 h肝組織cDNA進(jìn)行PCR，2種組織共80個(gè)PCR反應(yīng)，引物序列見表1。每個(gè)反應(yīng)體系如下:2×Taq PCR Master Mix 5 μl，錨定引物(50 μmol/L)0．1 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0．5 μl，cDNA 溶液 0．5 μl，ddH2O 3．9 μl，總體積 10 μl。反應(yīng)程序:95℃5 min;95℃ 30 s，40℃ 2 min，72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。參照《分子克隆》方法配制5%非變性聚丙烯酰胺凝膠，取PCR產(chǎn)物8μl上樣，電泳100 V，至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部停止;銀染顯色，直至條帶清晰，區(qū)分差異電泳條帶。

表1 鯊魚再生肝組織差別顯示逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)引物

1.6 差異條帶回收及二次擴(kuò)增 采用壓碎與浸泡法進(jìn)行目的片段回收，具體操作如下:將差異條帶切下壓碎后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入150μl 1×TBE，37℃搖床溫浴過(guò)夜;離心收集上清，再向原管中加入50μl 1×TBE，37℃搖床溫浴 15 min，離心合并上清;將上清用無(wú)水乙醇沉淀過(guò)夜，75%乙醇洗滌沉淀，產(chǎn)物溶于10μl ddH2O，－20℃保存?zhèn)溆?以回收的差異基因?yàn)槟０澹韵鄳?yīng)錨定引物和相應(yīng)下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系和程序同前;1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，核對(duì)條帶大小并割膠回收目的差異條帶。

1.7 目的片段克隆及序列分析 將回收的差異條帶與載體連接，反應(yīng)條件:Solution I 5μl，目的片段2 μl，pMD?18-T Simple Vector 1 μl，ddH2O 2 μl，總計(jì)10μl，16℃連接過(guò)夜。將5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E．coliTG1感受態(tài)細(xì)胞，利用載體通用引物菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，反應(yīng)體系:2×Taq PCR Master Mix 5 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0．4 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0．4 μl，總計(jì)10 μl;反應(yīng)程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。序列測(cè)定采用正向測(cè)序，由上海桑尼公司完成。然后將所得目的差異基因序列與國(guó)家生物技術(shù)信息中心已表達(dá)序列標(biāo)志(NCBI EST)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取 Total RNA用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示5s RNA條帶較暗，28s RNA/18s RNA的比值約為2∶1，可見提取的RNA完整性較高(圖1);用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的 OD值，經(jīng)計(jì)算 OD260/OD280的比值為 1．8～2．0，提取的RNA可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 RNA 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)1．正常肝組織;2．再生肝組織

2.2 PCR擴(kuò)增目的片段 40對(duì)PCR產(chǎn)物經(jīng)5%聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯示，條帶清晰可辨。圖2為6對(duì)PCR產(chǎn)物銀染顯示結(jié)果，其中有2條差異比較明顯的條帶，表明這2條差異條帶在肝再生過(guò)程表達(dá)增強(qiáng)。綜合分析，共獲得了10條差異較明顯的序列片段。

2.3 目的片段條帶瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 將選取的10條差異表達(dá)的片段用原引物對(duì)進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增鑒定，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳核對(duì)條帶，顯示目的差異條帶大小與預(yù)期值相符，見圖3。

2.4 差異基因序列分析 10條差異序列通過(guò)Blast檢測(cè)，其中3條與NCBI EST庫(kù)的序列有較高相似性，為已知序列，其他7條序列與已報(bào)道基因無(wú)同源性，為新發(fā)現(xiàn)的功能序列。RF1-6l與33條灰斑竹鯊cDNA克隆序列同源性達(dá)到100%，NF2-2與2條貓鯊胚胎 cDNA文庫(kù)的序列同源性為80%以上，RF2-6s與狗鯊干細(xì)胞系SAE的序列同源性為88%。NF2-2和RF2-6s的比對(duì)結(jié)果見圖4。10條差異序列的比對(duì)及差異表達(dá)情況見表2，其中有8條大小為100～500 bp，5條序列在肝再生過(guò)程表達(dá)上調(diào)，另5條表達(dá)下調(diào)。

圖2 鯊魚再生肝組織差別顯示逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果M．100bp DNA ladder marker;1 ～12．分別為 NF1-1，RF1-1，NF1-2，RF1-2，NF1-3，RF1-3，NF1-4，RF1-4，NF1-5，RF1-5，NF1-6，RF1-6;N表示正常肝組織，R表示再生肝組織，F(xiàn)1表示錨定引物1，最后的數(shù)字編號(hào)表示隨機(jī)引物編號(hào)

圖3 鯊魚再生肝組織差異表達(dá)的目的片段瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)M．DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1～10．分別為條帶 RF1-6l 534 bp，NF1-19 326 bp，RF1-6s 258 bp，RF2-6s 244 bp，RF2-6l 278 bp，NF1-7 236 bp，RF2-8 283 bp，NF2-19 77 bp，NF1-9 208 bp，NF2-2 173 bp，N表示正常肝組織，R表示再生肝組織，F(xiàn)1表示錨定引物1，F(xiàn)2表示錨定引物2，最后的數(shù)字編號(hào)表示隨機(jī)引物編號(hào)

3 討論

mRNA差異顯示PCR技術(shù)(differential display PCR，DD-PCR)是由Liang等在1992年建立的一種尋找差異表達(dá)基因的方法。真核生物基因的mRNA 3'端多數(shù)都帶有一段多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)，其有12種組合:5'-NMAAA…AA-3'，其中 N 代表 A、G、C、T 任意一種堿基，M代表G、C、T任意一種堿基。根據(jù)此序列特征，按堿基配對(duì)的原則，人工合成Poly(dT)引物時(shí)在其3'末端加上兩個(gè)錨定堿基:5'-TTT…TTTMN-3'(M、N同上)，此引物可將 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(又稱為第1鏈)，用此引物錨定cDNA第2條鏈3'端，用5'端隨機(jī)引物與cDNA第1條鏈互補(bǔ)進(jìn)行PCR，隨機(jī)擴(kuò)增cDNA片段，將PCR產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，即可顯示不同的條帶位置，比較不同組間的顯示結(jié)果，將差異條帶回收再擴(kuò)增，通過(guò)雜交驗(yàn)證、克隆測(cè)序等，進(jìn)一步分析其結(jié)構(gòu)與功能［18］。DDRT-PCR技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的推廣和不斷完善，現(xiàn)已非常成熟，所需RNA量少，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)周期短，能同時(shí)比較多種樣品，避免了同位素的污染，可以直接從凝膠上切除肉眼可觀察到的條帶，并且能在任何配備了標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)試劑和儀器的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所以目前大多數(shù)研究人員采用DDRT-PCR技術(shù)研究功能基因的篩選與克?。?9-21］，但DDRT-PCR操作中有兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題需要注意:一是如何得到穩(wěn)定、豐富和清晰的差異條帶，二是如何有效地從差異片段中篩選出真正差異表達(dá)的片段。

圖4 NF2-2和RF2-6s序列與已表達(dá)序列標(biāo)志庫(kù)比對(duì)結(jié)果A．NF2-2 Blast;B．RF2-6s Blast

表2 鯊魚再生肝組織表達(dá)差異序列分析

本實(shí)驗(yàn)采用DDRT-PCR技術(shù)進(jìn)行鯊魚肝臟再生過(guò)程中差異表達(dá)基因的篩選，應(yīng)用垂直電泳槽非變性聚丙烯酰胺膠電泳、實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑配制的銀染溶液，能夠取得良好的差異顯示效果，由于所用試劑及配制銀染溶液的水質(zhì)差別，具體操作中應(yīng)根據(jù)PCR產(chǎn)物的效率對(duì)分離上樣量及銀染時(shí)間做適當(dāng)調(diào)整，才能得到清晰帶型。本實(shí)驗(yàn)采用2條錨定引物、20條10堿基隨機(jī)引物，樣本為正常和再生24 h條紋斑竹鯊肝組織，獲得10條差異片段，其中3條與NCBI EST庫(kù)的序列有較高相似性，另外7條為新發(fā)現(xiàn)的功能序列片段;5條序列在肝再生過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，另5條表達(dá)下調(diào)，這一結(jié)果為進(jìn)一步研究肝再生相關(guān)功能新基因及肝再生機(jī)制提供了有效信息。

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