崔玉娟，張龍飛，平 政，曹雪濱

線粒體是真核細胞進行氧化代謝產(chǎn)生能量的場所，對心肌收縮功能的維持起著至關(guān)重要的作用。冷暴露、饑餓、運動等刺激會誘導線粒體數(shù)量增加和功能改變，即線粒體生物發(fā)生［1］。線粒體生物發(fā)生能夠提高細胞的能量代謝能力，從而滿足心肌持續(xù)收縮所需能量。目前研究表明線粒體生物發(fā)生的主導協(xié)調(diào)因子——過氧化物酶增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator 1α，PGC-1α)在線粒體活動中發(fā)揮了中心作用，它是控制線粒體生物發(fā)生轉(zhuǎn)錄通路上游的調(diào)節(jié)共激活因子，能通過強烈地誘導核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor-1，NRF-1)和核呼吸因子-2(nuclear respiratory factor-2，NRF-2)基因的表達刺激線粒體生物合成，因此，PGC-1α-NRF-1-NRF-2是調(diào)控線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵級聯(lián)信號通路［2］。運動是一種病理生理刺激，適度運動能夠誘導 PGC-1α、NRF-1、NRF-2 的表達［3］，從而刺激線粒體生物發(fā)生。而力竭運動會對機體心臟功能造成負面影響，引起線粒體功能障礙［4］，但其分子機制是否與線粒體生物發(fā)生有關(guān)尚不明確。紅景天苷(Salidroside，SAL)是中藥紅景天中的主要有效成分之一，具有抗心肌缺血缺氧、抑制心肌細胞凋亡、促進血管再生、抗動脈粥樣硬化等作用［5-7］。本實驗擬通過研究SAL對力竭大鼠心肌線粒體生物發(fā)生關(guān)鍵調(diào)控因子 PGC-1α、NRF-1、NRF-2在不同時相的表達，為SAL的臨床應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 清潔級SD雄性大鼠104只［軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(京)2003-1-003］。98%提純紅景天苷粉(南京澤朗植提技術(shù)有限公司)，兔抗PGC-1α抗體、兔抗NRF-1抗體及兔抗NRF-2抗體(英國Abcam公司)，兔抗β-Actin抗體(美國CST公司)，HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)(中國中杉金橋公司)。凝膠成像系統(tǒng) Fluor Chem E(美國 Cell Biosciences公司)。Image J 1．44圖像分析軟件(National Institutes of Health)。

1.2 方法

1.2.1 分組:將104只SD大鼠隨機分對照(C)組、力竭(EE)組、低劑量SAL力竭(LS)組、高劑量SAL力竭(HS)組，對照組8只，其余組分4個時間點即即刻、6 h、12 h、24 h 觀察，每個時間點8 只。

1.2.2 造模及取材:C及EE組給予生理鹽水10 ml/kg灌胃 2周，LS和 HS組給予 SAL 100、300 mg/kg灌胃2周。EE、LS和HS組灌胃結(jié)束后分別予以建立一次性力竭游泳模型，C組無需特殊處理。一次性力竭游泳模型建立方法:使用塑料圓桶(高60 cm、直徑55 cm)作為大鼠的游泳場地，注意保證水的清潔，水深約 50 cm，水溫保持在(32.0±0．5)℃。模型建立前大鼠均進行適應性的無負重游泳練習，每次10 min，造模前大鼠需禁食12 h，造模時大鼠尾部負為體重3%的鉛塊。一次性力竭游泳運動所達到的力竭狀態(tài)參考Thomas力竭標準［8］:①大鼠超過10 s沉入水下后無法再返回水面;②大鼠的協(xié)調(diào)運動消失，出現(xiàn)了無方向性的亂竄，雖少于10 s亦可定為大鼠已力竭。對于短時間(2 h)內(nèi)就出現(xiàn)了運動不協(xié)調(diào)的大鼠，將其撈出休息5 min后，繼續(xù)進行游泳運動至其力竭。達到力竭標準后，將大鼠撈出，吹干皮毛，并記錄結(jié)束時間。力竭后即刻、6、12、24 h，立即摘除3個模型組大鼠心臟，去除心房，于緩沖液中洗去心臟殘留血漬，裝入2 ml離心管中，做好標記，置于液氮中冷凍后于－80℃冰箱中保存。同時期相同方法處理 C組大鼠。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠一般狀況及游泳時間:觀察3個模型組力竭運動前后的一般狀況，記錄并比較EE、LS、HS組力竭游泳時間。

1.3.2 大鼠心肌 PGC-1α、NRF-1、NRF-2的蛋白表達測定:以 β-actin作為內(nèi)參。提取心肌蛋白，用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度。取15μg蛋白質(zhì)樣品行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，1%脫脂奶粉稀釋一抗 PGC-1α、NRF-1、NRF-2、β-actin分別按照1∶1000、1∶500、1∶500、1∶1000 的比例稀釋4℃孵育過夜，漂洗3次，HRP標記山羊抗兔IgG按照1∶10 000的比例稀釋，漂洗3次。使用ECL試劑盒發(fā)光顯影，放入凝膠成像系統(tǒng) Fluor Chem E中曝光顯影，使用Image J 1．44圖像分析軟件計算蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(x±s)表示。各組間數(shù)據(jù)符合正態(tài)、方差齊(α＞0．1)時采用單因素方差分析，方差不齊時采用Dunnertt法，α=0．05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及游泳時間 各模型組大鼠力竭運動前活動自如，皮毛光亮，一般狀況可;力竭游泳運動后表現(xiàn)為極度疲勞的狀態(tài):呼吸急促，運動遲緩，對刺激的反應不靈敏，部分動物甚至出現(xiàn)了結(jié)膜充血、血尿等征象。EE、LS及HS組游泳時間分別為(500．8 ± 18．0)、(580．9 ± 17．5)、(675．9 ±20．2)min，LS及HS組游泳時間較EE組明顯延長(P＜0.05)，HS組游泳時間較LS組明顯延長(P＜0.05)。

2.2 各組心肌蛋白表達量比較

2.2.1 心肌PGC-1α蛋白表達量:EE、LS及HS組PGC-1α蛋白表達量均為即刻最低，6 h最高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與C組比較，EE組各時相心肌PGC-1α蛋白的表達量均降低(P＜0.05)。與相同時相的EE組比較，LS組即刻、6、24 h，HS組各時相心肌PGC-1α蛋白表達量均顯著增高(P＜0.05)。與相同時相的LS組比較，HS組即刻、24 h PGC-1α蛋白的表達量顯著降低，6、12 h顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1、圖1。

2.2.2 心肌NRF-1蛋白表達量:各組不同時相心肌NRF-1蛋白表達比較，LS組6 h表達量最高，即刻表達量最低;HS組6 h表達量最高，24 h表達量最低。與C組比較，EE組即刻、6 h、24 h心肌NRF-1蛋白表達量顯著降低(P＜0.05)。與相同時相的EE 組比較，LS組6、12、24組，HS組即刻、12 h心肌NRF-1蛋白表達量顯著增高(P＜0.05)。與相同時相的LS組比較，HS組各時相心肌NRF-1蛋白表達量均顯著降低(P＜0.05)。見表1、圖1。

2.2.3 心肌NRF-2蛋白表達量:EE、LS及HS組NRF-2蛋白表達量均為12 h表達量最高，即刻表達量最低(P＜0.05)。與C組比較，EE組即刻、6 h、24 h心肌NRF-2蛋白表達量顯著降低(P＜0.05)。與相同時相的EE組比較，LS組即刻、6 h、12 h，HS組各時相心肌NRF-2蛋白表達量均顯著增高(P＜0.05)。與相同時相的LS組比較，HS組6、12、24 h心肌NRF-2蛋白表達量均顯著增高(P＜0.05)。見表1、圖1。

3 討論

在真核生物體內(nèi)，細胞呼吸、能量產(chǎn)生及其他代謝過程均發(fā)生在線粒體內(nèi)。線粒體是細胞代謝活動的重要調(diào)節(jié)器，是真核生物的糖、脂肪和氨基酸進行氧化最終釋放能量的場所。力竭運動后心肌耗氧量增加，細胞內(nèi)三磷腺苷(ATP)減少，影響細胞內(nèi)各種生化反應的進行，從而使心肌正常功能受到損害。PGC-1a作為線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對維持生物活動的能量平衡起到重要的生理意義［9］。Ventura Clapier等［10］通過對降低心肌氧化能力在心臟衰竭的發(fā)病機制中作用的研究表明，心臟及骨骼肌在壓力超負荷下由于PGC-1a及其下游的NRF-2等因子的表達下調(diào)而引起線粒體功能減弱。本研究結(jié)果顯示，所有力竭運動后大鼠的PGC-1α、NRF-1和NRF-2的蛋白表達量均低于對照組，表明力竭運動會降低心肌線粒體的功能。此外，很多研究表明在接觸外源性氧化應激［11-13］或應答氧化損傷［14］時，線粒體生物生成會增加。本研究中各組PGC-1α和NRF-2蛋白均在力竭后即刻的表達量最低，隨時間延長蛋白表達量有所升高，PGC-1α在6 h升到最高，NRF-2在12 h達高峰，無進一步升高趨勢。表明線粒體生物發(fā)生是力竭大鼠應對心肌缺血缺氧的氧化應激反應。

表1 各組大鼠心肌PGC-1α、NRF-1、NRF-2蛋白表達量比較(x±s)

圖1 各組大鼠心肌PGC-1α、NRF-1、NRF-2蛋白表達PGC-1α．過氧化物酶增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α，NRF-1．核呼吸因子-1，NRF-2．核呼吸因子-2;C組．對照組，EE組．力竭組，LS組．低劑量紅景天苷力竭組，HS組．高劑量紅景天苷力竭組

紅景天是多年生草本植物，多生長于亞洲的高海拔地區(qū)與歐洲北極地區(qū)的干燥沙地，在惡劣的生長環(huán)境中表現(xiàn)出耐寒、耐干旱、耐強紫外線照射等特性，這表明紅景天對環(huán)境的適應能力很強，生命力非常旺盛。作為紅景天主要活性物質(zhì)SAL的臨床藥用價值很高，尤其在心血管疾病治療方面，近些年來對其研究越來越多。有研究表明，SAL對缺氧誘導的心肌細胞損傷有保護作用［15］。楊雷等［16］的研究表明，SAL能促進心肌梗死后大鼠心肌組織血管的再生。而本研究中LS及HS組力竭游泳時間均明顯高于EE組，說明SAL能夠增強大鼠的運動耐力。LS組PGC-1α、NRF-1和 NRF-2及 HS組的 PGC-1α和NRF-2蛋白表達量顯著高于EE組，說明SAL能夠上調(diào)線粒體生物發(fā)生調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子PGC-1α和NRF-2的表達，低劑量SAL能夠上調(diào)NRF-1的表達，從而刺激線粒體的生物發(fā)生，對力竭運動產(chǎn)生的心肌損傷起保護作用。但HS組的NRF-1蛋白表達未見上調(diào)，可能是高劑量SAL通過對其他因子的調(diào)節(jié)影響了NRF-1的蛋白表達，具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，力竭運動會造成心肌損傷，影響線粒體的功能，而SAL能通過刺激線粒體的生物發(fā)生形成對心肌的保護作用。SAL具有很好的開發(fā)前景，但其對心臟疾病的作用機制尚未完全清楚，仍需深入研究。

［1］ Diaz F，Moraes C T.Mitochondrial biogenesis and turnover［J］.Cell calcium，2008，44(1):24-35.

［2］ Scarpulla R C.Metabolic control of mitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatory network［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1813(7):1269-1278.

［3］ Baar K，Wende A R，Jones T E，et al.Adaptations of skeletal muscle to exercise:rapid increase in the transcriptional coactivator PGC-1［J］.FASEB J，2002，16(14):1879-1886.

［4］ Davies K J，Quintanilha A T，Brooks G A，et al.Free radicals and tissue damage produced by exercise［J］.Biochem Biophys Res Commun，1982，107(4):1198-1205.

［5］ Zhong H，Xin H，Wu L X，et al.Salidroside attenuates apoptosis in ischemic cardiomyocytes:a mechanism through a mitochondria-dependent pathway［J］.JPharmacol Sc，2009，114(4):399-408.

［6］ Wu T，Zhou H，Jin Z，et al.Cardioprotection of salidroside from ischemia/reperfusion injury by increasing N-acetylglucosamine linkage to cellular proteins［J］.Eur J Pharmacol，2009，613(1):93-99.

［7］ Qian E W，Ge D T，Kong SK.Salidroside promotes erythropoiesis and protects erythroblasts against oxidative stress by up-regulating glutathione peroxidase and thioredoxin［J］.J Ethnopharmacol，2011，133(2):308-314.

［8］ Thomas D P，Marshall K I.Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures［J］.Int J Sports Med，1988，9(4):257-260.

［9］ Scarpulla R C.Metabolic control of mitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatory network［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1813(7):1269-1278.

［10］Ventura Clapier R，Garnier A，Veksler V.Transcriptional control of mitochondrial biogenesis:the central role of PGC-1α［J］.Cardiovasc Res，2008，79(2):208-217.

［11］ Arany Z，He H，Lin J，et al.Transcriptional coactivator PGC-1αcontrols the energy state and contractile function of cardiac muscle［J］.Cell Metab，2005，1(4):259-271.

［12］ Irrcher I，Ljubicic V，Hood D A.Interactions between ROSand AMPkinase activity in the regulation of PGC-1α transcription in skeletal muscle cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2009，296(1):C116-C123.

［13］ Suliman H B，Carraway M S，Welty Wolf K E，et al.Lipopolysaccharide stimulates mitochondrial biogenesis via activation of nuclear respiratory factor-1［J］.JBiol Chem，2003，278(42):41510-41518.

［14］ Rasbach K A，Schnellmann R G.Signaling of mitochondrial biogenesis following oxidant injury ［J］.J Biol Chem，2007，282(4):2355-2362.

［15］宋月英，閆玉仙，韓慧文.紅景天苷藥理研究進展［J］.武警醫(yī)學院學報，2008，17(7):635-637.

［16］楊雷，劉暖，毛秉豫，等.紅景天苷上調(diào)大鼠心肌梗死后心肌組織VEGF的表達［J］.南陽理工學院學報，2013，5(6):120-124.