龔 賀 張雷鳴 任偉超 張艷賀 劉秀波

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

孔祥軍 佟春香 馬 偉

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院) (齊齊哈爾中醫(yī)醫(yī)院) (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué))

植物內(nèi)生菌是指生活在健康植物組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，是與宿主植物在長(zhǎng)期共同進(jìn)化過(guò)程中衍生的一類微生物［1］。據(jù)內(nèi)生菌與宿主植物的親和關(guān)系，可將其分為專一性和非專一性。內(nèi)生菌在寄主的科、種以及組織水平上都存在專一性［2－3］。而某些植物內(nèi)生菌自身或其次生代謝產(chǎn)物中含有和宿主植物相同或相近的活性成分［4－6］，在一定程度上為解決臨床藥物來(lái)源以及農(nóng)作物的生物防治等方面提供了新的思路［7］。藥用植物內(nèi)生真菌的研究雖然處于起步階段，但其實(shí)用價(jià)值和社會(huì)價(jià)值已經(jīng)受到越來(lái)越多的重視，從藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中篩選有效的活性物質(zhì)或新型化合物以研究新的藥物，將在很大程度上豐富人類醫(yī)藥寶庫(kù)，解決自然資源不足，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展［8－9］。

1 研究方法

1.1 分離純化培養(yǎng)基

PDA(A):PDA 粉末與蒸餾水配制而成。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(B):牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、水lL、pH =7.4 ～7.6。LB 固體培養(yǎng)基(C):胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂20 g。高氏I 號(hào)培養(yǎng)基(D):可溶性淀粉20.00 g、KNO31.00 g、NaCl 0.50 g、K2HPO40.50 g、MgSO40.50 g、FeSO40.01 g、蒸餾水1 L、瓊脂20.00 g、pH=7.4 ～7.6。孟加拉紅培養(yǎng)基:蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20.0 g、1/3 000 孟加拉紅溶液0.1 L、氯霉素0.1 g、蒸餾水1 L。

1.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L，pH 自然條件。

1.3 內(nèi)生真菌的分離

采用組織分離法，植物材料取自哈爾濱呼蘭區(qū)7月份膜莢黃芪2年生植株。選擇無(wú)病斑的新鮮的黃芪根、葉部分，用無(wú)菌水沖洗干凈，用解剖刀把根切成3 cm 的小段保持切口整齊，葉片切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的方塊型小片，在干凈濾紙上吸干水晾干。在無(wú)菌條件下，將切好的材料用自來(lái)水沖洗干凈，75%的乙醇漂洗5 min，無(wú)菌水沖洗3 次(每次2 min)。將處理過(guò)的根段和葉在無(wú)菌條件下切去兩端，根切成小片，隨即將小片分別種植于PDA、LB、高氏、牛肉膏培養(yǎng)基平板上，每種培養(yǎng)基設(shè)3 個(gè)平行皿，每皿4 片，置于培養(yǎng)箱中28 ℃倒置培養(yǎng)3 ～7 d。

葉片處理同根處理。空白對(duì)照做3 種處理:一是空白培養(yǎng)基不接組織塊;二是將培養(yǎng)基內(nèi)接入消毒時(shí)要使用的同等條件下滅菌的無(wú)菌水少許;三是在消毒的操作過(guò)程中，將培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿開放暴露于超凈臺(tái)內(nèi)。驗(yàn)證培養(yǎng)基、無(wú)菌水和超凈臺(tái)滅菌是否徹底。觀察各組織塊在4 種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)，采用無(wú)菌接種針在組織塊周圍將剛長(zhǎng)出的菌絲邊緣部分移接到新鮮培養(yǎng)基上劃線，隨時(shí)觀察培養(yǎng)基變化，挑少許菌絲到平板上和其他3 種培養(yǎng)基上反復(fù)進(jìn)行經(jīng)典過(guò)程純化。

為檢查材料表面消毒是否徹底做如下對(duì)照試驗(yàn):直接接組織塊，將與上述同樣處理過(guò)的根段和葉不做分割，直接種植在4 種培養(yǎng)基平皿上;在相同條件下培養(yǎng)，接洗滌水，將最后一次清洗消毒組織塊的無(wú)菌水涂于4 種培養(yǎng)基表面，置于同等條件下培養(yǎng);將與上述同樣處理過(guò)的根段和葉直接在4 種培養(yǎng)基表面做印記。

隨時(shí)觀察試驗(yàn)培養(yǎng)皿及對(duì)照皿出菌情況及組織片變化，待根組織邊緣和葉邊緣長(zhǎng)出菌后，挑取菌絲或菌體，經(jīng)平板劃線法反復(fù)分離、純化，培養(yǎng)觀察菌落的形態(tài)，比較4 種培養(yǎng)基對(duì)黃芪內(nèi)生真菌的分離情況，并轉(zhuǎn)入相應(yīng)斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，放入冰箱中4 ℃短期保藏，備用。

1.4 表面消毒的效果檢測(cè)

1.4.1 無(wú)菌水檢驗(yàn)法

將表面消毒的樣本在滅過(guò)菌的5 mL 無(wú)菌水中震蕩，取出樣本，取1 mL 菌懸液涂布在PDA 培養(yǎng)基表面，25 ℃下恒溫培養(yǎng)1 周，觀察記錄是否有真菌長(zhǎng)出。

1.4.2 組織塊印跡法

植物樣本經(jīng)過(guò)上述表面消毒流程后，葉片選取整片葉片、根選2 cm 的小段，直接接到PDA 固體培養(yǎng)基上，25 ℃下恒溫培養(yǎng)1 周，觀察記錄是否有真菌生長(zhǎng)。再經(jīng)過(guò)改進(jìn)，上述流程下滅過(guò)菌的組織塊在PDA 培養(yǎng)基上輕輕印記，再取出組織塊，將培養(yǎng)基在25 ℃下恒溫培養(yǎng)1 周，并觀察是否有菌落產(chǎn)生。

1.5 內(nèi)生真菌的形態(tài)鑒定

根據(jù)根葉在4 種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況，顯微鏡觀測(cè)記錄，菌株形態(tài)參考《真菌鑒定手冊(cè)》。制成水載片，用光學(xué)顯微鏡定期觀察產(chǎn)孢內(nèi)生真菌菌絲結(jié)構(gòu)、菌落形態(tài)特征等指標(biāo)鑒定到屬。

手工挑取真菌單孢子顯微操作:選用2 臺(tái)普通生物顯微鏡，2 支自制玻璃挑孢針。每次挑取不同內(nèi)生真菌時(shí)需重新使用潔凈的挑孢針，在超凈工作臺(tái)上操作。取出待分離的平板培養(yǎng)皿真菌材料，在顯微鏡的物鏡下找到平板中菌落邊緣分散的孢子，將針尖輕輕向視野中間的菌落邊緣單個(gè)孢子靠碰，有時(shí)一次碰孢子即可粘附到針尖上，更多情形時(shí)經(jīng)過(guò)多次靠碰，才能粘附到針尖上。當(dāng)視野中要碰取的單個(gè)孢子消失了，說(shuō)明已沾到針尖上，此時(shí)輕輕抬起針頭，并移離顯微鏡下，將孢子轉(zhuǎn)移到水載玻片上，加蓋蓋玻片，將載玻片移到顯微鏡觀察孢子的形態(tài)進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

從膜莢黃芪根、葉各培養(yǎng)基上共分離得到65 株內(nèi)生真菌，結(jié)合菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)特征，最終將膜莢黃芪內(nèi)生真菌做出了明確的分類。在PDA 培養(yǎng)基上分離得到根中內(nèi)生真菌55 株(37 株鐮孢屬，10株曲霉屬、8 株青霉屬)。在LB 培養(yǎng)基上得到3 株鐮孢屬根部?jī)?nèi)生真菌。在高氏培養(yǎng)基上得到1 株鐮孢屬根內(nèi)生真菌。在PDA 培養(yǎng)基上得到6 株鐮孢屬葉片內(nèi)生真菌。瘤坐孢科鐮孢屬(Fusarium)47株，菌絲在培養(yǎng)基中擴(kuò)展呈棉絮狀，常帶有粉紅色、紫紅色，菌株菌絲為純白色絨毛狀表面部分突起，菌絲向外生長(zhǎng)，紋飾疏松，邊緣整齊，質(zhì)地絨毛狀、粉粒狀、棉絮狀，分泌色素有紫褐色、紫紅色、或無(wú)色素。大型孢子多細(xì)胞，鐮刀形，微彎或兩端尖而小型分生孢子單胞，卵圓形或長(zhǎng)圓形，單個(gè)孢子有3 個(gè)細(xì)胞，長(zhǎng)圓形或略微彎。從梗孢科青霉屬(Penicillium)10株，菌落綠色、黃綠色、青綠色或淡灰黃色紋飾致密，邊緣整齊、革質(zhì)狀質(zhì)地?zé)o滲出物。分生孢子梗從菌絲上單個(gè)的發(fā)生或不常成束，在頂部附近分支，對(duì)稱或不對(duì)稱，頂層為小梗，由小梗再生成分生孢子，單個(gè)孢子球形、卵圓形。從梗孢科曲霉屬(Aspergillus)8 株，菌落由黃色再變成黃綠色，平坦或放射狀溝紋，反面無(wú)色或帶褐色質(zhì)地絮狀無(wú)滲出物紋飾致密。在幼小而獲利旺盛時(shí)，菌絲體產(chǎn)生大量的分生孢子梗，分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，一般呈球形。頂囊表面長(zhǎng)滿1 層或2 層輻射狀小梗。最上層小梗瓶狀，頂端著生成串的球形分生孢子。孢子多呈綠、黃、褐色。分生孢子梗頂端膨大，分生孢子成串。孢子梗大部無(wú)橫隔，光滑、粗糙或有痣點(diǎn)，常在頂部膨大形成棍棒形、橢圓形、半球形或球形的頂囊?？瞻着囵B(yǎng)基、接滅菌水的培養(yǎng)基、印跡法周圍均未有真菌產(chǎn)生，而消毒后切去兩端的組織塊周圍在第5 天有白色菌落長(zhǎng)出，此內(nèi)生真菌明顯從組織內(nèi)部溢出(圖1)。

圖1 青霉屬、曲霉屬、鐮孢屬及其分生孢子

3 結(jié)論與討論

對(duì)照平板培養(yǎng)約5 d 均沒(méi)有觀察到菌落長(zhǎng)出，表明表面消毒徹底。從黃芪根、葉片中分離得到的內(nèi)生菌共65 株，經(jīng)顯微形態(tài)觀察、鑒定為半知菌門鐮孢屬、曲霉屬、青霉屬，其中鐮孢屬為優(yōu)勢(shì)菌群，且大都無(wú)孢子產(chǎn)生。

黃芪內(nèi)生真菌培養(yǎng)到第5 天，菌落直徑大多可達(dá)到9 cm，培養(yǎng)至第8 天時(shí)植物內(nèi)生菌的菌落在PDA上明顯比在牛肉膏、高氏、LB 培養(yǎng)基上菌落大且菌落生長(zhǎng)良好。因此，將PDA 培養(yǎng)基作為植物內(nèi)生真菌固體形態(tài)觀察培養(yǎng)可行，觀察效果良好。不同部位內(nèi)生真菌差異有待研究，優(yōu)勢(shì)種群主要集中在根中分離得到的內(nèi)生真菌，大多為鐮孢屬內(nèi)生真菌。

挑孢針的制作及優(yōu)點(diǎn):2 支玻璃細(xì)管在酒精燈上燒紅尖端部，加熱后的玻璃細(xì)管前端融化部位接觸粘連后迅速抽拉，拉直并拉成細(xì)針尖狀，即得到所需的挑孢針。分離得到單孢子可靠，單孢子分離效率高，實(shí)用性好，可分離各種基質(zhì)上的孢子，可分離不同種類和大小的孢子，可進(jìn)行特殊需要的操作，比如分離單個(gè)孢子囊內(nèi)的孢子，脫除孢子表面的細(xì)菌，工具簡(jiǎn)單，可在一般實(shí)驗(yàn)環(huán)境下進(jìn)行，用少量的材料即可實(shí)施單孢分離。大多數(shù)分離出的內(nèi)生真菌孢子大于5 μm 在10 倍物鏡下清楚可見(jiàn)，可以方便地進(jìn)行單孢子分離。其中一些內(nèi)生真菌的孢子微小且顏色較淺時(shí)，一般需要40 倍物鏡才能清楚檢視，對(duì)于不產(chǎn)孢的菌株，通過(guò)適當(dāng)光照或用挑孢針在菌落表面反復(fù)刮擦刺激產(chǎn)孢。

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