黃德旺 陸愛英 磨慶福 李軍 謝寧 陳康部 蔡永林

·短篇論著·

梧州區(qū)域乙型肝炎病毒基因型分布及耐藥基因自然變異調(diào)查

黃德旺1陸愛英2磨慶福1李軍2謝寧1陳康部1蔡永林2

目的了解梧州區(qū)域乙型肝炎病毒（HBV）基因型、未經(jīng)抗病毒治療的耐藥基因自然變異分布情況及兩者與臨床、免疫生化之間的關(guān)系。方法收集122例未經(jīng)抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者血清，采用時間分辨熒光分析法檢測乙肝病毒標(biāo)志物，熒光定量PCR法檢測HBV-DNA，PCR-反向點雜交法檢測HBV基因型及變異基因。羅氏Cobas 702型全自動生化分析儀速率法檢測轉(zhuǎn)氨酶。結(jié)果122例乙型肝炎患者中，檢出HBV-B型41例（33.6%），C型75例（61.5%），B+C混合型5例（4.1%），未分型1例（0.8%），未發(fā)現(xiàn)D型患者。共發(fā)現(xiàn)14例患者存在拉米夫定耐藥基因自然變異，自然變異率為11.5%（14/122），其中C型14.7%（11/ 75）明顯高于B型2.4%（1/41）（P<0.05）。B型和C型基因型分布的男女比例、年齡及HBV-DNA載量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。C型的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶水平、HBeAg陽性率顯著高于B型（P<0.05）。結(jié)論梧州區(qū)域慢性乙型肝炎患者中，優(yōu)勢基因型為C型。在未經(jīng)抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者中存在自然耐藥變異基因，且C型較B型發(fā)生率高，C型可能與損害較嚴(yán)重的肝病有關(guān)。

乙肝病毒；基因型；耐藥基因；自然變異

乙型肝炎病毒（HBV）基因型及耐藥基因檢測是目前國內(nèi)外研究的熱點，對指導(dǎo)臨床用藥、療效評估、判斷預(yù)后具有重要意義。HBV據(jù)全基因序列差異可分為A-H 8個基因型，基因型分布具有地域性，且存在自然耐藥基因[1-2]。本研究就梧州區(qū)域乙肝病毒基因型從分布情況、是否存在耐藥基因自然變異及與某些免疫生化指標(biāo)是否存在相關(guān)性作一探討。

資料和方法

一、研究對象

2012年9月至2013年9月本院住院及門診慢性乙型病毒性肝炎患者122例，來自梧州區(qū)域戶籍，均符合慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。排除合并HIV、HAV、HCV、HDV、HEV感染，及酒精性、藥物性、自身免疫性肝炎等所致的肝損害。所有病例檢查前均無使用抗病毒藥物治療史，其中男92例，女30例，年齡18～72歲，平均年齡38.2歲。

二、HBV血清標(biāo)志物檢測

乙型肝炎e抗原（HBeAg）、乙型肝炎e抗體（HBeAb）檢測采用時間分辨熒光分析法，試劑盒由蘇州新波生物技術(shù)有限公司提供，儀器為ANYTEST時間分辨免疫分析儀。

三、HBV-DNA定量檢測

采用熒光定量PCR法檢測，試劑由中山大學(xué)達安基因公司提供，儀器為DA7600型實時熒光定量PCR儀。HBVDNA大于1 000 IU/mL為入選對象。

四、HBV基因分型和耐藥突變基因檢測

采用PCR-反向點雜交法檢測HBV-B、C、D三種常見基因亞型及與拉米夫定、阿德福韋酯耐藥相關(guān)的6個常見位點的突變：rt180M、rt204V、rt204I、rt207I為拉米夫定常見耐藥位點，阿德福韋酯常見耐藥位點為rtA181V、rtA236T。試劑由深圳亞能生物技術(shù)公司提供，儀器為ABI Veriti梯度PCR擴增儀、FYY-3分子雜交儀。

五、肝功能檢測

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）采用速率法檢測。試劑由羅氏公司提供，儀器為羅氏Cobas 702型全自動生化分析儀。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件，HBV-DNA載量經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換后，以表示，組間比較采用成組設(shè)計t檢驗；ALT、AST結(jié)果以中位值（四分位數(shù)范圍）表示，組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗；率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、HBV基因型分布狀況及HBV基因型與HBVDNA、HBeAg以及ALT、AST水平的關(guān)系

122例乙型肝炎患者中，檢出HBV-B型41例（33.6%），C型75例（61.5%），B+C混合型5例（4.1%），未分型1例（0.8%），未發(fā)現(xiàn)D型患者。同時測定各基因型HBV-DNA、HBeAg以及ALT、AST水平。如表1所示。

B+C混合型和未分型患者例數(shù)過少，因此未納入統(tǒng)計分析。B型和C型的男女比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 0.013，P=0.911）。兩組的年齡及HBV-DNA載量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.411，0.041；P=0.161，0.683）。B型的血清ALT及AST水平顯著低于C型（z=2.169，2.088；P= 0.030，0.037）。B型的HBeAg陽性率顯著低于C型（χ2= 3.998，P=0.046），HBeAb陽性率則顯著高于C型（χ2= 4.414，P=0.036）。

表1 122例不同HBV基因型患者臨床資料與血清資料比較

二、耐藥基因自然分布情況

如表2所示，本組病例中共發(fā)現(xiàn)14例患者存在拉米夫定耐藥基因自然變異，自然變異率為11.5%（14/122）；但未發(fā)現(xiàn)阿德福韋酯耐藥基因自然變異。其中C型患者的拉米夫定耐藥基因自然變異率14.7%（11/75），明顯高于B型的2.4%（1/41）（χ2=4.273，P=0.039）。

表2 HBV基因型與拉米夫定耐藥變異類型的關(guān)系

討論

目前，根據(jù)HBV的基因多態(tài)性，來自不同國家和地區(qū)的所有HBV可分為A－H等8個基因型。研究表明[4]，HBV基因型呈明顯的地域分布，各國家和地區(qū)差異明顯，甚至同一國家不同地區(qū)的HBV基因型分布也有差異。高俊薇等[1]報道我國11個城市1 214份慢性HBV感染者中，以B、C基因型為主，也存在B＋C混合型感染者，北方地區(qū)主要以C基因型為主，南方則以B型為多見。黃重敏于2004年報道[5]桂西30例壯族人群慢性乙肝病毒基因型分布有B、C、D型，其中以D型最多見，其次為C型。吳淋玲于2011年報道[6]120例廣西桂北地區(qū)慢性乙肝患者中基因型分布，B基因型86例，C基因型24例，B＋C混合型6例，其它4例，以B型為多見。鐘大妮于2013年報道[7]廣西地區(qū)181例HBV感染中B基因型61例、C型基因120例，未見其它基因型或B、C型重疊情況，故以C基因型多見。梧州區(qū)域?qū)儆趶V西與廣東交界處，本研究發(fā)現(xiàn)122例慢性乙肝患者中，檢出HBV-B型41例（33.6%），C型75例（61.5%），B+C混合型5例（4.1%），未分型1例（0.8%），未發(fā)現(xiàn)D型患者。故以C型為優(yōu)勢株。廣西是肝癌高發(fā)區(qū)之一，多數(shù)報道[7-8]以C基因型為主，亦表明肝癌可能與C基因型密切相關(guān)。Yang等[9]有類似報道。

本研究尚發(fā)現(xiàn)，C基因型中ALT、AST較B基因型顯著升高，HBeAg陽性率亦顯著高于B基因型，提示C基因型與較嚴(yán)重的HBV感染相關(guān)性肝病病情有關(guān)，HBeAg轉(zhuǎn)換率低，也可能為經(jīng)驗性抗病毒治療失敗，導(dǎo)致病情加重，更易導(dǎo)致肝硬化、肝癌的發(fā)生。Sugauchi等[10]發(fā)現(xiàn)，C基因型與ALT持續(xù)升高的慢性肝病相關(guān)性高于B基因型。大量研究表明[9,11]，C基因型與慢性HBV感染者臨床病程的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。C型易導(dǎo)致肝硬化、肝癌的發(fā)生。但與鐘大妮報道不大一致[7]，這可能與所處兩廣交界地界的環(huán)境因素及生活習(xí)慣有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)任何抗病毒治療患者可存在拉米夫定自然耐藥變異基因，發(fā)生率為11.5%（14/122），C型患者的耐藥基因自然變異率為14.7%（11/75），明顯高于B型的2.4%（1/41），亦可能與C基因型與HBV感染較嚴(yán)重的肝病及廣西是肝癌高發(fā)區(qū)相關(guān)。本地區(qū)未發(fā)現(xiàn)阿德福韋酯耐藥基因自然變異情況。吳潔[2]報道49例未使用抗病毒治療的慢性乙肝患者中有7例發(fā)生YMDD突變，變異率為14.29%。戴晨陽[12]報道90例未進行抗病毒治療的慢性乙肝患者中有6例發(fā)生變異，變異率為6.67%。故在梧州區(qū)域，存在自然耐藥變異基因發(fā)生率較高，最好在未行任何抗病毒治療前常規(guī)行耐藥變異基因檢測，以免治療失敗，延誤病情。

綜上所述，梧州區(qū)域HBV感染基因型分布以C基因型多見，存在自然耐藥變異基因，且自然耐藥變異基因產(chǎn)生C型顯著高于B型。C型患者AST、ALT及HBeAg陽性率均高于B型，可能更易導(dǎo)致肝硬化、肝癌的發(fā)生。故開展HBV基因型檢測不僅有重要的流行病學(xué)意義，而且可指導(dǎo)臨床用藥、判斷疾病進程、藥物療效及預(yù)后等，由于本研究某些數(shù)據(jù)樣本較少，尚需加大樣本量進一步深入研究。

參考文獻

1高俊薇,李雅娟,莊輝,等.中國11城市乙型肝炎病毒慢性感染者中乙型肝炎病毒基因型分布.中華流行病學(xué)雜志,2007,28(4): 315-318.

2吳潔,覃西.海南地區(qū)乙型肝炎基因型與YMDD自然突變的相關(guān)性.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,15(7):714-716.

3中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會,中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙肝診治指南(2010版).中華肝臟病學(xué)雜志,2011,19(1):13-24.

4鄭瑞丹,高建平,盧燕輝,等.漳州地區(qū)乙型肝炎病毒基因型分布及其臨床意義.中華實驗和臨床感染病雜志(電子版),2011,5(2): 212-219.

5黃重敏,覃亞勤,覃后繼,等.桂西壯族人群乙肝病毒基因型研究.中國病毒學(xué),2004,19(2):177-178.

6吳淋玲,楊麗莎,蔣科雪,等.廣西桂北地區(qū)慢性HBV感染不同免疫狀態(tài)與HBV基因型關(guān)系研究.重慶醫(yī)學(xué),2011,40(13):1249-1251.

7鐘大妮,李國堅,吳繼周,等.廣西地區(qū)乙肝病毒基因分型與臨床表現(xiàn)及機體免疫功能關(guān)系的研究.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2013,10(2):1-3. 8蘇明華,周元平,江建寧,等.乙型肝炎病毒基因型、YMDD變異與拉米夫定治療后HBV DNA反彈關(guān)系的.實用肝臟病雜志, 2008,11(3):154-156.

9Yang HI,Yeh SH,Chen PJ,et a1.Associations between hepatitis B virus genotype and mutants and the risk of hepatocellular carcinoma. J Natl Cancer lnst,2008,100(16):l134-l143.

10 Sugauchi F,Chutaputti A,Orito E,et al.Hepatitis B virus genotype and clinical manifestation among hepatitis B carriers in Thailand.J Gastroeterol Hepatol,2002,17(6):671-676.

11遲曉偉,游晶,張艷梅,等.云南地區(qū)慢性乙型肝炎病毒感染者病毒基因型、變異與肝細胞癌的關(guān)系.中華消化雜志,2012,32(5): 338-340.

12戴晨陽,劉麗,梁樹人,等.658例乙型肝炎患者HBV多位點耐藥基因檢測結(jié)果分析.山東醫(yī)藥,2012,52(7):56-58.

2013-12-26）

（本文編輯：南清振）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.02.009

543002廣西梧州市紅十字會醫(yī)院1消化內(nèi)科；2醫(yī)學(xué)檢驗科

蔡永林，E-mail：cylzen@163.com

梧州市科技計劃項目（201002048）