姚晶，邵興慧，宋光遠(yuǎn)，趙振燕，高海洋，武德崴，滕思勇，吳永健

糖尿病減弱心肌組織肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)三磷酸腺苷酶的小泛素樣修飾*

姚晶，邵興慧，宋光遠(yuǎn)，趙振燕，高海洋，武德崴，滕思勇，吳永健

目的：探索糖尿病是否可以通過心肌組織肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)三磷酸腺苷(ATP)酶（SERCA2a）的小泛素樣修飾進(jìn)而影響SERCA2a的活性與表達(dá)。

糖尿病；肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶；小泛素樣修飾

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:932.)

糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病尤其是2型糖尿病最重要的并發(fā)癥。除了對心臟血管的損傷之外，糖尿病對心肌本身也能造成損傷，最終發(fā)展成為糖尿病心肌病并導(dǎo)致心力衰竭。糖尿病心肌損傷的顯著特點(diǎn)是以舒張功能不全為首發(fā)表現(xiàn)，并逐漸引發(fā)收縮功能不全，最終發(fā)展為心力衰竭[1,2]。多個(gè)糖尿病模型動物已經(jīng)證實(shí)心肌組織肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)三磷酸腺苷（ATP）酶（SERCA2a）活性和表達(dá)下降是糖尿病心肌細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡的主要原因[3,4]，增加糖尿病心肌病大鼠模型中心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA2a的表達(dá)，可以大幅度改善大鼠的心功能[5]。最新研究顯示小泛素樣蛋白1（SUMO1）可以修飾SERCA2a，并增加其表達(dá)量、穩(wěn)定性和ATP酶活性[6]。

糖尿病引起心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA2a的活性和表達(dá)下降是糖尿病引起心肌細(xì)胞主動舒張功能下降以及降低心肌細(xì)胞功能儲備的重要原因，本研究試圖探索糖尿病是否可以作用于SERCA2a的小泛素樣修飾進(jìn)而影響SERCA2a的活性與表達(dá)。

1 材料及方法

實(shí)驗(yàn)動物：2012-12至2013-02選用北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的8周齡SD大鼠16只，初始體重160g～180g，大鼠在12～12小時(shí)光照周期，恒溫（22±2）℃，相對濕度30%～70%的無特定病原體（SPF）級屏障實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)操作均得到阜外心血管病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

2型糖尿病模型大鼠建立：本研究使用高脂高糖飼料加小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型[7]。簡言之：糖尿病組8只大鼠用高脂高糖飼料（10.0%熟豬油，20.0%蔗糖，10.0%蛋黃粉，0.5%膽酸鈉和59.5%的基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)大鼠4周后，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（30 mg/kg）后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)12周誘導(dǎo)2型糖尿?。粚φ战M8只大鼠普通飼料喂養(yǎng)，第4周以枸櫞酸鈉溶液作為對照腹腔注射后繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)12周。

大鼠心肌取材: 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.4 ml/100g）麻醉后，剪開大鼠胸腔，用50 ml注射器刺入左心耳，緩慢注入15～20 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）灌流心臟后，取下心臟置于位于冰上的含預(yù)冷的PBS 10 cm培養(yǎng)皿中，快速剪去多余組織并分離左右心室，將心肌組織分裝后置于-80℃冰箱中保存。

大鼠超聲心動圖檢查:大鼠麻醉后固定于恒溫檢查臺，以頭罩持續(xù)予以異氟烷吸入。選用胸骨旁左心室長軸、短軸切面和四腔心切面進(jìn)行檢查，并于短軸切面取M型超聲，四腔心切面行組織多普勒測定。所有切面均連續(xù)采集10s 的動態(tài)圖像，儲存圖像后使用圖像分析系統(tǒng)（Vevo770，加拿大）分析獲得心率(HR)、左心室收縮期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室舒張期內(nèi)徑(LVIDs)、縮短指數(shù)（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、舒張?jiān)缤砥诙獍戥h(huán)峰值速率比（E’/A’） 等指標(biāo)。

蛋白印跡法（Western-Blot）: 具體方法如之前研究所述[8]，取50～100 mg凍存的左心室前壁心肌組織提取組織蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，制備聚丙烯酰胺凝膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉；一抗結(jié)合，4℃過夜，洗膜；二抗結(jié)合，洗膜；底物顯色。采用凝膠成像儀(Alpha lnnotech，USA)采集圖像，并使用凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha Innotech，USA)進(jìn)行分析。

逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）: 具體方法如之前研究所述[9]，取50～100 mg凍存的左心室前壁心肌組織，用Trizol法提取總RNA，溶于適量無RNA酶水中。采用SuperScript RT-PCR試劑盒（Invitrogen, USA）逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR并使用分析軟件（Opticon Monitor 3，Bio-Rad）測定mRNA含量。

SERCA2a小泛素樣修飾水平測定：本研究通過兩種方法檢測SERCA2a小泛素修飾水平。①免疫共沉淀[10]：采用免疫共沉淀試劑盒（Thermo Scientific, USA）并按照其步驟進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，將SUMO1抗體固定于樹脂上，將提取好的蛋白溶液加入樹脂中進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)后，洗脫結(jié)合在樹脂上的SUMO1以及與之結(jié)合的蛋白，行Western-Blot檢測SERCA2a表達(dá)量即為SERCA2a-SUMO1量。②小泛素樣試劑盒檢測：采用Abcam公司的小泛素樣修飾試劑盒（Abcam, UK），將SERCA2a抗體以及陰性對照分別于96孔板不同的孔中4℃孵育過夜，蛋白樣本及陽性對照室溫孵育1小時(shí)后，加入SUMO檢測抗體以及染色液，于酶標(biāo)儀（Thermo Scientific, USA）中測定450 nm處吸光度，并通過陽性、陰性對照以及吸光度計(jì)算出結(jié)合SERCA2a的SUMO1量，最后使用通過WB測定的每組SERCA2a表達(dá)量矯正得到SERCA2a小泛素樣修飾程度。

2 結(jié)果

糖尿病模型建立：糖尿病組大鼠體重、空腹血糖、血C肽、HOMO-IR以及血脂水平均顯著高于對照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1），符合2型糖尿病特點(diǎn)。

表1 兩組大鼠體重、胰島素抵抗指數(shù)、血糖及血脂水平的變化

表1 兩組大鼠體重、胰島素抵抗指數(shù)、血糖及血脂水平的變化

注：與對照組比較*P＜0.05。HOMO-IR：HOMO胰島素抵抗指數(shù)FFA：游離脂肪酸 TG：甘油三酯 CHOL：膽固醇 LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇。HOMO-IR=（空腹血糖×空腹胰島素）/22.5（本研究使用空腹血C肽水平代替空腹胰島素水平）

對照組 (n=8) 糖尿病組 (n=8)體重 (g) 287.7±14.89 378.3±19.22*空腹血糖 (mmol/L) 5.65±0.62 12.87±4.22*C肽 (pmol/L) 108.99±72.00 987.45±362.63*HOMO-IR 32.78±14.49 578.82±210.24*FFA (mmol/L) 0.58±0.21 1.68±0.42*TG (mmol/L) 0.58±0.03 2.78±0.74*CHOL (mmol/L) 1.27±0.42 3.31±0.71*LDL-C (mmol/L) 0.41±0.06 0.89±0.79*

兩組大鼠心肌舒縮功能比較：與對照組比較，糖尿病組心肌收縮功能[等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(dp/dtmax)、射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短指數(shù)]和舒張功能[等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(-dp/dtmin) 和舒張?jiān)缤砥诙獍戥h(huán)峰值速率比]均下降，尤其以舒張功能下降更為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表2

表2 兩組大鼠超聲及血流動力學(xué)變化

表2 兩組大鼠超聲及血流動力學(xué)變化

注：與對照組比較*P＜0.05。 dp/dtmax：等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率 -dp/dtmin：等容舒張期左心室壓力下降的最大速率 EF：射血分?jǐn)?shù)FS：縮短指數(shù) E’/A’：舒張?jiān)缤砥诙獍戥h(huán)峰值速率比

對照組 (n=8) 糖尿病組 (n=8)心率 (bpm) 366.40±59.06 347.83±95.29 dp/dtmax(mmHg/s) 3861.94±1039.26 3476.00±1053.61*-dp/dtmin(mmHg/s) 3561.63±1070.65 2225.34±884.46*EF (%) 72.76±11.63 69.21±11.89*FS (%) 45.11±6.65 39.21±12.90*E’/A’ 1.31±0.31 0.77±0.23*

糖尿病大鼠心肌組織內(nèi)SERCA2a表達(dá)及其小泛素樣修飾水平：通過Western Blot和RT-PCR可發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，糖尿病組大鼠心肌組織內(nèi)SERCA2a的蛋白含量和基因表達(dá)均顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05,圖1）； 通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和小泛素樣修飾試劑盒檢測，結(jié)果均顯示相比于對照組大鼠，糖尿病組大鼠心肌組織內(nèi)SERCA2a的小泛素樣修飾程度顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05,圖2A、2B）。

圖1 蛋白印跡法和PCR分析糖尿病大鼠心肌SERCA2a蛋白及基因表達(dá)情況

圖2 免疫共沉淀分析及小泛素樣試劑盒檢測糖尿病大鼠心肌組織內(nèi)SERCA2a小泛素樣修飾水平

本研究繼續(xù)評估了糖尿病大鼠及對照組大鼠心肌組織內(nèi)小泛素樣修飾SUMO1、激活酶E1（SAE1和SAE2組成的二聚體）和結(jié)合酶E2（Ubc9）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示糖尿病大鼠心肌組織內(nèi)SUMO1及小泛素樣修飾激活酶E1表達(dá)未有明顯變化（圖3A、3B），而結(jié)合酶E2（Ubc9）在糖尿病大鼠心肌組織內(nèi)顯著下降（圖3C、3D）。

圖3 分析比較糖尿病和對照大鼠心肌組織小泛素樣修飾相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

3 討論

心肌細(xì)胞舒張期將Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)出胞質(zhì)這一過程中有70%的Ca2+是通過SERCA2a被轉(zhuǎn)運(yùn)至肌漿網(wǎng)。近年來，眾多研究也證實(shí)在增加心肌組織內(nèi)SERCA2a的表達(dá)可以改善心力衰竭動物模型心功能和存活率，改善糖尿病大鼠的心功能[5]。應(yīng)用于臨床的心力衰竭基因治療（通過冠狀動脈注射含人類SERCA2a基因的腺相關(guān)病毒）也已取得很好的治療效果[11]。可見SERCA2a在維持心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡和心肌細(xì)胞收縮舒張功能中起到了極為重要的作用。

小泛素樣蛋白屬于泛素超家族中的一員，小泛素樣修飾屬于蛋白質(zhì)翻譯后修飾，由激活酶E1將SUMO激活并傳遞給結(jié)合酶E2，最后在連接酶E3的催化下，SUMO被結(jié)合在目的蛋白上。目前研究顯示E1是SAE1（SUMO activating enzyme 1）和SAE2組成的異構(gòu)二聚體；E2是蛋白Ubc9；在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)E3對整個(gè)酶促反應(yīng)是非必需的[12]。小泛素樣修飾可以升高SERCA2a的表達(dá)量、穩(wěn)定性和ATP酶活性[6]；同增加SERCA2a本身的表達(dá)量的效果類似，增加心肌組織內(nèi)SERCA2a的小泛素樣修飾程度同樣可以改善心力衰竭動物模型的心功能[6]。

糖尿病可引起心肌組織內(nèi)SERCA2a的活性和表達(dá)下降，推測可能的原因可能有脂代謝異常，自由基損傷和ATP供應(yīng)減少，但這些機(jī)制不足以完全解釋SERCA2a下降的原因，故而本研究試圖評估糖尿病是否可以影響心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA2a小泛素樣修飾從而影響SERCA2a的表達(dá)及功能。本研究通過高脂飲食和小劑量STZ誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠心肌收縮和舒張功能均顯著降低，尤其以舒張功能下降更為明顯；糖尿病大鼠心肌組織內(nèi)SERCA2a的蛋白水平和基因表達(dá)水平均顯著下降，同時(shí)，糖尿病大鼠心肌組織內(nèi)SERCA2a的小泛素樣修飾程度較對照組大鼠顯著降低，提示小泛素樣修飾很有可能在糖尿病引起心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA2a表達(dá)下降這一病理生理過程中起到了重要作用。通過分析大鼠心肌組織內(nèi)SUMO1和小泛素樣修飾相關(guān)酶的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌組織內(nèi)SUMO1，小泛素樣修飾E1（SAE1和SAE2組成的二聚體）蛋白水平與對照組大鼠無顯著區(qū)別，而小泛素樣修飾E2（即Ubc9）的蛋白水平則顯著下降，與SERCA2a小泛素樣修飾程度變化保持一致。糖尿病對心肌組織內(nèi)Ubc9以及SERCA2a小泛素樣修飾的作用尚未見報(bào)道，本研究率先明確了在2型糖尿病大鼠心肌組織中存在Ubc9蛋白水平的下降，同時(shí)鑒于SUMO1蛋白和小泛素樣修飾蛋白E1的蛋白水平在兩組之間無明顯變化，故而可推斷糖尿病引起心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA2a小泛素樣修飾程度下降的原因可能是通過降低Ubc9的蛋白水平來實(shí)現(xiàn)的。

國外有研究報(bào)道在嚴(yán)重胰島素抵抗的2型糖尿病患者的骨骼肌中存在Ubc9下降[13]，這篇研究中同樣指出在糖尿病病程較短，胰島素抵抗程度較輕的2型糖尿病患者骨骼肌中，Ubc9的表達(dá)與正常對照志愿者相比無明顯差異；此外，雖然多個(gè)研究在不同角度上證實(shí)在糖尿病狀態(tài)下，心肌組織內(nèi)SERCA2a的蛋白含量和活性均下降[14-16]，然而新近由Fredersdorf等[17]學(xué)者報(bào)道的一篇研究卻顯示在早期的2型糖尿病大鼠心肌組織內(nèi)，SERCA2a的表達(dá)反而是上升的；該研究與既往研究和本研究最顯著的差別是該研究使用的是早期2型糖尿病大鼠，胰島素抵抗程度尚不顯著。另外一篇關(guān)于早期飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)顯著的胰島素抵抗的肥胖大鼠心肌組織內(nèi)SERCA2a的表達(dá)同樣明顯降低[18]。上述研究提示胰島素抵抗的出現(xiàn)和進(jìn)展是糖尿病患者以及糖尿病動物模型Ubc9和SERCA2a表達(dá)下降的關(guān)鍵因素?？紤]到SERCA2a被小泛素樣修飾后ATP酶活性增強(qiáng)需要消耗更多的能量[6]、2型糖尿病特點(diǎn)雖然是高血糖和高胰島素，然而由于胰島素抵抗，心肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝反而不足、以及心肌細(xì)胞增加葡萄糖代謝的比例可以增加舒張功能這些已知的病理生理特點(diǎn)；結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測，單純的高葡萄糖或高胰島素在增加心肌細(xì)胞內(nèi)能量代謝和葡萄糖代謝水平的同時(shí)，也可以增加Ubc9以及小泛素樣修飾水平，增加SERCA2a活性與功能，改善心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，但長期的高葡萄糖和高胰島素可能會“透支”心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA2a以及小泛素樣修飾的“潛能”，以及在胰島素抵抗的作用下，心肌細(xì)胞葡萄糖代謝進(jìn)一步下降，最終導(dǎo)致SERCA2a小泛素樣修飾程度的下降，參與形成糖尿病心肌病的舒張功能不全。

本研究率先通過整體水平的研究，提出新近發(fā)現(xiàn)的SERCA2a調(diào)節(jié)機(jī)制——小泛素樣修飾，可能是糖尿病心肌病引起心肌細(xì)胞舒張功能不全的內(nèi)在機(jī)制，并予以初步證實(shí)，可以為糖尿病心肌病和糖尿病心肌損傷的研究和臨床防治提供新的方向和思路。

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Diabetes Reducing the Intensity of Sarcoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase-SUMOylation of Myocardium in Experimental Rats

YAO Jing, SHAO Xing-hui, SONG Guang-yuan, ZHAO Zhen-yan, GAO Hai-yang, WU De-wei, TENG Si-yong, WU Yong-jian.
Department of Cardiology, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

WU Yong-jian, Email: fuwaihospital@gmail.com

Objective: To investigate the effect of diabetes on the intensity of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA2a)-SUMOylation and SERCA2a activity of myocardium in experimental rats.Methods: The 8 weeks old SD rats were divided into 2 groups, Diabetic group, with diet-induced type 2 diabetic rats and Control group, with normal rats. The systolic and diastolic cardiac functions were evaluated by echocardiography and left ventricular pressure measurement. The intensity of SERCA2a-SUMOylation was examined by co-immunoprecipitation and SUMOylation kit.Results: Compared with Control group, Diabetic group had decreased systolic and diastolic cardiac functions, especially for diastolic function; decreased SERCA2a protein expression and intensity of SUMOylation; decreased SUMOylation E2 (Ubc9 ) protein expression. The protein levels of SUMO1, SAE1 and SAE2 were similar between 2 groups.Conclusion: The intensity of SERCA2a-SUMOylation and Ubc9 decreased in diabetic myocardium which implies that SERCA2a-SUMOylation and Ubc9 were closely related to the damage of diabetic myocardium in experimental rats.

Diabetes; Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase; SUMOylation

2014-05-10）

（編輯：汪碧蓉）

教育部博士點(diǎn)基金（NO：20121106110010），協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（NO:2012-1002-30）資助

100037 北京市，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心內(nèi)科

姚晶 博士研究生 主要從事糖尿病與冠心病研究 Email: desc1986@gmail.com 通訊作者:吳永健 Email: fuwaihospital@gmail.com

R54

A

1000-3614( 2014 ) 11-0932-05

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.11.020

方法：采用小動物超聲和左心室壓力測定評價(jià)2型糖尿病大鼠（糖尿病組）和對照大鼠（對照組）心肌收縮和舒張功能；比較糖尿病組大鼠和對照組大鼠心肌組織內(nèi)SERCA2a的表達(dá)情況，用免疫共沉淀方法以及小泛素樣修飾試劑盒比較糖尿病組大鼠和對照組大鼠心肌組織內(nèi)SERCA2a小泛素樣修飾程度。

結(jié)果：和對照組大鼠比較：糖尿病組大鼠心肌收縮、舒張功能均下降，尤以舒張功能下降更為明顯；糖尿病組大鼠心肌組織內(nèi)SERCA2a蛋白水平、基因表達(dá)和小泛素樣修飾程度均下降；小泛素樣修飾E2（Ubc9）的蛋白水平在糖尿病大鼠心肌中也下降，而小泛素樣蛋白1（SUMO1）和小泛素樣修飾E1（SAE1和SAE2組成的二聚體）蛋白水平無明顯變化。

結(jié)論：SERCA2a小泛素樣修飾程度和Ubc9蛋白水平在糖尿病心肌組織中下降，提示SERCA2a小泛素樣修飾和Ubc9與糖尿病的心肌損傷密切相關(guān)。