肖桂清，楊會勇，刁勇

（華僑大學 分子藥物研究院，福建 泉州362021）

重組腺相關(guān)病毒（r AAV）載體是基因治療領(lǐng)域最具前景的載體之一，世界范圍內(nèi)已有100余項r AAV基因藥物已完成或正在進行臨床研究，且治療效果顯著，如治療Leber′s先天性黑內(nèi)障［1-3］，以及治療脂蛋白脂酶缺乏癥.除產(chǎn)業(yè)化制備工藝外，r AAV基因藥物的質(zhì)量控制技術(shù)，也是制約其臨床應(yīng)用的因素之一，特別是在缺少準確、可靠的測定r AAV滴度的標準方法［4-7］.當前，r AAV滴度測定所采用的方法按原理的不同可分為生物測定和物理測定兩大類.其中生物測定法包括感染滴度法和轉(zhuǎn)導滴度法，物理測定法包括病毒顆粒滴度法和基因組滴度法.因r AAV基因組滴度（GC）理論上與其顆粒滴度（P）和轉(zhuǎn)導滴度（TU）成線性關(guān)系，且測定簡便，所以成為最常用的滴度指標［8］.qPCR是常用的r AAV基因組滴度測定法［9］，但傳統(tǒng)的qPCR法存在適用范圍窄［10］、易產(chǎn)生系統(tǒng)性誤差［11］和受雜質(zhì)干擾［12］等問題.基于此，本文對qPCR技術(shù)在r AAV的GC測定中的最新應(yīng)用成果進行綜述，并對qPCR在r AAV的GC測定中存在的問題及解決策略進行分析.

1 ITR-qPCR法的普適性

傳統(tǒng)qPCR法測定r AAV的GC時，其靶標序列主要是轉(zhuǎn)基因序列或調(diào)控元件序列［13］.因此，每種r AAV載體均需要根據(jù)自身轉(zhuǎn)基因表達體系而設(shè)計引物或探針，qPCR的反應(yīng)條件也不盡一致，難以GC為質(zhì)控指標進行橫向比較.即使對于同一種r AAV載體，不同實驗室所采用的靶標序列及反應(yīng)條件也存在很大差異.如果能設(shè)計出一種不依賴于轉(zhuǎn)基因表達體系，對于各種r AAV可以普遍適用的GC定量方法，以及對于r AAV載體的質(zhì)量控制都顯得意義重大.

圖1 線型單鏈r AAV載體基因組結(jié)構(gòu)圖［10］Fig.1 Schematic drawing of linear and single-stranded r AAV vector genomes［10］

腺相關(guān)病毒（AAV）為單鏈線狀DNA病毒，其基因組僅編碼病毒復制與包裝所必需的Rep和Cap基因.AAV基因組兩端的反向末端重復序列（ITR）是包裝AAV所必需的最少的自身序列［14-16］.每個ITR含有145個核苷酸，前125個核苷酸會形成回文序列，折疊成“T”形二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖1）.ITR在AAV復制起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，是AAV基因組自我復制的引物［16］，也是形成環(huán)狀AAV中間體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)［17］.ITR是各種r AAV載體基因組所保留的AAV源序列，也是唯一的共同序列.因此，將ITR序列作為qPCR的檢測靶標，正好能滿足普適性質(zhì)量控制指標的設(shè)計理念.

Aurnhammer等［10］首次以r AAV中的ITR序列為靶標，探索了通用性ITR-qPCR方法的可行性.AAV2 ITR序列（圖2）的5′端含有兩個臂回文結(jié)構(gòu)（B-B′和 C-C′）和一個莖回文結(jié)構(gòu)（A-A′），3′末端是單鏈形式的 D序列位.ITR-qPCR法所設(shè)計的引物和探針，其特異性靶向AAV 5′-ITR序列的一個 DNA 序列（62nt）：反向引物（16nt）從 C′向 A′方向擴增，正向引物（21nt）由D向 A′方向擴增，探針（21nt）位于ITR正反引物間.通過定性PCR證明所設(shè)計的引物能夠擴增出62 bp的PCR產(chǎn)物，且退火溫度在55～64.2℃之間，擴增特異性良好.

ITR-qPCR法具有以下幾個優(yōu)點：適用范圍廣，普遍適用于定量檢測絕大多數(shù)r AAV載體顆粒中的單鏈DNA（ssDNA）和載體質(zhì)粒的雙鏈DNA（dsDNA）；靈敏度高，檢測閾值約為50個質(zhì)?？截悢?shù)，即200個AAV ITR靶向位點；重復性好，批間及批內(nèi)誤差均低于目前被廣泛認可的臨床試驗閾值15%，能滿足臨床實驗室所制定的最嚴格的質(zhì)量標準［18-20］.蒙青林等［21］同樣用靶向ITR序列的qPCR法檢測r AAV2的GC，并與ELISA法測定的r AAV病毒滴度和轉(zhuǎn)導法測定的r AAV轉(zhuǎn)導滴度進行比較，結(jié)果P／GC為59.6，GC／TU 為91.2，與 M.Lock等［22］報道的 AAV2標準品（AAV2 RSM）所測結(jié)果相近（P／GC＝28，GC／TU＝64.4）.ITR-qPCR法所具有的普適性，使其在r AAV滴度測定中具有更廣泛的應(yīng)用價值，且有助于推動AAV滴度檢測的標準化.但該法也存在不足：r AAV廣泛存在的ITR發(fā)夾結(jié)構(gòu)會影響qPCR過程中的變性與退火等過程，特別是對自身互補型r AAV（scr AAV）影響更顯著.

圖2 r AAV2 ITR-qPCR法特異性引物和探針的設(shè)計［10］Fig.2 Design of r AAV2 ITR-qPCR primers and probe［10］

2 測定scr AAV基因組滴度時的系統(tǒng)誤差

scr AAV由于其轉(zhuǎn)染效率高于單鏈r AAV（ssr AAV），越來越受到科研工作者的親睞.在Hela細胞中，scr AAV的轉(zhuǎn)染效率是相應(yīng)ssr AAV的5～140倍，對于ssr AAV難轉(zhuǎn)導的細胞，如B16F10，NIH3T3和3LL細胞，scr AAV都能有效轉(zhuǎn)染［23］.不同于ssr AAV的DNA單鏈結(jié)構(gòu)，scr AAV載體的末端之一為突變的ITRΔtrs［24］，在包裝時不能被切割而形成自身互補的DNA雙鏈結(jié)構(gòu) （圖3）.在變性過程，scr AAV基因組形成單鏈結(jié)構(gòu).但在退火過程中，由于scr AAV基因組中ITRΔtrs的存在，可以迅速形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，促進與其相連的互補DNA鏈的退火（圖4a）.因此，引物與模板基因組結(jié)合的幾率則大大降低，導致所測GC低于DNA dot blotting等測得的GC值達10倍之高［11］.

圖3 自身互補型r AAV載體結(jié)構(gòu)及其引物位置設(shè)計示意圖［11］Fig.3 Diagram of the self-complementary r AAV vector genome with primer sites indicated［11］

Fagone等［11］研究了如何降低qPCR法的系統(tǒng)誤差，發(fā)現(xiàn)特異性引物的作用位置對qPCR法所測結(jié)果影響很大.目的擴增產(chǎn)物距離ITRΔtrs發(fā)夾結(jié)構(gòu)越遠，系統(tǒng)誤差越小，如圖3中引物set3距ITRΔtrs1 204 bp，所引起系統(tǒng)誤差顯著小于set 1與set 2.因此，排除scr AAV的ITRΔtrs發(fā)夾結(jié)構(gòu)對與其相鄰擴增子的干擾，是成功降低qPCR法系統(tǒng)誤差的關(guān)鍵.

圖4 scr AAV雙鏈病毒基因組酶切的qPCR流程示意圖Fig.4 Scheme of qPCR of scr AAV vector genome digested with endonuclease

Fagone等［11］對傳統(tǒng)qPCR法進行了改良，用限制性核酸內(nèi)切酶去除ITRΔtrs發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到核酸內(nèi)切酶qPCR法（ED-qPCR）.ED-qPCR的變性過程使互補結(jié)合的雙鏈結(jié)構(gòu)解鏈成兩條單鏈，在退火時引物與模板基因組的結(jié)合排除了ITRΔtrs的影響，可以進行正常的擴增（圖4b），從而成功解決了qPCR法測定scr AAV的系統(tǒng)誤差問題.

3 r AAV感染滴度的測定

GC并不能反映r AAV的功能，感染滴度和轉(zhuǎn)導滴度（TU）才是最好的功能指標.研究發(fā)現(xiàn)，r AAV的GC與病毒感染滴度的比值變動范圍很寬，可達56～1 000［25-27］.所以GC的數(shù)值尚不能表征r AAV的功能，而r AAV感染滴度所反映的是r AAV感染細胞及其在細胞內(nèi)的復制效率，是評價其細胞內(nèi)功能的重要指標，只有成功感染后才可能表達轉(zhuǎn)基因.因此，r AAV感染滴度的測定對于r AAV的臨床前及臨床研究很重要.

Clark等［28］首次利用qPCR法定量r AAV的GC和感染滴度，所得二者比值為60～120.Zhen等［29］改進了以上方法，將野生型腺病毒與r AAV共同感染可表達AAV2 Rep／Cap基因的D7-4細胞系，以促進r AAV基因組的復制；共感染48 h后，采用qPCR法測定r AAV基因組拷貝數(shù)，最后經(jīng)寇式方程計算感染滴度.因在每一個成功感染r AAV的細胞內(nèi)r AAV基因組均得以大量復制，大大提高qPCR測定靈敏度，可實現(xiàn)單個病毒感染事件的檢測.用該法測定6種含不同轉(zhuǎn)基因的AAV-2載體，GC與感染滴度比值為4～19，均低于先前文獻的報道.與之前的方法相比，該法更能準確地反映r AAV感染滴度的真實性.

改良后的qPCR法不僅適用于已純化的r AAV樣品，對于未純化的r AAV樣品同樣適用.未純化的r AAV樣品經(jīng)高度稀釋可降低未知成分的干擾，采用DnaseⅠ可降解未包裝的DNA，NaOH可去除非特異性RNA，從而可成功消除影響qPCR法準確測定的雜質(zhì)干擾［12］.該法適用于多種AAV-2載體感染滴度的測定，而對于不同表型的r AAV，只需對其靶細胞類型和感染條件進行重新調(diào)整.但該法也存在不足，因為r AAV載體在濃縮的時候易發(fā)生不同程度的聚集，會干擾該法的測定；Zhen等［29］發(fā)現(xiàn)發(fā)生聚集的r AAV載體的GC與感染滴度比值高于未發(fā)生聚集的AAV載體達12.8倍，這可能是由于聚集的r AAV失去感染活性所致.

4 r AAV中rcAAV污染率的檢測

在r AAV載體的生產(chǎn)過程中，表達衣殼蛋白的輔助質(zhì)粒或宿主細胞DNA會被誤包裝或重組，成為可復制型AAV（rc AAV）或復制缺陷型AAV，其中rc AAV轉(zhuǎn)導細胞后表達的衣殼蛋白被認為是引起細胞免疫毒性的原因之一.采用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的r AAV，rc AAV污染率可高達10%［30］，即使采用優(yōu)化工藝，rc AAV污染率也可達0.4%～1.0%.因此，r AAV中rc AAV污染率的測定非常必要.

由于r AAV制品中rc AAV的危害不小，但量相對較低，因此必須設(shè)計出高度靈敏的方法才能對其進行檢測和定量分析.Mayfield等［31］設(shè)計出一種通過靶向3′末端的AAV-2 ITR D序列和5′末端的AAV-2 rep序列的高度靈敏的qPCR法，用于檢測和定量分析r AAV中rc AAV的污染率，該法可以定量的最低限度（LOQ）為1×109vg（載體基因組）r AAV制品中所含的0.256 fg線性質(zhì)粒DNA或拷貝數(shù)為56的rc AAV，從而成功解決r AAV中rc AAV污染率檢測的難題.

5 展望

r AAV基因藥物的臨床研究已充分證實其有效性和安全性，但其質(zhì)量控制體系的建立卻滯后于臨床應(yīng)用.r AAV基因藥物的準確定量，是臨床用藥規(guī)范化的前提，也是不同工藝或不同廠家生產(chǎn)產(chǎn)品橫向比較的依據(jù)［32］.qPCR技術(shù)操作簡單，無需復雜的產(chǎn)物處理過程，整個測定過程只需2～3 h，且靈敏度高，測定GC的最低檢測限為100 vg［28］；批間及批內(nèi)誤差均低于目前被廣泛認可的臨床試驗閾值15%［18-20］.

ITR-qPCR具有普適性，可定量檢測絕大多數(shù)r AAV載體，使r AAV滴度檢測更加標準化；ED-qPCR則成功解決了qPCR定量scr AAV滴度所引起的系統(tǒng)性誤差問題，彌補了長期以來人們對qPCR檢測scr AAV滴度認識的不足；檢測r AAV感染滴度的qPCR法靈敏度的提高，可測到比以往更高的病毒感染滴度，使應(yīng)用于臨床研究的r AAV功能指標更加可靠；rc AAV污染率的qPCR法準確測定，為合格的r AAV進入臨床進行嚴格把關(guān).qPCR技術(shù)所具備的優(yōu)勢已充分展現(xiàn)了其未來廣闊的應(yīng)用前景，為此，負責制定高質(zhì)量r AAV參比標準的腺相關(guān)病毒參比標準事務(wù)委員會推薦qPCR作為定量r AAV滴度的方法［33］.隨著qPCR技術(shù)不斷改進和發(fā)展，其作為r AAV質(zhì)量控制標準的方法廣受推廣，極大促進了r AAV基因藥物的臨床應(yīng)用進程.

［1］ BAINBRIDGE J W B，SMITH A J，BARKER S S，et al.Effect of gene therapy on visual function in Leber′s congenital amaurosis［J］.N Engl J Med，2008，358（21）：2240-2248.

［2］ MAGUIRE A M，HIGH K A，AURICCHIO A，et al.Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber′s congenital amaurosis：A phase1 dose-escalation trial［J］.Lancet，2009，374（9701）：1597-1605.

［3］ MAGUIRE A M，SIMONELLI F，PIERCE E A，et al.Safety and efficacy of gene transfer for Leber′s congenital amaurosis［J］.N Engl J Med，2008，358（21）：2240-2248.

［4］ VELDWIJK M R，SCHIEDLMEIER B，KLEINSCHMIDT J A，et al.Superior gene transfer into solid tumour cells than into human mobilised peripheral blood progenitor cells using helper virus-free adeno-associated viral vector stocks［J］.Eur J Cancer，1999，35（7）：1136-1142.

［5］ GRIMM D，KERN A，PAWLITA M，et al.Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA：Packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2［J］.Gene Therapy，1999，6（7）：1322-1330.

［6］ SUMMERFORD C，SAMULSKI，R J.Viral receptors and vector purification：New approaches for generating clinical-grade reagents［J］.Nat Med，1999，5：587-588.

［7］ SALVETTI A，ORèVE S，CHADEUF G，et al.Factors influencing recombinant adeno-associated virus production［J］.Hum Gene Ther，1998，9（5）：695-706.

［8］ 刁勇，馬健，李欣燕，等.表達血管抑制因子的腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其體內(nèi)外活性［J］.生物工程學報，2008，24（11）：1949-1954.

［9］ VELDVIJK M R，TOPALY J，LAUFS S，et al.Development and optimization of a real-time quantitative PCR-based method for the titration of AAV-2vector stocks［J］.Mol Ther，2002，6（2）：272-278.

［10］ AURNHAMMER C，HAASE M，MUETHER N，et al.Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences［J］.Hum Gene Ther Methods，2012，23（1）：18-28.

［11］ FAGONE P，WRIGHT J F，NATHWANI，et al.Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods［J］.Hum Gene Ther Methods，2011，23（1）：1-7.

［12］ MAYGINNES J P，REED S E，BERG H G，et al.Quantitation of encapsidated recombinant adeno-associated virus DNA in crude cell lysates and tissue culture medium by quantitative，real-time PCR［J］.Journal of Virological Methods，2006，137（2）：193-204.

［13］ ROHR U P，WULF M A，STAHN S，et al.Fast and reliable titration of recombinant adeno-associated virus type-2 using quantitative real-time PCR［J］.Journal of Virological Methods，2002，106（1）：81-88.

［14］ YAN Z，ZAK R，ZHANG Y，et al.Inverted terminal repeat sequences are important for intermolecular recombination and circularization of adeno-associated virus genomes［J］.J Virol，2005，79（1）：364-379.

［15］ MCALISTER V J，OWENS R A，VICTOR J.Preferential integration of adeno-associated virus type 2 into a polypyrim-idine／polypurine-rich region within AAVS1［J］.J Virol，2007，81（18）：9718-9726.

［16］ DAYA S，BERNS K I.Gene therapy using adeno-associated virus vectors［J］.Clinical microbiology reviews，2008，21（4）：583-593.

［17］ MUSATOV S，ROBERTS J，PFAFF D，et al.A cis-acting element that directs circular adeno-associated virus replication and packaging［J］.Journal of Virology，2002，76（24）：12792-12802.

［18］ BARNETT D，GRANGER V，KRAAM J，et al.Reduction of intra-and interlaboratory variation in CD34＋stem cell enumeration using stable test material，standard protocols and targeted training［J］.Br J Haematol，2000，108（4）：784-792.

［19］ CHEN J C，BIGELOW N，DAVIS B H.Proposed flow cytometric reference method for the determination of erythroid F-cell counts［J］.Cytometry，2000，42（4）：239-246.

［20］ RUMKE C L.The statistically expected variability in differential leukocyte counting［M］.KOEPKE J A.Differential Leukocyte Counting.Illinois：College of American Pathologists，1977：39-45.

［21］ 蒙青林，張彬彬，張春.測定重組腺相關(guān)病毒基因組滴度的qPCR新方法［J］.生物工程學報，2013，29（2）：235-242.

［22］ LOCK M，MCGORRAY S，AURICCHIO A，et al.Characterization of a recombinant adeno-associated virus type 2 reference standard material［J］.Hum Gene Ther，2010，21（10）：1273-1285.

［23］ WANG Z，MA H I，LI J，et al.Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo［J］.Gene Ther，2003，10（26）：2105-2211.

［24］ MCCARTY D M，F(xiàn)U H，MONAHAN P E，et al.Adenoassociated virus terminal repeat（TR）mutant generates self complementary vectors to overcome the rate-limiting step to transduction in vivo［J］.Gene Ther，2003，10（26）：2112-2118.

［25］ FLOTTE T R，SOLOW R，OWENS R A，et al.Gene expression from adeno-associated virus vectors in airway epithelial cells［J］.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology，1992，7（3）：349-356.

［26］ RUFFING M，ZENTGRAF H，KLEINSCHMIDT J A.Assembly of viruslike particles by recombinant structural proteins of adeno-associated virus type 2 in insect cells［J］.J Virol，1992，66（12）：6922-6930.

［27］ ZOLOTUKHIN S，BYRNE B J，MASON E，et al.Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield［J］.Gene Ther，1999，6（6）：973-985.

［28］ CLARK K R，LIU X，MCGRATH J P，et al.Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild type viruses［J］.Hum Gene Ther，1999，10（6）：1031-1039.

［29］ ZHEN Z，ESPINOZA Y，BLEU T，et al.Infectious titer assay for adeno-associated virus vectors with sensitivity sufficient to detect single infectious events［J］.Hum Gene Ther，2004，15（7）：709-715.

［30］ WRIGHT J F.Transient transfection methods for clinical adeno-associated viral vector production［J］.Hum Gene Ther，2009，20（7）：698-706.

［31］ MAYFIELD T L，KORYTOV I，F(xiàn)RANCIS J D，et al.Detection and quantification of rc AAV in r AAV stocks by real-time qPCR［J］.Molecular Therapy，2006，13：S196-S197.

［32］ MOULLIER P，SNYDER R O.International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards［J］.Molecular therapy：The Journal of the American Society of Gene Therapy，2008，16（7）：1185-1188.

［33］ SNYDER R O，F(xiàn)LOTTE T R.Production of clinical-grade recombinant adeno-associated virus vectors［J］.Current opinion in biotechnology，2002，13（5）：418-423.