杜曉紅，佟 倜，景士偉，武文斌，孫迎春

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭014010；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院胸外科，吉林 長(zhǎng)春130041；3.東北師范大學(xué)物理學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130024）

中子屬于高線性能量傳遞（Linear Energy Transfer，LET）射線，直接破壞細(xì)胞內(nèi)DNA 分子，同時(shí)還破壞細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)，細(xì)胞難于修復(fù)，它對(duì)細(xì)胞殺傷主要是單擊致死性損傷.快中子對(duì)抵抗普通放療的乏氧腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用；其次，快中子相對(duì)生物效應(yīng)比普通X 線作用大3倍，而且對(duì)處于分裂周期不同時(shí)相的細(xì)胞均敏感.超熱中子能量為1eV～10keV，多應(yīng)用于硼中子俘獲治療（BNCT），熱中子能量低于1eV，可用于皮膚黑色素瘤等淺部腫瘤治療.文獻(xiàn)報(bào)道了大量有關(guān)中子輻射生物效應(yīng)及治療腫瘤研究［1－6］.現(xiàn)以我中心自制中子源裝置，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)初步檢測(cè)快中子對(duì)EC9706的生物效應(yīng)，為快中子在治療中的應(yīng)用及安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 腫瘤細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)分組

將凍存于液氮中的人源性食管癌細(xì)胞株EC97069（購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)）取出后常規(guī)方法復(fù)蘇，培養(yǎng)于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，在體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng).用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，離心收集后用無菌PBS緩沖液（pH＝7.4）洗滌2次，鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)／mL，以每孔2.5和0.2mL 分別接種于96孔和6孔培養(yǎng)板中，96孔板的最外環(huán)的孔內(nèi)分別加入0.2mL PBS緩沖液，以減少細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)的邊緣效應(yīng).96孔板細(xì)胞用于MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性，分為6組（1個(gè)培養(yǎng)板設(shè)為1組，每組60個(gè)復(fù)孔）.6孔板細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死，分為5組（1個(gè)培養(yǎng)板設(shè)為1組，每組6個(gè)復(fù)孔）.待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行快中子照射，照射之后置于37℃恒溫、5%CO2孵箱中，繼續(xù)孵育24h后用于檢測(cè).

1.2 快中子產(chǎn)生與照射場(chǎng)地

采用中子管為快中子發(fā)射源（東北師范大學(xué)物理學(xué)院自制）.其中子產(chǎn)額為1×108個(gè)／s，中子能量為14 MeV.照射場(chǎng)地在距地面5m 深的具有回廊結(jié)構(gòu)的地下中子實(shí)驗(yàn)廳內(nèi)進(jìn)行（通過國(guó)家輻射實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)）.被照射樣品置于照射場(chǎng)地后，實(shí)驗(yàn)人員在地上操控室里調(diào)節(jié)中子發(fā)生控制電路、中子檢測(cè)儀和γ射線監(jiān)測(cè)儀，控制電路可調(diào)節(jié)輻照時(shí)間和中子產(chǎn)額，中子監(jiān)測(cè)儀和γ射線監(jiān)測(cè)儀可監(jiān)測(cè)每一瞬時(shí)中子劑量和γ射線劑量，所有數(shù)據(jù)通過MCA 收集并存入電腦.照射時(shí)將培養(yǎng)板置于中子管發(fā)射端口正下方約2cm 處，同時(shí)在發(fā)生器周圍旋轉(zhuǎn)中子監(jiān)測(cè)儀和γ射線監(jiān)測(cè)儀用于監(jiān)測(cè)輻照的中子劑量及產(chǎn)生的γ射線劑量.

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性

從培養(yǎng)箱中取出照射24h 后的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入20μL／孔MTT 溶液（質(zhì)量濃度為5mg／mL），培養(yǎng)箱中再孵育4h后終止，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，再加入150μL／孔DMSO，待紫色結(jié)晶物完全溶解后，應(yīng)用酶標(biāo)儀在490nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度（即OD 值）.細(xì)胞增殖抑制率＝（1－校正后實(shí)驗(yàn)組OD 均值／校正后對(duì)照組OD 均值）×100%.

1.4 Hoechst33342／PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取出中子輻照后繼續(xù)孵育24h的6孔板細(xì)胞，室溫下用0.25%胰蛋白酶消化，收集各組細(xì)胞于EP管中，再置于冰塊操作平臺(tái)（保持4℃左右），以Hoechst33342與PI染色，避光放置15min，染色后1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)其凋亡率與壞死率.Hoechst 33342 的激發(fā)波長(zhǎng)為352nm，發(fā)射波長(zhǎng)為400～500nm，產(chǎn)生藍(lán)色熒光；PI的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用（ˉx±s）表示，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率、壞死率進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）.P＜0.05表示差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 快中子對(duì)細(xì)胞的抑制呈劑量依賴性

以96孔板最外圍孔OD值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正后計(jì)算細(xì)胞抑制率.MTT方法檢測(cè)結(jié)果顯示，快中子照射實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)呈抑制效應(yīng)，細(xì)胞存活量減少，OD 值下降（見表1）.與對(duì)照組比較，照射的各實(shí)驗(yàn)組（3min（0.02Gy）～15 min（0.1Gy））細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴趨勢(shì).15 min照射組細(xì)胞抑制率為67.4%.

表1 快中子作用后各組細(xì)胞OD值（ˉx±s）

2.2 腫瘤細(xì)胞的壞死呈劑量依賴性

Hoechst33342／PI熒光雙染的各組細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)計(jì)數(shù)，P3區(qū)間為凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，P4區(qū)間為壞死細(xì)胞計(jì)數(shù)（見圖1）.結(jié)果表明：細(xì)胞凋亡率比較（各治療組與對(duì)照組比較），P＜0.01；治療組間比較，細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；細(xì)胞壞死率比較（治療組與對(duì)照組比較），P＜0.05；15min（0.1Gy），30min（0.2Gy），45 min（0.3 Gy）組間比較，P＞0.05；15 min（0.1 Gy），30 min（0.2 Gy），45 min（0.3Gy）組分別與60min（0.4Gy）組比較，P＜0.01，認(rèn)為60min組較其他組的細(xì)胞壞死率顯著增加.結(jié)果提示與對(duì)照組比較，快中子照射后細(xì)胞壞死率增加，并且呈劑量依賴趨勢(shì)（見表2）.

圖1 不同劑量快中子作用后EC9706流式檢測(cè)直方圖

表2 快中子作用后各組EC9706細(xì)胞壞死率與凋亡率（ˉx±s）

3 討論

MTT 法與流式細(xì)胞儀檢測(cè)，證實(shí)中子束對(duì)人源性食管癌細(xì)胞EC9706呈增殖抑制作用，在一定的時(shí)間－劑量范圍內(nèi)呈正相關(guān).表現(xiàn)為照射時(shí)間－劑量增加，腫瘤細(xì)胞凋亡與壞死比例增加，其中以壞死為主，不同劑量組之間細(xì)胞壞死率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

中子射線屬于高直線能量轉(zhuǎn)換（Linear energy transfer，LET）射線，具有獨(dú)特的放射生物學(xué)特性，如較高的相對(duì)生物效應(yīng)、對(duì)細(xì)胞周期依賴性小、氧增強(qiáng)比值低、癌細(xì)胞受照射后潛在致死性損傷和亞致死性損傷難以修復(fù)等.中子殺傷腫瘤的機(jī)理可能也是主要通過凋亡途徑來實(shí)現(xiàn)的.由于中子損傷效應(yīng)主要由錯(cuò)誤修復(fù)和難以修復(fù)的簇集損傷造成［7］，細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)速率減慢，更多的DNA 損傷被固定，以致細(xì)胞存活率下降.本文研究證實(shí)快中子對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC9706存在體外呈劑量依賴的抑制作用，并且作用機(jī)制以致細(xì)胞壞死為主，為快中子體內(nèi)效應(yīng)研究及臨床應(yīng)用等提供了一定的理論依據(jù).

［1］段志凱，郭萬龍，劉建功.中子輻射生物效應(yīng)研究進(jìn)展［J］.輻射防護(hù)通訊，2008，28（5）：19－22.

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