劉如俊，趙文志，張 路，王國(guó)強(qiáng)

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 研究生院，遼寧 大連116044;2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 創(chuàng)傷骨一科，遼寧 大連116027)

全球糖尿病發(fā)病率日益增高，給人類(lèi)的公共健康帶來(lái)了巨大威脅。在發(fā)展中國(guó)家，足潰瘍和截肢較為嚴(yán)重，且常合并為廣泛的感染。如何治療糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)，引起廣泛的關(guān)注，而對(duì)糖尿病足潰瘍治療的過(guò)程中，難點(diǎn)和焦點(diǎn)就集中在DFU 創(chuàng)面愈合差、創(chuàng)面愈合延遲，甚至久治不愈等。目前，關(guān)于糖尿病足部潰瘍難愈合的機(jī)制尚不清楚，己知與創(chuàng)面細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、血管因素等有關(guān)。EGF 可以誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞和纖維母細(xì)胞增生、使角質(zhì)層增厚、刺激周?chē)窠?jīng)再生［1-3］。有研究表明表皮生長(zhǎng)因子及其受體相對(duì)或絕對(duì)減少是糖尿病足潰瘍難愈合的重要原因之一。本研究通過(guò)潰瘍面局部應(yīng)用表皮生長(zhǎng)因子干預(yù)，觀察其對(duì)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)試劑:四氧嘧啶(美國(guó)Sigma 公司);高脂飼料(大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心);RNAprep Pure Tissue Kit DP431(北京TIANGEN)。

儀器:Nano Drop ND -1000 紫外分光光度儀(美國(guó)Nano Drop 公司，TaKaRa 公司提供);凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP BioSpectrum);變性梯度凝膠電泳儀(美國(guó) 伯樂(lè));光學(xué)顯微鏡;投射電子顯微鏡(JEM-2000EX日本電子公司);核酸定量分析儀(Thermo);梯度PCR 儀(Thermo);全自動(dòng)高速離心機(jī)(Thermo)。

實(shí)驗(yàn)對(duì)象:大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供健康新西蘭大白兔70 只(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK［遼］2008 -0002)，被選的實(shí)驗(yàn)兔體重大約在2.5 ～3.0 kg，新西蘭實(shí)驗(yàn)兔的性別不受限制。

1.2 建立Ⅱ型糖尿病模型

高脂高糖飼料喂養(yǎng)新西蘭兔2 個(gè)月，分別于(第1 天、第4 天、第7 天)禁食6 h 后采用耳緣靜脈注射由無(wú)菌生理鹽水配制的2.5%四氧嘧啶50 mg/kg，共3 次，第10 天測(cè)空腹血糖＞11.1 mmol/L 入選模型，共有32 只實(shí)驗(yàn)兔符合實(shí)驗(yàn)的納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 分組及潰瘍創(chuàng)面治療的實(shí)施

入選模型的32 只新西蘭兔隨機(jī)分成2 組，每組16 只實(shí)驗(yàn)用新西蘭兔。在兔子大腿部造創(chuàng)，其標(biāo)準(zhǔn)為:實(shí)驗(yàn)用兔足背部切除10 mm×7 mm 矩形區(qū)域全層皮膚，一組局部創(chuàng)口連續(xù)涂抹表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，用量從始至終為1 mL，每天1 次，作為A組;另一組為不施加干預(yù)的B 組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中條件均衡、固定。

1.4 大體觀察

健康新西蘭大白兔糖尿病足潰瘍?cè)炷：蟮? 和第15 天，各新西蘭大白兔糖尿病足潰瘍面用數(shù)碼相機(jī)拍照。圖像經(jīng)圖像處理軟件PS 處理后分析計(jì)算出未愈合面積，依如下公式計(jì)算出創(chuàng)面愈合率:糖尿病足潰瘍面愈合率=［(原創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原創(chuàng)面面積)］。

1.5 Masson 染色觀察

大致過(guò)程如下:先用10%的甲醛溶液固定標(biāo)本，標(biāo)本脫水后包埋，石蠟切片脫蠟，足量的自來(lái)水沖洗，蒸餾水反復(fù)沖洗5 次，Weigert 蘇木精液染核，10 min 后將標(biāo)本水洗。水洗后用Masson 麗村紅酸性復(fù)紅液浸泡8 min，2%冰醋酸水溶液浸1 min，1%磷鉬酸水溶液分化4 min，苯胺藍(lán)染5 min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗2 min，常規(guī)用95%酒精，純酒精，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

1.6 HE 染色觀察

標(biāo)本放入40 g/L 多聚甲醛溶液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明及浸蠟和包蠟。切下的標(biāo)本展開(kāi)、烤片、脫蠟，然后脫二甲苯，梯度乙醇脫水，染色后，再次梯度乙醇脫水，完成二甲苯透明后封固，最后蘇木精-伊紅染色。

1.7 電子顯微鏡觀察

組織用0.1 mol/L pH7.4 的二甲砷酸鈉緩沖液配制的2.5%戊二醛在4 ℃固定2 h 在0.1 mol/L pH7.4 的二甲砷酸鈉緩沖液洗3 次，再放入用相同緩沖液配制的1% 鋨酸中固定2 h。標(biāo)本投入到30%、50%、70%的乙醇中，在4 ℃條件下各10 min。然后再投入到80%、90%、95%的丙酮中各10 min，100%的丙酮中2 次，每次10 min。標(biāo)本由100%丙酮中移入裝有混勻包埋劑的膠囊中，在30 ℃下震蕩4 h。然后置于35 ℃、45 ℃、60 ℃溫箱中各24 h，使包埋劑聚合，硬化，由流體變?yōu)榫鶆虻墓腆w。然后再切片機(jī)上切片，用銅網(wǎng)收集所得切片，在電子顯微鏡下觀察。

1.8 RT-PCR 檢測(cè)EGF 基因表達(dá)

RT—PCR 總 RNA 提 取 及 逆 轉(zhuǎn) 錄:按 照RNAprep Pure Tissue Kit DP431 試劑盒(北京TIANGEN)、大連TaKaRa 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒和說(shuō)明書(shū)獲得EGFmRNA 的反轉(zhuǎn)錄DNA。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃變性5 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s;72 ℃延伸60 s;重復(fù)變性、退火、延伸，共35 個(gè)循環(huán)，充分延伸，72 ℃、10 min，結(jié)束溫度為4 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物分析:取5 微升產(chǎn)物在80V 電壓下經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳40 min，利用凝膠成像系統(tǒng)(UVP)觀察、拍照，并用Gel-Pro analyzer 4.0 軟件進(jìn)行灰度分析(以β - actin 為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增。β - actin 及bFGF PCR 引物序列見(jiàn)表1)。

表1 引物序列Tab 1 The sequence of primer

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

樣本統(tǒng)計(jì)量采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0 軟件。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較前先對(duì)樣本資料做正態(tài)分布檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，符合條件后做成組設(shè)計(jì)兩樣本t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為雙側(cè)t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面愈合率

A 組愈合迅速，創(chuàng)面完全上皮覆蓋所需平均天數(shù)為12 d，潰瘍愈合率為78%;B 組愈合緩慢，至20 d 時(shí)仍未完全上皮覆蓋，潰瘍愈合率僅為35%。見(jiàn)圖1。

2.2 Masson 染色及HE 染色

各組病理切片觀察結(jié)果:第15 天可見(jiàn)A 組肉芽生長(zhǎng)迅速，大量成纖維細(xì)胞聚集成群，輪廓較清晰;細(xì)胞外基質(zhì)豐富，膠原纖維束排列密集而有序，可見(jiàn)大量血管生成，組織分層愈合良好。B 組愈合緩慢，膠原纖維稀疏，組織結(jié)構(gòu)不明顯。見(jiàn)圖2、圖3。

2.3 兩組創(chuàng)面組織電鏡觀察

第15 天A 組大體觀細(xì)胞排列整齊、有序，其中成纖維細(xì)胞數(shù)目明顯較多，形狀完好，體積較大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富。而且細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)大量膠原纖維整齊有序的排列。B 組成纖維細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)容物少，周?chē)z原纖維稀疏，排列混亂。見(jiàn)圖4。

2.4 兩組EGF mRNA 比較

A 組EGFmRNA 灰度相對(duì)值大于B 組，差異具有顯著性意義，P ＜0.01。見(jiàn)圖5、表2。

圖1 兩組第15 天創(chuàng)面愈合情況Fig 1 The situation of wound healing after 15 days in two groups

圖2 兩組第15 天Masson 染色觀察創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)(×40)Fig 2 The observation of wound in Masson trichrome staining after 15 days in two groups of wound(×40)

圖3 兩組第15 天HE 染色觀察創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)(×40)Fig 3 The observation of wound in HE trichrome staining after 15 days in two groups of wound(×40)

圖4 兩組第15 天透射電鏡結(jié)果(×15 000)Fig 4 The results of wound observed in electron microscope after 15 days in two groups (×15 000)

圖5 兩組EGFmRNA 灰度對(duì)比Fig 5 Two gray contrast EGFmRNA

表2 兩組EGFmRNA 相對(duì)灰度比值Tab 2 Ratio of EGFmRNA relative gray in two group

3 討 論

國(guó)際糖尿病工作組(WGDF)將糖尿病足病定義為:糖尿病患者踝以下累計(jì)全層皮膚的創(chuàng)面，而與這種創(chuàng)面的病程無(wú)關(guān)的與局部神經(jīng)異常和下肢遠(yuǎn)端外周血管病變相關(guān)的足部感染、潰瘍和/或深層組織破壞的一種病變［4-5］。

糖尿病足部潰瘍難愈合甚至不愈合的原因及機(jī)理目前仍然不清楚。己知與糖尿病血糖控制不佳、創(chuàng)面細(xì)胞、神經(jīng)末梢脫髓鞘、難治性感染、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子和相應(yīng)受體的相對(duì)和絕對(duì)缺乏、血管因素等有關(guān)［6］。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是促進(jìn)創(chuàng)面?zhèn)谟系闹匾L(zhǎng)因子之一，而且是第一個(gè)被用來(lái)研究創(chuàng)面愈合的生長(zhǎng)因子［7］。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的研究不斷開(kāi)展，細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)，表皮生長(zhǎng)因子有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)糖酵解的功能，更為重要的是對(duì)表皮細(xì)胞DNA、RNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有刺激作用，對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯合成也有一些刺激作用［8］。EGF 可以誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞和纖維母細(xì)胞增生、使角質(zhì)層增厚、刺激周?chē)窠?jīng)再生［2-3，6］。EGF 不僅參與細(xì)胞增殖、遷移和分化功能的調(diào)節(jié)，而且是有效的促細(xì)胞分離原［9-11］。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)對(duì)表皮細(xì)胞DNA、RNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有刺激作用，對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯合成也有一些具有刺激作用［12］。同時(shí)，EGF有明顯的趨向活性，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞向創(chuàng)面部位移動(dòng)、改善創(chuàng)面微環(huán)境和組織營(yíng)養(yǎng)狀態(tài);EGF 還能刺激纖維結(jié)合素的產(chǎn)生以及通過(guò)增加創(chuàng)面局部成纖維細(xì)胞的數(shù)量來(lái)促進(jìn)皮膚的增生［13］。2009年有一項(xiàng)多中心、雙盲實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)是以安慰劑為對(duì)照組，評(píng)價(jià)了對(duì)瓦格納分級(jí)為3 ～4 級(jí)DFU 患者對(duì)局部注射rhEGF的療效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為同因素不同水平的實(shí)驗(yàn)組與安慰劑的對(duì)照組比較P ＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［14］。本實(shí)驗(yàn)光鏡下可見(jiàn)表皮生長(zhǎng)因子組肉芽生長(zhǎng)迅速，大量成纖維細(xì)胞聚集成群，輪廓較清晰;細(xì)胞外基質(zhì)豐富，膠原纖維束排列密集而有序，可見(jiàn)大量血管生成，組織分層愈合良好。對(duì)照組愈合緩慢，膠原纖維稀疏，組織結(jié)構(gòu)不明顯。電鏡下的結(jié)果顯示表皮生長(zhǎng)因子組成纖維細(xì)胞體積大，形態(tài)完好，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富。細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)大量膠原纖維，排列整齊、有序。糖尿病對(duì)照組成纖維細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)容物少，周?chē)z原纖維稀疏，排列混亂。A 組愈合迅速，創(chuàng)面完全上皮覆蓋所需平均天數(shù)為12 d，潰瘍愈合率為78%;B 組愈合緩慢，至20 d 時(shí)仍未完全上皮覆蓋，潰瘍愈合率僅為35%。本實(shí)驗(yàn)研究初步表明，表皮生長(zhǎng)因子干預(yù)的糖尿病足模型組，肉芽生長(zhǎng)迅速、大量成纖維細(xì)胞聚集成群;細(xì)胞外基質(zhì)豐富、膠原纖維束排列密集而有序、可見(jiàn)大量血管生成、組織分層愈合良好，而對(duì)照組未見(jiàn)。提示表皮生長(zhǎng)因子在糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合過(guò)程中具有積極作用［15-16］。

糖尿病足潰瘍面難愈合的一個(gè)重要因素就是糖尿病足創(chuàng)面的組織和細(xì)胞生長(zhǎng)因子(GF)及其受體相對(duì)或絕對(duì)缺乏，實(shí)驗(yàn)證明可以顯著提高潰瘍愈合率的方法之一就是局部運(yùn)用有活性的生長(zhǎng)因子(GF)［9］，例如表皮生長(zhǎng)因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，胰島素樣生長(zhǎng)因子等。EGF 主要是由血小板、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞所分泌［17］，受體結(jié)合分析表明，大部分細(xì)胞表面都含有EGF 的受體蛋白［18］。血小板、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌的EGF 和表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞膜相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合，主要參與細(xì)胞的增殖、遷移和分化功能的調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EGF 在臨床上有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果，但是其作用機(jī)理在分子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)EGFmRNA分析的結(jié)果，A 組EGFmRNA 的灰度相對(duì)值為109.31 ±5. 17;B 組EGFmRNA 的灰度相對(duì)值為61.59 ±4.61。兩樣本數(shù)據(jù)都符合正態(tài)分布且方差齊性，差異有顯著性意義(P ＜0.01)。實(shí)驗(yàn)初步說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的內(nèi)源性EGF 的表達(dá)高于對(duì)照組內(nèi)源性EGF 的表達(dá)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)因素是和觀察指標(biāo)(內(nèi)源性EGFmRNA)相關(guān)的。可能的原理為外源性EGF 可能促進(jìn)了內(nèi)源性EGF 的表達(dá)，其上調(diào)了局部EGF基因的表達(dá)［19-20］。這種假設(shè)需要做進(jìn)一步的單因素多水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)后回歸分析。外源性的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)可以促進(jìn)EGFmRNA 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，EGFmRNA 更好地得到基因表達(dá)，從而刺激組織分泌EGF，分泌的EGF 和表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞膜相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合，主要參與細(xì)胞的增殖、遷移和分化功能的調(diào)節(jié)。完成膠原組織構(gòu)建，加速創(chuàng)面肉芽組織生成和上皮組織的形成，加速創(chuàng)面愈合速度，達(dá)到創(chuàng)面愈合質(zhì)量［14，19-20］。

表皮生長(zhǎng)因子在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面已經(jīng)顯示出了積極的作用。但是，此外EGF 的應(yīng)用還有需要解決的問(wèn)題，比如用藥劑量和方法［21］，創(chuàng)面的評(píng)估和如何清創(chuàng)，會(huì)不會(huì)誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生等。在有效的控制血糖的基礎(chǔ)上，需要客觀的分析，運(yùn)用“創(chuàng)面床準(zhǔn)備(wound bed preparation，wbp)”理論，對(duì)創(chuàng)面的形成時(shí)間長(zhǎng)短不同、創(chuàng)面大小及潰瘍程度不同、不同階段實(shí)施不同的干預(yù)會(huì)收到更好的治療效果［22］。外源性EGF 是如何促進(jìn)內(nèi)源性EGF 表達(dá)的，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑需要進(jìn)一步探究。外源性GF 半衰期短，局部使用之后很快被稀釋和降解，需反復(fù)大量使用，且價(jià)格昂貴。

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