許穎原，陳 毅

上海銘源數(shù)康生物芯電有限公司，上海市，201403

新型磁珠分選純化儀的研制

【作 者】許穎原，陳 毅

上海銘源數(shù)康生物芯電有限公司，上海市，201403

該文介紹了一種新型磁珠分選純化儀的研制。該儀器的研制目的是從痰液中捕獲結(jié)核菌，是用于臨床標(biāo)本前處理的自動(dòng)化儀器，為臨床輔助診斷結(jié)核病提供新一代的技術(shù)平臺(tái)。該儀器功能齊全，不僅可以用于結(jié)核菌的分選，還能夠用于基因、蛋白、細(xì)胞等物質(zhì)的分選純化，應(yīng)用范圍極廣。該儀器采用了16位單片機(jī)作為控制核心，在確保各項(xiàng)功能和儀器可靠性的前提下，使儀器硬件成本大大下降，便于在國(guó)內(nèi)推廣應(yīng)用。

免疫磁珠；分選；純化；單片機(jī)

0 前言

本項(xiàng)目是國(guó)家“十一五”科技重大專(zhuān)項(xiàng)“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”中的一個(gè)子項(xiàng)目，儀器研制的目的是從痰液中捕獲微量的結(jié)核菌，從而為醫(yī)生的臨床診斷提供一個(gè)高效、準(zhǔn)確的技術(shù)平臺(tái)。

目前結(jié)核菌的檢測(cè)方法主要有：傳統(tǒng)的涂片抗酸染色鏡檢法和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），前者敏感性低，后者易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性[1]。為了解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)大量的調(diào)研和對(duì)比，最終確定采用免疫磁珠分離技術(shù)來(lái)捕獲痰液中的結(jié)核菌。

免疫磁珠是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)，它將固化試劑特有的優(yōu)點(diǎn)與免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性結(jié)合于一體，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，滲透到病理、生理、藥理、微生物、生化以及分子遺傳學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，其在免疫檢測(cè)、細(xì)胞分離、生物大分子純化和分子生物學(xué)等方面得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。例如：將免疫磁珠應(yīng)用于T細(xì)胞的分離純化[2]以及將磁珠分離技術(shù)應(yīng)用于DNA的提取[3]。

隨著免疫磁珠分離純化技術(shù)的發(fā)展，各種自動(dòng)化磁珠分選純化儀也應(yīng)運(yùn)而生，目前世界上比較知名的生產(chǎn)商有：美國(guó)賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific），德國(guó)美天旎生物技術(shù)公司等，國(guó)內(nèi)也有一些公司生產(chǎn)類(lèi)似的產(chǎn)品，但主要集中在小通量的儀器上，而且處理樣品的工作體積都比較小，最大工作體積一般都不超過(guò)2 mL。而要從痰液中捕獲結(jié)核菌，要求工作體積不少于5 mL，所以目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)有產(chǎn)品無(wú)法滿(mǎn)足需要。美國(guó)賽默飛世爾科技公司的KingFisher Flex全自動(dòng)磁珠純化儀雖然能夠滿(mǎn)足要求，但是產(chǎn)品價(jià)格過(guò)于昂貴，我們鑒于條件限制，自主研發(fā)新型的磁珠分選純化儀，并獲得醫(yī)療器械注冊(cè)證，通過(guò)項(xiàng)目的驗(yàn)收。

1 工作原理

1.1 免疫磁珠的工作原理

免疫磁珠是一種包被有單克隆抗體的磁性微粒,它可特異性地與靶物質(zhì)(細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA 和細(xì)菌等) 結(jié)合，使之具有磁順應(yīng)性，繼而在外加磁場(chǎng)的作用下被滯留，從而與其他成分分離，達(dá)到富集純化的目的。其工作過(guò)程如圖1所示。

1.2 磁珠分選純化儀的工作原理

根據(jù)免疫磁珠的工作原理，可以設(shè)計(jì)出分離（如圖2所示）和濃縮（如圖3所示）的工作過(guò)程。

圖1 免疫磁珠工作原理示意圖Fig.1 The diagram of immunomagnetic beads operating

圖2 磁珠分選純化儀分離過(guò)程Fig.2 The process of separating

圖3 磁珠分選純化儀濃縮過(guò)程Fig.3 The process of concentration

在實(shí)際操作中，可以根據(jù)需要進(jìn)行1～4次清洗，因此新型磁珠分選純化儀在樣品盤(pán)上設(shè)計(jì)了8個(gè)板位用于放置試劑和磁頭套等，可以滿(mǎn)足用戶(hù)的不同需要。

2 技術(shù)方案

2.1 工作流程

2.1.1 工作程序設(shè)置

步驟數(shù)量設(shè)置 從痰液樣品中提取磁珠、清洗和洗脫，每個(gè)動(dòng)作算一個(gè)步驟；在本儀器中，清洗最多可以進(jìn)行4次。在儀器的設(shè)計(jì)中，為了簡(jiǎn)化操作，每個(gè)工作程序都具有的動(dòng)作不需要用戶(hù)設(shè)置，例如：抓取磁頭套、提取原液中的磁珠、將磁珠放入痰液樣品和磁珠還原等。

設(shè)置板位號(hào) 設(shè)置樣品盤(pán)上每個(gè)位置的用途；例如：1號(hào)位為放置磁頭套，2號(hào)位為磁珠原液，3號(hào)位為痰液樣品，4～7號(hào)位為清洗液，8號(hào)位為洗脫液。

設(shè)置孵育參數(shù) 如果需要對(duì)磁珠和痰液的混合物進(jìn)行加熱孵育時(shí)，就需要設(shè)置加熱孵育的板位號(hào)和加熱溫度；例如：痰液樣品在3號(hào)位，可以將3號(hào)位設(shè)置為加熱孵育位置，同時(shí)設(shè)置加熱的溫度，通常為37oC。在這臺(tái)儀器上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)板位進(jìn)行加熱孵育。

2.1.2 放置試劑

按照工作程序設(shè)置的板位號(hào)，放置相應(yīng)的試劑和物品。

2.1.3 開(kāi)始工作

(1) 自動(dòng)抓取磁頭套 樣品盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)到放置磁頭套的板位，磁頭向下移動(dòng)，到合適位置后，自動(dòng)鎖定磁頭套，然后磁頭和磁頭套同步向上移動(dòng)，完成抓取。

(2) 提取磁珠 樣品盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)到磁珠原液的放置位置，磁頭和磁頭套同步下移，進(jìn)入磁珠原液，停留一段時(shí)間后，同步上移，完成磁珠提取。

(3) 磁珠放入痰液樣品 樣品盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)到痰液樣品位置，磁頭和磁頭套同步下移，浸入痰液樣品，然后磁頭單獨(dú)上移，磁頭套上下振蕩，使磁珠與痰液樣品均勻混合。如果選擇了孵育功能，這時(shí)加熱平臺(tái)上升，開(kāi)始進(jìn)行加熱孵育。

(4) 清洗 完成孵育后，磁頭套首先上升與磁頭結(jié)合，然后同步下移浸入痰液樣品，完成磁珠吸取后，磁頭與磁頭套同步上升。樣品盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)到清洗液位置，磁頭和磁頭套同步下移，浸入清洗液中。磁頭再次上升，而磁頭套在清洗液中上下振蕩，將磁珠與清洗液充分混合。

(5) 洗脫 清洗完成后，磁頭套上升與磁頭結(jié)合，然后同步下降浸入清洗液中吸取磁珠，完成后同步上升。樣品盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)到洗脫液位置，磁頭和磁頭套同步下降，浸入洗脫液后，磁頭再次上升，磁頭套在洗脫液中上下振蕩，完成洗脫過(guò)程。

(6) 磁珠還原 洗脫完成后，磁頭套上升與磁頭結(jié)合，然后同步下移浸入洗脫液提取磁珠，完成后同步上升。樣品盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)到磁珠原液位置，磁頭和磁頭套同步下移，浸入磁珠原液后，磁頭上移，磁頭套在磁珠

原液中上下振蕩，將磁珠釋放在磁珠原液中，然后磁頭套上升。

(7) 程序完成 當(dāng)磁珠還原完成后，樣品盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)到磁頭套位置，磁頭套單獨(dú)下降，到達(dá)指定位置后，松開(kāi)磁頭套。然后樣品盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)，將洗脫液轉(zhuǎn)動(dòng)到出口處，完成整個(gè)工作流程。

2.2 儀器的設(shè)計(jì)

本項(xiàng)目采取了核心技術(shù)自主研發(fā)，部分配件外購(gòu)的策略進(jìn)行。儀器的主要部分：電氣控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)加工、機(jī)械運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)加工和軟件設(shè)計(jì)均自主研發(fā)完成。磁頭、磁頭套和試劑板從美國(guó)賽默飛世爾科技公司采購(gòu)。采用這種方案，不僅使得項(xiàng)目能夠在一年半的時(shí)間內(nèi)完成，而且儀器的硬件成本大大低于進(jìn)口設(shè)備的售價(jià)，如果批量生產(chǎn)，硬件成本有望進(jìn)一步降低。儀器的外形如圖4所示：

圖4 新型磁珠分選純化儀的外形Fig.4 The appearance of the instrument

新型磁珠分選純化儀的主要功能是按照設(shè)定程序運(yùn)行，因此控制核心采用的是16位單片機(jī)，實(shí)際證明單片機(jī)控制系統(tǒng)就能夠滿(mǎn)足要求。

美國(guó)賽默飛世爾科技公司的KingFisher Flex全自動(dòng)磁珠純化儀的工作程序設(shè)置需要外接電腦來(lái)完成。為了方便用戶(hù)的使用，新型磁珠分選純化儀使用了5.6英寸液晶觸摸顯示器，使得用戶(hù)能夠直接在儀器上完成程序的編制。并且界面全部漢化，大大方便了國(guó)內(nèi)用戶(hù)的使用。

在整個(gè)儀器中，最重要的應(yīng)該是對(duì)于樣品盤(pán)的控制和位置測(cè)量。由于樣品盤(pán)需要放置8塊試劑板，每塊試劑板的長(zhǎng)寬為(127.8×85.4) mm2，所以樣品盤(pán)的直徑設(shè)計(jì)為500 mm。而樣品盤(pán)位置的準(zhǔn)確性將直接影響儀器工作的可靠性，如果樣品盤(pán)位置誤差過(guò)大，將造成磁頭無(wú)法準(zhǔn)確插入試劑板內(nèi)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)p壞磁頭，使磁棒斷裂。為了準(zhǔn)確控制樣品盤(pán)的位置，設(shè)計(jì)中在樣品盤(pán)下方安裝了旋轉(zhuǎn)編碼器，它每圈產(chǎn)生1 000個(gè)脈沖。為了防止主CPU無(wú)法準(zhǔn)確采集旋轉(zhuǎn)編碼器的脈沖信號(hào)，專(zhuān)門(mén)采用了一個(gè)輔助單片機(jī)對(duì)旋轉(zhuǎn)編碼器的信號(hào)進(jìn)行采集和處理，并控制樣品盤(pán)的轉(zhuǎn)動(dòng)。除此之外，還在樣品盤(pán)上設(shè)計(jì)了一個(gè)零位傳感器，每當(dāng)樣品盤(pán)旋轉(zhuǎn)通過(guò)這個(gè)傳感器時(shí)，計(jì)數(shù)單片機(jī)就會(huì)對(duì)計(jì)數(shù)值清零，避免產(chǎn)生累計(jì)誤差。通過(guò)這些手段，使得樣品盤(pán)的角度誤差小于0.3o，確保了磁頭和磁頭套能夠準(zhǔn)確插入試劑板。圖5為儀器電氣控制系統(tǒng)示意圖。

圖5 控制系統(tǒng)示意圖Fig.5 The diagram of the control system

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)努力，終于在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成了本項(xiàng)目，并且獲得國(guó)家醫(yī)療器械注冊(cè)證。新型磁珠分選純化儀的主要性能指標(biāo)與進(jìn)口儀器相當(dāng)，單步的磁珠回收率不低于98%。同時(shí)，自主研發(fā)大大降低了儀器的成本，便于今后的推廣應(yīng)用。

[1] 鄭玉群. 免疫磁珠分離聯(lián)合涂片、PCR法檢測(cè)痰內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的方法學(xué)研究與評(píng)價(jià)[D]. 東南大學(xué), 2010.

[2] 楊曌, 傅曉嵐, 尚小云. 免疫磁珠負(fù)性分離純化小鼠脾臟CD8^＋T細(xì)胞[J]. 免疫學(xué)雜志, 2007, 23(1): 91-93.

[3] 高秋月, 景奉香, 李海燕. 基于磁珠的細(xì)菌基因組DNA快速提取方法[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(21): 11071-11074.

Development of New Magnetic Bead Separation and Purif i cation lnstrument

【 Writers 】Xu Yingyuan, Chen Yi
SHMY Healthdigit Biochips Co. Ltd., Shanghai, 201403

【 Abstract 】The article describes the development of new magnetic bead separation and purification instrument. The main application of the instrument is to capture tubercle bacillus from sputum. It is a pretreatment instrument and provides a new platform to help doctors to diagnose bacillary phthisis. Not only could it be used for tubercle bacillus capturing, but also for gene, protein and cell separating and puri fi cation. Because the controller of the instrument is 16-bit single chip microcomputer, the cost could be greatly reduced and it will be widely used in China.

immunomagnetic beads, separation, puri fi cation, single chip microcomputer

R185

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2014.03.011

2013-11-24

國(guó)家“十一五”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2008ZX-10003-001）

許穎原，E-mail: xuyingyuan@hotmail.com

1671-7104(2014)02-0199-03