黃雨洋，王振宇

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江糧食職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150080；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

紅松樹皮多酚的提取工藝及其抗氧化活性的研究

黃雨洋1，2，王振宇1，3，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江糧食職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150080；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

采用酶解預(yù)處理結(jié)合乙醇浸提法提取紅松樹皮多酚化合物，并對其抗氧化活性進(jìn)行了研究。以多酚得率和羥自由基清除率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對紅松樹皮多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)提取工藝為：加酶量116.70U/g，酶解時(shí)間2.60h，酶解溫度53.00℃，乙醇添加量49.30%。在該最優(yōu)提取條件下多酚得率和羥自由基清除率的分別高達(dá)11.84%和76.91%。應(yīng)用電子自旋共振（ESR）法測定抗氧化活性，多酚提取物對羥自由基的清除能力隨加入濃度的增加而增加，表明高濃度多酚提取物會提高其抗氧化活性。

紅松樹皮，多酚，提取，抗氧化活性

紅松（Pinus koraiensis），亦稱果松、海松。常綠喬木，高達(dá)40m。葉五針一束，長6～12cm。分布于我國東北長白山到小興安嶺地區(qū)，常與魚鱗松、紅皮云杉等組成混交林，是重要的農(nóng)林資源，其果實(shí)紅松種子以其顆粒飽滿，營養(yǎng)豐富而聞名，自古就是食療佳品，具有較高的藥用價(jià)值及保健功能。研究表明，松屬植物中含有萜類、多酚類、生物堿等多種生物活性成分[1]，具有抗氧化[2-3]、抗腫瘤及抗菌等生物活性[4-5]。其中多酚類成分是重要的抗氧化劑，具有很大的開發(fā)潛力。自由基大量積累會導(dǎo)致多種疾病，如動脈硬化、癌癥[6-7]、心臟病、糖尿病等。近年來，天然抗氧化劑的研究備受關(guān)注，其中多酚類是主要的抗氧化活性成分之一。多酚類抗氧化成分可以清除自由基，防治過氧化引起的多種疾病[8]。

自由基是含有一個(gè)或多個(gè)不對稱電子的原子，分子或離子。生物體內(nèi)的自由基種類繁多，以活性氧為主，其中包括超氧陰離子，過氧化氫，羥自由基及單線態(tài)氧[9-10]。自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)引起的膜脂質(zhì)氧化性損傷是導(dǎo)致人體衰老和某些疾病的重要因素[11]，如癌癥、白內(nèi)障、心血管疾病等。另外，許多研究表明一些天然抗氧化劑可以作自由基清除劑[12]。因此，這些天然高效的食品抗氧化劑與人類健康的關(guān)系是研究的熱點(diǎn)[13]。近年有研究表明，紅松多酚具有抗氧化和清除自由基的作用[14]，但用電子自旋共振（ESR）技術(shù)直接檢測其清除效能尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用酶解預(yù)處理結(jié)合乙醇浸提法提取紅松樹皮多酚化合物，應(yīng)用電子自旋共振（ESR）分析法測定多酚化合物的抗氧化活性，探究不同提取工藝條件對多酚得率和抗氧化性的影響，并對紅松樹皮多酚化合物的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為進(jìn)一步開發(fā)此天然抗氧化劑資源用于研制防治癌癥及心血管疾病的新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松樹皮 收集于黑龍江省伊春；纖維素酶（30u/mg） 廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；電子捕獲劑DMPO Sigma公司；福林試劑 天津華特化研科技有限公司；沒食子酸、碳酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、無水乙醇 均為國產(chǎn)分析純。

高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器公司；恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療電子儀器廠；酸度計(jì) 上海大中分析儀器廠；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用公司；R-205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝儀器公司；電子天平 西安興成智儀器；E R 200D SRC ESR光譜測定儀 德國布魯克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 紅松樹皮→40℃條件下烘干→粉碎后過40目篩→準(zhǔn)確稱取5.0g松殼粗粉于四頸中加入酶液→在不同酶解條件下（加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度）進(jìn)行酶解處理→加入濃度為95%的乙醇溶液→水浴振蕩浸提→4000r/min離心取上清液→測定多酚含量。

1.2.2 紅松樹皮多酚提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 固定加酶量為120U/g、酶解時(shí)間為2h、酶解溫度為50℃、乙醇添加量為50%，在其他條件不變的條件下，以多酚得率（%）和羥自由基清除率（%）為指標(biāo)，選取加酶量為60、90、120、150、180U/g，酶解時(shí)間為1、1.5、2、2.5、3h，酶解溫度為30、40、50、60、70℃，乙醇添加量為30%、40%、50%、60%、70%，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行。

1.2.3 紅松樹皮多酚提取工藝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 采用響應(yīng)曲面分析法對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，利用Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程優(yōu)化，以多酚得率R1（%）和羥自由基清除率R2（%）為響應(yīng)值，選擇加酶量A（U/g）、酶解時(shí)間B（h）、酶解溫度C（℃）和乙醇添加量D（%）為影響因素，每個(gè)因素設(shè)定5個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表Table.1 Encode Table.of factors and levels

1.2.4 紅松樹皮多酚得率的測定 采用福林酚法測定提取液中多酚含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)對照品，精確量取100μg/mL的沒食子酸溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL置于10mL比色管中，加蒸餾水至2mL，搖勻后加1.0mL福林酚試劑，4min后加入1.0mL 10%的碳酸鈉溶液，25℃水浴下保持2h后測定溶液在765nm處的吸光值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，y= 0.0534x+0.1529，式中，x表示多酚含量（mg/g干重）；y表示吸光度。

準(zhǔn)確吸取適量體積的紅松樹皮提取液1mL于10mL比色管中，加蒸餾水定容至2mL。加入1.0mL福林試劑后搖勻，4min后加入1.0mL10%碳酸鈉溶液，25℃水浴下保持2h后測定溶液在765nm處的吸光度值。將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中多酚類成分含量。

1.2.5 紅松樹皮多酚提取物清除羥自由基能力的測定 參照Rosen等的方法[15]。羥基自由基由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生。加入25μmol/L的硫酸亞鐵50μL，樣品50μL（空白用水），蒸餾水170μL，濃度為300mmol/L的DMPO 33μL，雙氧水200μmol/L，100μL。將反應(yīng)體系吸入密封的毛細(xì)管中。2.5min后用E R 200D SRC ESR光譜儀記錄ESR圖譜。測定條件如下：中心場強(qiáng)為3000G，掃描寬度為100G，微波頻率為9.858GHz，功率為2.25mW。

松多酚對羥基自由基的清除作用以清除率（%）表示，計(jì)算公式為：

式中：HX和H0分別為不同濃度松多酚和不添加多酚物質(zhì)的ESR圖譜第二峰信號強(qiáng)度（高度）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)的整理采用Microsoft Excel（Office 2003）和Origin8.5完成；采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用Design-Expert中心組合及混合中心設(shè)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 加酶量對多酚得率和羥自由基清除率的影響

圖1為加酶量對多酚得率和羥自由基清除率的影響。由圖1可知，隨著加酶量的增加，多酚得率和羥自由基清除率先逐漸增加，隨后保持平緩。當(dāng)加酶量為120U/g時(shí)，多酚得率和羥自由基清除率達(dá)到最佳，再繼續(xù)增加加酶量，多酚得率和羥自由基清除率沒有明顯變化。這可能是由于纖維素酶會破壞紅松樹皮的細(xì)胞壁，使更多的多酚物質(zhì)釋放，從而使多酚得率提高，而羥自由基清除率隨著多酚含量的增加而增加。綜合考慮，選取最佳加酶量為120U/g。

圖1 加酶量對多酚得率和羥自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzyme additive amount on the yield of polyphenols and free radical scavenging rate

2.1.2 酶解時(shí)間對多酚得率和羥自由基清除率的影響 圖2為酶解時(shí)間對多酚得率和羥自由基清除率的影響。由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長，多酚得率和羥自由基清除率先緩慢增加，再迅速增加，而后保持平緩。當(dāng)酶解時(shí)間為2.5h時(shí)，多酚得率和羥自由基清除率達(dá)到最高，再繼續(xù)延長酶解時(shí)間，多酚得率和羥自由基清除率沒有明顯變化。這可能是由于酶解達(dá)到一定時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)的多酚物質(zhì)幾乎全部釋放出來，再繼續(xù)延長酶解時(shí)間，對反應(yīng)沒有影響。綜合考慮，選取最佳酶解時(shí)間為2.5h。

圖2 酶解時(shí)間對多酚得率和羥自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of polyphenols and free radical scavenging rate

2.1.3 酶解溫度對多酚得率和羥自由基清除率的影響 圖3為酶解溫度對多酚得率和羥自由基清除率的影響。由圖3可知，隨著酶解溫度的增加，多酚得率和羥自由基清除率呈先增加后降低的趨勢。當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，多酚得率和羥自由基清除率達(dá)到最高，再繼續(xù)增加酶解溫度，多酚得率和羥自由基清除率反而下降。這可能是由于纖維素酶在其最適酶解溫度范圍內(nèi)有較高的酶解活性，超出最適范圍酶解能力下降，多酚得率和羥自由基清除率相應(yīng)降低。綜合考慮，選取最佳酶解溫度為50℃。

2.1.4 乙醇添加量對多酚得率和羥自由基清除率的影響 圖4為乙醇添加量對多酚得率和羥自由基清除率的影響。由圖4可知，隨著乙醇添加量的增加，多酚得率和羥自由基清除率呈先增加后降低的趨勢。當(dāng)乙醇添加量為50%時(shí)，多酚得率和羥自由基清除率達(dá)到最高，再繼續(xù)增加乙醇添加量，多酚得率和羥自由基清除率反而下降。這可能是由于乙醇添加量在適合的范圍內(nèi)，傳質(zhì)阻力小，多酚溶解性好，會使多酚得率和羥自由基清除率增加；而乙醇添加量過多會影響多酚得率和羥自由基清除率。綜合考慮，選取最佳乙醇添加量為50%。

圖3 酶解溫度對多酚得率和羥自由基清除率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of polyphenols and free radical scavenging rate

圖4 乙醇添加量對多酚得率和羥自由基清除率的影響Fig.4 Effect of ethanol additive amount on the yield of polyphenols and free radical scavenging rate

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法進(jìn)行過程優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert來完成。以加酶量A（U/g）、酶解時(shí)間B（h）、酶解溫度C（℃）和乙醇添加量D（%）分別代表的因素為自變量，以多酚得率R1（%）和羥自由基清除率R2（%）為響應(yīng)值，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)號1～24為析因?qū)嶒?yàn)，25～36為12個(gè)中心實(shí)驗(yàn)，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

多酚得率R1通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：

R1=11.98-0.15A+0.046B+0.060C+0.061D+0.083AB-0.0056AC+0.21AD+0.29BC-0.27BD+0.034CD-0.19A2-0.33B2-0.15C2-0.33D2

采用Design-Expert軟件對方程進(jìn)行方差分析，多酚得率R1的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），并且該模型R2=95.91%，R2Adj=93.19%，說明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為：A＞D＞C＞B，即加酶量＞乙醇添加量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。交互項(xiàng)AD、BC、BD交互作用顯著，其對多酚得率影響的響應(yīng)面分析見圖5。

羥自由基清除率R2通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：

R2=77.19-1.09A+0.23B+0.53C+0.38D+0.66AB-0.091AC+1.67AD+2.30BC-1.98BD+0.22CD-2.02A2-3.11B2-1.72C2-2.93D2

采用Design-Expert軟件對方程進(jìn)行方差分析，羥自由基清除率R2的方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），并且該模型R2=97.21%，R2Adj=95.35%，說明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為：A＞C＞D＞B，即加酶量＞酶解溫度＞乙醇添加量＞酶解時(shí)間。交互項(xiàng)AD、BC、BD交互作用顯著，其作用（顯著項(xiàng)）對羥自由基清除率影響的響應(yīng)面分析見圖6。

應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進(jìn)行分析，通過分析軟件Design-Expert尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果。當(dāng)加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度和乙醇添加量對應(yīng)的編碼值分別為-0.33、0.16、0.30和-0.07時(shí)，多酚得率和羥自由基清除率有最大值分別為12.03%和77.40%。紅松樹皮多酚最優(yōu)提取工藝為：加酶量116.70U/g，酶解時(shí)間2.60h，酶解溫度53.00℃，乙醇添加量49.30%。

表3 多酚得率的方差分析結(jié)果Table.3 Results of variance analysis for the yield of polyphenols

為了驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，在響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件下，即加酶量116.70U/g，酶解時(shí)間2.60h，酶解溫度53.00℃，乙醇添加量49.30%，進(jìn)行紅松樹皮多酚提取實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取平均值，在該最優(yōu)提取條件下多酚得率和羥自由基清除率的平均值分別為11.84%和76.91%，與預(yù)測值12.03%和77.40%較接近，可見該模型能較好地預(yù)測紅松樹皮多酚的提取情況，證明該實(shí)驗(yàn)參數(shù)準(zhǔn)確可靠。最終確定紅松樹皮多酚最優(yōu)提取工藝為：加酶量116.70U/g，酶解時(shí)間2.60h，酶解溫度53.00℃，乙醇添加量49.30%。

2.3 多酚提取物對羥自由基清除作用

多酚提取物具有一定的抗氧化活性，對很多自由基有一定的清除作用，包括羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、ABTS+自由基等[16]。其中羥自由基是最活潑的化學(xué)物質(zhì)之一，是己知最強(qiáng)的氧化劑，它幾乎可以和所有細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，對機(jī)體危害極大[17]。H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基能與DMPO形成加合物，該加合物的ESR圖的信號峰強(qiáng)度與羥自由基的濃度成正比。圖7為不同濃度多酚提取物對羥自由基清除作用的影響，由圖7可知，隨著多酚提取物濃度的增加，羥自由基清除率逐漸升高，但升高的速率逐漸減慢。這也就是說高濃度多酚提取物會提高其抗氧化活性，在保證高羥自由基清除作用的前提上，控制多酚提取物的濃度，對降低成本、節(jié)省資源具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

圖6 兩因素交互作用（顯著項(xiàng)）對羥自由基清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface for effect of two factor interactions（significant items）on free radical scavenging rate

圖7 不同濃度多酚提取物對羥自由基清除作用的影響Fig.7 Effect of different concentrations of polyphenols extractive on hydroxyl free radical scavenging

3 結(jié)論

本文對紅松樹皮多酚的提取工藝及其抗氧化活性進(jìn)行了研究，主要采用酶解預(yù)處理結(jié)合乙醇浸提法提取紅松樹皮多酚化合物。以多酚得率和羥自由基清除率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對紅松樹皮多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)提取工藝為：加酶量116.70U/g，酶解時(shí)間2.60h，酶解溫度53.00℃，乙醇添加量49.30%，在該最優(yōu)提取條件下多酚得率和羥自由基清除率的分別高達(dá)11.84%和76.91%。應(yīng)用電子自旋共振（ESR）法測定抗氧化活性，多酚提取物對羥自由基的清除能力隨加入濃度的增加而增加，表明高濃度多酚提取物會提高其抗氧化活性。

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Study on extraction of polyphenols of red pine bark and their antioxidant activity

HUANG Yu-yang1，2，WANG Zhen-yu1，3，*
（1.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Heilongjiang Grain Vocational College，Harbin 150080，China；3.College of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

The extraction of polyphenols compounds of red pine bark using enzymatic hydrolysis pretreatment combined with ethanol immersion extraction was researched.And antioxidant activity of polyphenols was also studied.Yield of polyphenols and hydroxyl free radical scavenging rate as indicators，on the basis of single factor experiment，technological parameters of extracting polyphenols were determined by response surface method to optimize extraction process conditions as following：enzyme additive amount 116.70U/g，enzymatic hydrolysis time 2.60h，enzymatic hydrolysis temperature 53.00℃，ethanol additive amount 49.30%.Under the condition of the extraction process，yield of polyphenols and hydroxyl free radical scavenging rate were 11.84% and 76.91%respectively.Electron spin resonance（ESR）assay was employed to evaluate the antioxidant activity of polyphenols.Hydroxyl free radical scavenging rate of polyphenols improved with the increase of adding polyphenols concentration，which indicated high concentrations of polyphenols could enhance their antioxidant activity.

red pine bark；polyphenols；extraction；antioxidant activity

TS201

A

1002-0306（2014）06-0171-07

2013－09－02 *通訊聯(lián)系人

黃雨洋（1979-），女，博士研究生，講師，研究方向：天然產(chǎn)物分離純化及功能性。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31170510）。